乳腺癌干细胞分离及耐药蛋白分析

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.50.005

摘要/Abstract

摘要：

背景：乳腺癌干细胞是人体内相对比较特殊的细胞，该细胞具有自我更新以及多向分化能力，能够促进肿瘤的形成和发展，并且长期维持肿瘤生长。因此，分析并研究乳腺癌干细胞耐药蛋白的表达具有重要的意义。
目的：从人乳腺癌原代组织中分离乳腺癌干细胞，观察其分化及形态学特点，分析乳腺癌干细胞相关耐药蛋白的表达及意义。
方法：选取30例乳腺浸润性导管癌肿瘤组织标本，采用机械分离方法制作成不同的单细胞悬液，用免疫磁珠两步法分离出乳腺癌干细胞和乳腺癌分化细胞，采用免疫细胞化学二步法检测细胞耐药性蛋白的表达。
结果与结论：乳腺癌干细胞比例与患者的年龄、肿瘤的长径、淋巴结转移及组织学分级等差异不显著(P > 0.05)；乳腺癌干细胞P-gp、GST-π阳性表达率显著高于乳腺癌分化细胞(P < 0.05)；乳腺癌干细胞TopoⅡ、LRP阳性表达率显著低于乳腺癌分化细胞(P < 0.05)，与乳腺癌分化细胞相比，乳腺癌干细胞可通过高表达P-gp，GST-π，低表达TopoⅡ，LRP而具有更强的耐药性，可能是乳腺癌化疗耐药的关键原因。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 肿瘤干细胞, 乳腺癌干细胞, 分离方法, 形态学, 耐药蛋白

Abstract:

BACKGROUND: Breast cancer stem cells are relatively special cells in the body, which have the self-renewal and multi-differentiation ability to promote tumor formation and development, and maintain tumor growth for a long-term. Therefore, it is of great significance to analyze the expression of resistance proteins of breast cancer stem cells.
OBJECTIVE: To isolate breast cancer stem cells from human breast cancer tissues, to observe their differentiation and morphology characteristics and to analyze their resistance proteins.
METHODS: Thirty tumor samples of breast invasive ductal carcinoma were selected to separate single cell suspension using mechanical separation method, and breast cancer stem cells and differentiated cells were sorted with two-step immunomagnetic bead method. Two-step immunocytochemistry method was used to detect the expression of resistance proteins in breast cancer stem cells.
RESULTS AND CONCLUSION: Percentage of breast cancer stem cells had no significant correlations with age, long diameter of the tumor, lymph node metastasis and histological grading (P > 0.05). P-gp and GST-π positive rates in the breast cancer stem cells were significantly higher than those in the differentiated cells (P < 0.05); while TopoII and LRP positive rates in the breast cancer stem cells were significantly lower than those in the differentiated cells (P < 0.05). To conclude, breast cancer stem cells show stronger drug resistance than the differentiated cells by highly expressing P-gp and GST-π and lowly expressing TopoII and LRP, which may be the key reason for chemotherapy resistance in breast cancer.

中图分类号:

R394.2

郭锰，万里新. 乳腺癌干细胞分离及耐药蛋白分析[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(50): 8062-8066.

Guo Meng, Wan Li-xin. Breast cancer stem cells: separation and resistance protein analysis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(50): 8062-8066.

图/表（结果） 4

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引言

材料方法

1.1 设计细胞学体外观察实验。
1.2 时间及地点于2014年5月至2015年5月在新乡医学院第一附属医院完成。
1.3 材料
1.3.1 组织标本来源选取30例乳腺浸润性导管癌组织新鲜标本，均为女性，年龄32.5-82.3岁，平均年龄为(37.4±1.3)岁。经病理检查确诊，术前未经过放疗、化疗等其他方法治疗，入选患者及家属对实验目的以及实验方法等具有知情同意权，且自愿签署知情同意书。
1.3.2 主要试剂和仪器 1 mL链酶亲和素标记磁珠(上海百汇申生物技术有限公司)，25 μg Biotion anti-human CD24抗体、50 μg Biotion anti-human CD44抗体(国eBioscience公司)，PBS(北京中杉金桥生物技术有限公司)，离心制片机(北京中建卫普生物研究所)。
1.4 方法
1.4.1 单细胞悬液制备术中切取体积超过0.5 cm3的乳腺癌组织块，将表面的脂肪、坏死组织等去除干净，放于培养皿中，用生理盐水清洗两三次[10-11]。将上述处理好的组织放入培养皿中加入10 mL生理盐水进行浸泡，用眼科剪将组织剪碎，体积控制在1 mm3，过200目滤网，将得到的组织放在10 mL离心管中以2 000 r/min离心10 min，弃上清，沉淀加入10 mL生理盐水进行重悬，然后对悬液进行二次离心(500 r/min离心5 min)，加入10 mL生理盐水，沉淀后提取单细胞悬液，放置在4 ℃冰箱中待用[12]。
1.4.2 苏木精-伊红染色观察及细胞计数吸取乳腺癌单细胞悬液制作细胞涂片，进行苏木精-伊红染色，显微镜下观察细胞形态。将乳腺癌单细胞悬液滴至计数板上，加盖玻片置于显微镜下计数。
1.4.3 免疫磁珠分选 ①将离心管中的细胞悬液进行 2 000 r/min离心10 min，收集沉淀。②加入1 mL PBS，并将其转移到1 mL EP管中，将EP管中的单细胞悬液进行 2 000 r/min离心10 min，收集沉淀。③每106个细胞中加入0.25 μg CD24抗体，混合均匀，4 ℃下孵育30 min。④加入1 mL PBS洗涤，进行2 000 r/min离心10 min，收集沉淀。⑤加入10-20 μL链酶亲和素标记磁珠，加入1 mL PBS，混合均匀后4 ℃下孵育30 min，孵育过程中每5 min吹打1次。⑥阴性分选：将EP管放在磁力架中，在4 ℃下静置10 min，CD24+细胞紧紧贴附于管壁，缓慢将细胞悬液吸出转移到新的EP管中，将装有细胞悬液的EP管放置在磁力架上，反复2次，吸取液体至新EP管得CD24-细胞悬液，吸附于EP管壁的细胞即为实验所需要的CD24+细胞。⑦将CD24-细胞悬液进行2 000 r/min离心10 min，收集沉淀，并在每106个细胞中加入0.125 μg CD44抗体，4 ℃下孵育30 min。⑧加入1 mL PBS，2 000 r/min离心10 min，收集沉淀，加入10-20 μL链酶亲和素标记磁珠，加入1 mL PBS混合均匀后4 ℃下孵育30 min，孵育过程中每5 min吹打1次。⑨阳性分选：将EP管放在磁力架中，在4 ℃下静置10 min，CD44+细胞紧紧贴附于管壁，缓慢将细胞悬液吸出转移到新的EP管中，将装有细胞悬液的EP管放置在磁力架上，加入1 mL PBS静置10 min，反复2次，吸取液体至新EP管得CD44-CD24-细胞悬液，吸附于EP管壁的细胞即为实验所需要的乳腺癌干细胞(CD44+ CD24-/low细胞)。⑩将上述收集到的CD24+细胞和CD44-CD24-细胞转移至同一EP管中，即为乳腺癌分化细胞^[13-15]。
1.4.4 制备细胞涂片和苏木精-伊红染色观察将获得的乳腺癌干细胞和乳腺癌分化细胞放入计数板上，在显微镜下计数；采用离心机将两组细胞进行10 min离心，并将其制成的细胞涂片用体积分数为95%乙醇固定，并进行苏木精-伊红染色，观察细胞形态[16-17]。
1.4.5 乳腺癌干细胞耐药蛋白P-gp、GST-π以及LRP和TopoⅡ的表达将上述步骤获得的涂片采用免疫细胞化学Envision二步法检测乳腺癌干细胞耐药蛋白中相关蛋白表达^[18-19] 。
结果判定：P-gp阳性表达于细胞膜和细胞质；GST-π阳性表达于细胞质，极少数为细胞核着色；LRP阳性表达于细胞质；TopoⅡ阳性表达于细胞核。根据文献采用半定量积分法，标准如下：①阳性表达细胞数<10%为0分，阳性表达细胞数<10%-25%为1分，阳性表达细胞数<26%-50%视为2分，阳性表达细胞数>50%视为3分。②0分：无着色；1分：淡黄色；2分：棕黄色；3分：棕褐色。综合评分≤2分阴性，≥3阳性。
1.5 主要观察指标 ①乳腺癌干细胞单细胞悬液细胞计数。②乳腺癌干细胞单细胞悬液细胞形态。③乳腺癌干细胞比例和临床病理参数关系。④乳腺癌干细胞、乳腺癌分化细胞耐药蛋白表达。
1.6 统计学分析采用统计学软件SPSS 18.0进行数据处理和分析，计量资料以x(_)±s表示，采用t 检验比较，计数资料以率(%)表示，采用χ2检验比较，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

近年来，随着医疗技术的飞速发展，人们对于乳腺癌有了更加深刻的认识。研究表明，肿瘤患者体内存在一类特殊的细胞，细胞含量相对较低^[20]，具备自我更新、分化能力，它们能够维持和决定肿瘤的发生、发展情况^[21]。乳腺癌患者机体内同样存在一类特殊的干细胞，能够指导癌细胞的生长和转移^[22]。随着人们对干细胞研究的不断深入，人们对乳腺癌干细胞的分离也提出了很多方法，如表面标志分选、流式细胞仪侧群分选等^[23]。本研究结果显示，乳腺癌干细胞比例与患者年龄、肿瘤长径、淋巴结转移及组织学分级等差异不显著(P > 0.05)。
有实验验证CD44+ CD24-/low在乳腺癌患者中具备自我分化和更新的能力，能够发挥其干细胞功能^[24-25]。标志物CD44+ CD24-/low在研究过程中主要是基于实体肿瘤研究而发现的[26-27]。本研究中，乳腺癌干细胞P-gp阳性表达率为70%，显著高于分化细胞(P-gp阳性表达率为37%)；乳腺癌干细胞TopoⅡ阳性率为67%，显著高于分化细胞(TopoⅡ阳性率为40%)，差异均有显著性意义(P < 0.05)。在体外长期培养恶性肿瘤细胞中也存在少数能够维持肿瘤细胞生长以及恶性程度的干细胞^[28]。本研究中，将获得的细胞进行苏木精-伊红染色：细胞形态完整，细胞膜也比较清晰，细胞中存在少许碎片，纤维细胞或者纤维母细胞、淋巴细胞等不足10%，单细胞悬液制备成功。研究表现：①肿瘤细胞和其他细胞相比具有其特性，该细胞内不含有正常的干细胞，临床上可以将其作为肿瘤细胞的来源进行研究^[29]。②肿瘤细胞在生长和培养过程中能够保证肿瘤细胞敏感性较高，随着细胞的不断增长，乳腺癌细胞的数量和表型也会出现相应的变化^[30-31]。
大量研究显示：乳腺癌细胞雌激素受体、孕激素受体以及人类生长因子受体2的表达与乳腺癌内分泌治疗和生物靶向治疗关系密切，多种耐药基因，如：P-糖蛋白、谷胱甘肽S转移酶π等的表达与多药耐药关系密切，但是这些研究更多的基于乳腺癌，并未考虑乳腺癌干细胞在药物敏感性方面的差异性。多药耐药是指肿瘤细胞对一种化疗药物产生耐药性的同时，对其他化疗药物也能够产生一定耐药性^[32]。研究发现肿瘤的耐药可能和以下因素关系密切：①P糖蛋白、多药耐药相关蛋白、乳腺癌耐药蛋白等，能够降低化疗药物作用浓度，影响疗效。②肿瘤细胞自我修复能力、对损伤细胞的耐受能力会得到增强，并且降低了肿瘤细胞的死亡率^[33-34]。 ③肿瘤耐药性的产生使得药物渗透性降低，患者治疗预后较差。同时，细胞中的多种酶能够诱导药物失活，从而能够改变药物的作用靶点以及作用途径^[35-36]。实验中，乳腺癌干细胞LRP阳性率为17%，显著低于分化细胞(LRP阳性率为37%)；乳腺癌干细胞GST-π阳性率为20%，显著高于分化细胞(GST-π阳性率为10%)，差异均有显著性意义(P < 0.05)。从乳腺癌组织中分离出CD44+CD24-乳腺癌干细胞^[37-38]，乳腺癌干细胞和乳腺癌分化细胞相比对于MDR1和BCRP表达能力更强，并且患者经过放化疗辅助治疗后其所占比例将会进一步提高^[39-40]。
综上所述，乳腺癌干细胞具有自我繁殖和多向分化能力，能够促进肿瘤的发生和发展，并且能够维持肿瘤所需营养物质。肿瘤干细胞的耐药性是肿瘤耐药的关键原因，研究乳腺干细胞耐药性具有重要意义。