不同局部肿胀麻醉液对体外培养人脂肪干细胞增殖与成脂分化的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.50.006

摘要/Abstract

摘要：

背景：获取脂肪术中需要应用不同的局部肿胀麻醉液，其可能会对细胞生物特性产生一定的影响。
目的：探讨体外培养条件下不同局部肿胀麻醉液对人脂肪干细胞增殖与成脂分化的影响。
方法：取第3代人脂肪干细胞分别用布比卡因、罗哌卡因、利多卡因局部肿胀麻醉液进行培养，对照组用低糖DMEM培养基进行培养，检测各组干预不同时间人脂肪干细胞增殖活性、细胞上清乳酸脱氢酶活性和成脂分化比例。
结果与结论：不同局部肿胀麻醉液干预后1，2，3，4，5 d细胞上清乳酸脱氢酶活性值显著高于对照组(P < 0.05)，布比卡因组显著高于罗哌卡因组、利多卡因组(P < 0.05)。各局部肿胀麻醉液组细胞生长吸光度值均低于对照组(P < 0.05)，且布比卡因组显著低于罗哌卡因组、利多卡因组(P < 0.05)。各组人脂肪干细胞成脂分化比例差异无显著性意义(P > 0.05)。结果表明，局部肿胀麻醉液(布比卡因、罗哌卡因、利多卡因)均能够抑制人脂肪干细胞增殖，但不会对细胞成脂分化产生明显的影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 脂肪干细胞, 麻醉药, 局部肿胀麻醉液, 布比卡因, 罗哌卡因, 利多卡因, 细胞增殖, 细胞分化, 成脂分化

Abstract:

BACKGROUND: Different local anesthetic solutions for tumescent liposuction are necessary and have a certain effect on the biological characteristics of human adipose stem cells.
OBJECTIVE: To explore the effect of different tumescent local anesthesia on the proliferation and differentiation of human adipose stem cells cultured in vitro.
METHODS: Passage 3 human adipose stem cells were intervened by different tumescent local anesthesia (bupivacaine, ropivacaine, lidocaine). Cells cultured in low-glucose DMEM served as controls. Proliferation ability, lactate dehydrogenase activity in the supernatant and percentage of cells under adipogenic differentiation were detected.
RESULTS AND CONCLUSION: After intervention for 1, 2, 3, 4, 5 days, the supernatant lactate dehydrogenase activity in the bupivacaine, ropivacaine, lidocaine groups was significantly higher than that in the control group (P < 0.05), and moreover, the lactate dehydrogenase activity in the bupivacaine group was significantly higher than that in the ropivacaine group and lidocaine group (P < 0.05). The absorbance value of human adipose stem cells was lower in the bupivacaine, ropivacaine, lidocaine groups than the control group (P < 0.05) as well as lower in the bupivacaine group than the ropivacaine and lidocaine groups (P < 0.05). There was no significant difference in the percentage of cells under adipogenic differentiation between groups (P > 0.05). Overall, these findings indicate that different tumescent local anesthesia (bupivacaine, ropivacaine, lidocaine) can all inhibit the
proliferation of human adipose stem cells, but have no certain effects on the adipogenic differentiation.

中图分类号:

R394.2

王志刚，吴建萍，赵文香. 不同局部肿胀麻醉液对体外培养人脂肪干细胞增殖与成脂分化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(50): 8067-8071.

王志刚，吴建萍，赵文香. Effect of different tumescent local anesthesia on the proliferation and differentiation of human adipose stem cells cultured in vitro[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(50): 8067-8071.

图/表（结果） 4

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引言

材料方法

1.1 设计体外观察性实验。

1.2 时间及地点实验于2015年5至6月在滨州市人民医院实验室完成。

1.3 材料实验过程中使用的脂肪组织均来源于健康成人(18-48岁)抽脂手术，于无菌条件下妥善保存。患者均签署知情同意书，实验设计与步骤等均符合医学伦理学相关规定的要求，并经本院医学伦理部门审核、批准。

1.4 实验方法

1.4.1 人脂肪干细胞分离、培养与鉴定取出脂肪组织，去除纤维组织和小血管，将脂肪组织剪成小碎块，添加Ⅰ型胶原酶(北京沃比森科技有限公司)置于37 ℃恒温水浴箱中消化30 min。消化结束后过滤，收集滤过液，离心，添加5 mL含胎牛血清的DMEM培养液(上海信帆生物科技有限公司)制备细胞悬液。利用差速贴壁法对细胞进行纯化，待成纤维细胞贴壁生长之后，将悬浮液接种到6孔板中进行培养。2 d后首次换液，之后每3 d换液1次。观察细胞状态，待汇合达到85%左右时，添加胰酶(上海北诺生物科技有限公司)进行消化，然后传代培养。取第3代细胞进行流式鉴定，计算细胞表面抗原(CD45、CD34、CD105、CD90)阳性表达情况。

1.4.2 实验分组与局部肿胀麻醉液处理取第3代人脂肪干细胞，接种在24孔板中，随机分为4组，每组6孔，分别设为对照组和布比卡因组、利多卡因组、罗哌卡因组，置于37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱(上海三腾仪器有限公司)中进行培养，待细胞汇合达到80%左右的时候，弃去原DMEM培养基，添加含终质量浓度为200 mg/L布比卡因(上海朝晖药业有限公司)、利多卡因(江西青峰药业有限公司)、罗哌卡因(华中海威(北京)基因科技有限公司)的DMEM培养基，对照组添加入低糖DMEM培养基(与上述各组溶液保持同等pH值、渗透压)进行培养。

1.4.3 人脂肪干细胞上清液乳酸脱氢酶活性检测局部肿胀麻醉液干预后1，2，3，4，5 d，观察各孔的细胞生长状态，待贴壁生长之后添加乳酸脱氢酶试剂(海复昌科技有限公司)，利用全自动生化分析仪(上海旦鼎国际贸易有限公司)检测细胞上清液乳酸脱氢酶活性。

1.4.4 人脂肪干细胞生长增殖情况局部肿胀麻醉液干预后1-10 d，取各孔对数期细胞接种在培养板上，添加 20 μL 5 g/L MTT液(上海拓旸生物科技有限公司)进行孵育，孵育4 h之后弃去培养液，添加150 μL二甲基亚砜(上海华雅思创生物科技有限公司)，振荡后利用酶标仪(美国BioTek公司)检测吸光度值(490/630 nm)。

1.4.5 人脂肪干细胞成脂分化能力检测观察各组细胞生长情况，待细胞生长面积达到培养瓶底面积的70%-80%时，对照组孔中添加常规培养液，向局部肿胀麻醉液组各孔中添加等量的成脂诱导培养基(含胎牛血清、地塞米松、胰岛素、吲哚美辛、异丁基甲基黄嘌呤的DMEM培养基)。每3 d或4 d换液1次，连续培养21 d进行油红O染色，倒置显微镜(北京东胜创新生物科技有限公司)观察，每孔随机选择5个视野进行细胞计数，计算细胞总数中成脂分化细胞所占的比例。

1.5 主要观察指标 ①人脂肪干细胞形态。②人脂肪干细胞表面抗原表达。③人脂肪干细胞上清乳酸脱氢酶活性。④人脂肪干细胞生长增殖情况。⑤人脂肪干细胞成脂分化能力。

1.6 统计学分析使用SPSS 19.0软件进行处理分析。采用t 检验进行组间比较，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

随着干细胞理论与技术的不断发展，细胞疗法开始积极应用于各种组织缺损与疾病治疗^[5-6]。细胞疗法即将细胞通过局部注射或者手术植入等方式移植到患者体内，达到修复缺损、治疗疾病的目的^[7-8]。
脂肪干细胞取材简单，来源十分广泛，体外条件下具有良好的增殖能力^[9-10]，具有十分明显的应用优势^[11-12]。但是，在获得脂肪时，需要给予不同的局部肿胀麻醉液对患者进行局部麻醉^[13]。关于不同局部肿胀麻醉液对细胞增殖与分化的影响，相关的报道相对较少。Seherb等^[14]通过研究发现，在浓度较低的情况下，布比卡因即能够对纤维细胞产生影响，导致细胞增殖受到明显的抑制，影响创面修复效果。郭晓姝等^[15]通过贴壁法对大鼠骨髓间充质干细胞进行分离扩增，利用不同浓度罗哌卡因对细胞进行处理，细胞增殖以及迁移能力均会受到明显的抑制。
布比卡因、罗哌卡因、利多卡因是常用的局部肿胀麻醉液，被广泛应用于各种麻醉处理[^16-18]。本实验选择使用上述3种局部肿胀麻醉液对体外条件下培养的人脂肪干细胞进行干预。乳酸脱氢酶存在于组织细胞胞质之中，是一种糖酵解酶，与细胞死亡或者受到的毒性程度之间呈现出正相关关系^[19]。作为活细胞胞浆内含酶，乳酸脱氢酶可以较好的反映细胞的活性。当细胞处于正常状态的时候，乳酸脱氢酶无法透过细胞膜^[20-22]。如果细胞死亡或者受到毒性的影响，细胞膜的通透性发生变化，乳酸脱氢酶便可以透过细胞膜释放到介质中^[23-25]。实验结果显示，不同局部肿胀麻醉液干预后1，2，3，4，5 d细胞上清乳酸脱氢酶活性值显著高于对照组(P < 0.05)，布比卡因组显著高于罗哌卡因组、利多卡因组(P < 0.05)；罗哌卡因组、利多卡因组间比较，差异无显著性意义(P > 0.05)，表明局部肿胀麻醉液对脂肪干细胞有一定的毒性作用，细胞膜通透性发生改变，导致细胞上清乳酸脱氢酶活性显著上升。另外，实验结果还显示不同的局部肿胀麻醉液对细胞增殖也产生一定的影响，发挥出一定的抑制作用。分析出现上述结果的原因，可能与不同局部肿胀麻醉液对细胞周期以及线粒体功能等产生不同程度的影响所致^[16-29]。本研究各组人脂肪干细胞成脂分化比例差异无显著性意义(P > 0.05)，表明局部肿胀麻醉液不会对细胞的成脂分化产生明显的影响，关于其具体作用机制，还有待在今后予以进一步分析。另外，此次实验选择局部肿胀麻醉液的终质量浓度均为200 mg/L，但在实际的临床应用中，3种药物的有效质量浓度和作用半衰期均存在一定的差异。为此，还需要在今后的实验中进行进一步分析，明确不同药物的有效浓度。
综上所述，不同局部肿胀麻醉液(布比卡因、罗哌卡因、利多卡因)均能够抑制人脂肪干细胞增殖，但不会对细胞的成脂分化产生明显的影响。因此，在获取脂肪组织进行脂肪干细胞培养过程中，要注意合理的选择麻醉药物，以减少对脂肪干细胞的毒性作用，维持细胞正常的生物学特性。