肺痹方干预肺纤维化模型小鼠细胞外基质转化的机制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2112

中国组织工程研究 ›› 2020, Vol. 24 ›› Issue (31): 5038-5043.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2112

• 干细胞基础实验 basic experiments of stem cells • 上一篇下一篇

肺痹方干预肺纤维化模型小鼠细胞外基质转化的机制

程雪1，方泓2，张运克1，吴银根2

1河南中医药大学，河南省郑州市 450046；2上海中医药大学附属龙华医院，上海市 200032

收稿日期:2019-11-05 修回日期:2019-11-13 接受日期:2019-12-26 出版日期:2020-11-08 发布日期:2020-09-04
通讯作者: 方泓，博士，主任医师，硕士生导师，上海中医药大学附属龙华医院，上海市 200032
作者简介:程雪，女，1988年生，河南省信阳市人，2018年上海中医药大学毕业，博士，讲师，主要从事呼吸系统疾病的临床研究。
基金资助:
河南省高等学校重点科研项目(20B360015)；第二期名师传承工程吴银根名师研究室(教学009)

Interventional mechanism of Feibi prescription on extracellular matrix transformation in a mouse model of pulmonary fibrosis

Cheng Xue1, Fang Hong2, Zhang Yunke1, Wu Yingen2

1Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, Henan Province, China; 2Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200032, China

Received:2019-11-05 Revised:2019-11-13 Accepted:2019-12-26 Online:2020-11-08 Published:2020-09-04
Contact: Fang Hong, MD, Chief physician, Master’s supervisor, Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200032, China
About author:Cheng Xue, MD, Lecturer, Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, Henan Province, China
Supported by:
the Key Scientific Research Project of Higher Education Institutions in Henan Province, No. 20B360015; the Second-Phase Famous Teacher’s Inheritance Project, No. Teaching 009

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

细胞外基质：肺组织的细胞外基质与肺纤维化关系最为密切，肺组织损伤修复过程中细胞外基质成分首先填补损伤肺组织，当其过度沉积时可形成肺间质纤维化，此外细胞外基质与炎症也有密切关系，因此研究细胞外基质形成对于认识肺纤维化的发病机制及诊断、防治具有重要意义。

博来霉素：是一类糖苷类抗生素，临床上用于多种肿瘤的治疗，具有可致机体发生明显肺间质纤维化的毒副作用，故多用于肺纤维化动物模型的制备，其作用机制是诱导肌成纤维细胞的异常增生，过量胶原纤维堆积，最终导致肺纤维化的形成。

背景：肺组织损伤修复过程中，细胞外基质成分首先填补损伤肺组织，当其过度沉积时可形成肺间质纤维化。

目的：探讨肺痹方对博莱霉素致肺纤维化小鼠细胞外基质转化的干预作用。

方法：将60只C57BL/6雄性小鼠随机分为空白对照组、模型组、吡非尼酮组、肺痹方低剂量组、肺痹方中剂量组、肺痹方高剂量组，每组10只。除空白对照组外，其余5组腹腔注射博莱霉素[7.5 mg/(kg·d)]建立肺纤维化模型，连续注射10 d。造模后第1天各药物组灌胃给药[51.43 mg/(kg·d)]吡非尼酮，6.43，12.86， 25.72 mg/(kg·d)肺痹方]，连续给药28 d。用药28 d后取肺组织，采用苏木精-伊红染色和Masson染色观察小鼠肺组织的形态学变化，ELISA法检测血清中转化生长因子β1、肿瘤坏死因子α水平，Western blot法检测肺组织中α-平滑肌肌动蛋白、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原的表达。

结果与结论：①与空白对照组相比，各组小鼠血清转化生长因子β1水平显著升高(P < 0.01)；与模型组相比，吡非尼酮组、肺痹方中剂量组、肺痹方高剂量组血清转化生长因子β1水平显著降低(P < 0.05，P < 0.01)，肺痹方高剂量组降低最明显；②与模型组相比，用药各组血清肿瘤坏死因子α水平明显降低(P < 0.01)，用药各组之间两两比较差异无显著性意义(P > 0.05)；③与空白对照组相比，各组α-平滑肌肌动蛋白表达均不同程度增高(P < 0.05，P < 0.01)；肺痹方高剂量组α-平滑肌肌动蛋白表达低于肺痹方低、中剂量组，差异有显著性意义(P < 0.05)；④与空白对照组相比，模型组、肺痹方低剂量组Ⅰ型胶原表达增高(P < 0.05，P < 0.01)；与模型组相比，肺痹方中、高剂量组Ⅰ型胶原表达降低(P < 0.05)；⑤与空白对照组相比，各组Ⅲ型胶原表达均不同程度增高(P < 0.05，P < 0.01)；肺痹方中、高剂量组以及吡非尼酮组Ⅲ型胶原表达明显低于肺痹方低剂量组(P < 0.05，P < 0.01)；⑥结果表明，肺痹方可以减轻肺纤维化，抑制博来霉素诱导的肺纤维化小鼠细胞外基质转化，其机制可能与下调血清中转化生长因子β1、肿瘤坏死因子α水平，抑制肺组织中α-平滑肌肌动蛋白、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原表达有关。

ORCID: 0000-0002-9170-7217(程雪)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 肺痹方, 肺纤维化, 细胞外基质, 博莱霉素, C57BL/6小鼠

Abstract:

BACKGROUND: In the process of repair, extracellular matrix components first fill up the damaged lung tissue. However, excessive deposition of extracellular matrixes can develop pulmonary interstitial fibrosis.

OBJECTIVE: To investigate the effect of Feibi prescription on extracellular matrix transformation in mice with pulmonary fibrosis induced by bleomycin.

METHODS: Sixty male C57BL/6 mice were randomly divided into blank control group, model group, pirfenidone group, and three Feibi prescription groups (low-, middle-, and high-dose groups). There were 10 mice in each group. Except for the blank control group, the other five groups were intraperitoneally injected with bleomycin (7.5 mg/kg per day) for 10 continuous days to establish the model of pulmonary fibrosis. On day 1 after modeling, the mice in corresponding drug groups were intragastrically administered with pirfenidone (51.43 mg/kg per day) and Feibi prescription (6.43, 12.86, 25.72 mg/kg per day). Drug administration lasted for 28 days. Then, morphological changes of lung tissue in mice were observed by hematoxylin-eosin staining and Masson staining. The contents of transforming growth factor-β1 and tumor necrosis factor-α in the serum were detected by ELISA, and the expression of a-smooth muscle actin, collagen type I and collagen type III in the lung tissue was detected by western blot assay.

RESULTS AND CONCLUSION: The serum levels of transforming growth factor-β1 were significantly increased in the other groups compared with the blank control group (P < 0.01), but the levels were significantly lower in the pirfenidone, middle-dose and high-dose Feibi prescription groups than in the model group (P < 0.05, P < 0.01), and the most decline was in the high-dose Feibi prescription group. Compared with the model group, the expression of tumor necrosis factor-α was significantly reduced in the four drug groups (P < 0.01), but there was no significant difference between the drug groups (P > 0.05). Compared with the blank control group, the expression of α-smooth muscle actin was increased in the other groups to varying degrees (P < 0.05, P < 0.01). The expression of α-smooth muscle actin was significantly lower in the high-dose Feibi prescription group than the low- and middle-dose Feibi prescription groups (P < 0.05). The expression of collagen type I was significantly higher in the model and low-dose Feibi prescription groups than in the control group, whereas it was significantly lower in the middle- and high-dose Feibi prescription groups than in the model group (P < 0.05). Compared with the blank control group, the expression of collagen type III was increased to different extents in the other groups (P < 0.05, P < 0.01). Compared with the low-dose Feibi prescription group, the expression of collagen type III was significantly decreased in the middle-dose Feibi prescription group, high-dose Feibi prescription group and bleomycin group (P < 0.05, P < 0.01). To conclude, Feibi prescription can alleviate pulmonary fibrosis and inhibit the extracellular matrix transformation in bleomycin-induced pulmonary fibrosis mice. The mechanism may be related to down-regulating the levels of transforming growth factor-β1 and tumor necrosis factor-α, and inhibiting the expression of α-smooth muscle actin, collagen type I and collagen type III in the lung tissue.

Key words: Feibi prescription, pulmonary fibrosis, extracellular matrix, bleomycin, C57BL/6 mice

中图分类号:

程雪, 方泓, 张运克, 吴银根. 肺痹方干预肺纤维化模型小鼠细胞外基质转化的机制[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(31): 5038-5043.

Cheng Xue, Fang Hong, Zhang Yunke, Wu Yingen. Interventional mechanism of Feibi prescription on extracellular matrix transformation in a mouse model of pulmonary fibrosis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2020, 24(31): 5038-5043.

图/表（结果） 6

2.1 实验动物数量分析参加实验C57BL/6雄性小鼠60只，随机分成空白对照组、模型组、吡非尼酮组、肺痹方低剂量组、肺痹方中剂量组、肺痹方高剂量组，每组10只，中途无脱落、无死亡。

2.2 小鼠一般行为及体质量空白对照组小鼠活泼好动，毛色光亮润泽，反应灵敏，呼吸平稳，饮食如常，体质量逐日增加；模型组小鼠精神不振，呼吸急促，毛发凌乱、脱落、缺乏光泽，饮食及饮水量下降，体质量逐日减轻；吡非尼酮组及肺痹方各剂量组小鼠反应欠灵敏，毛色光泽尚可，饮食及饮水量减少，一般状况优于模型组；肺痹方低剂量组一般状况较吡非尼酮组、肺痹方中剂量组、肺痹方高剂量组差。各组小鼠体质量见图1，用药7 d与14 d时，与空白对照组相比，其余各组小鼠体质量均下降(P < 0.01)；模型组小鼠体质量下降最明显(P < 0.05，P < 0.01)；用药21 d和28 d各组小鼠体质量逐渐增加，但与空白对照组相比差异仍有显著性意义(P < 0.05)。

2.3 各组小鼠组织病理学观察结果由图2，3可见，空白对照组小鼠肺组织结构正常，肺泡间隔无增厚、纤维渗出，无炎症细胞浸润；模型组肺泡间隔明显增厚，肺泡间隔和肺泡腔有大量炎症细胞浸润及大量胶原纤维渗出；吡非尼酮组肺泡间隔增厚，炎症细胞少量浸润，肺泡结构轻-中度破坏，可见纤维组织增生；肺痹方低剂量组肺泡间隔及肺泡腔有炎症细胞浸润，大量胶原纤维渗出，但与模型组对比稍减轻；肺痹方中、高剂量组肺泡结构增宽，肺泡结构轻微破坏，少量的炎症细胞浸润，少量肺纤维灶。

各组小鼠肺泡炎及肺纤维化病理学积分见表2，模型组肺泡炎及肺纤维化程度最重，除肺痹方低剂量组外，与其他各组相比差异有显著性意义(P < 0.05，P < 0.01)；肺痹方低剂量组与模型组相比，肺泡炎及肺纤维化程度稍减轻，但差异无显著性意义(P > 0.05)；吡非尼酮组、肺痹方中剂量组、肺痹方高剂量组能明显减轻肺纤维化小鼠肺泡炎及肺纤维化程度，但是三者之间两两比较，差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.4 血清中转化生长因子β1、肿瘤坏死因子α水平与空白对照组相比，其余各组小鼠血清转化生长因子β1水平显著升高(P < 0.01)，其中模型组升高最明显；与模型组相比，吡非尼酮组、肺痹方中剂量组、肺痹方高剂量组显著降低(P < 0.05，P < 0.01)；肺痹方低剂量组血清转化生长因子β1水平比模型组稍低，但二者相比差异无显著性意义(P > 0.05)；肺痹方高剂量组血清转化生长因子β1水平明显低于肺痹方低剂量组(P < 0.05)，见表3。

模型组小鼠血清肿瘤坏死因子α水平最高，空白对照组最低；与空白对照组相比，模型组及肺痹方低、中剂量组血清肿瘤坏死因子α水平显著升高(P < 0.05，P < 0.01)；与模型组相比，其余各组小鼠血清肿瘤坏死因子α水平显著降低(P < 0.01)；用药各组比较，肺痹方低剂量组肿瘤坏死因子α水平最高，肺痹方高剂量组含量最低，但用药各组之间两两比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见表3。

2.5 各组小鼠肺组织匀浆α-平滑肌肌动蛋白、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原的表达与空白对照组相比，各组α-平滑肌肌动蛋白表达均不同程度增高(P < 0.05，P < 0.01)，模型组表达最高(P < 0.01)；肺痹方低剂量组α-平滑肌肌动蛋白表达明显高于吡非尼酮组、肺痹方中剂量组、肺痹方高剂量组，差异有显著性意义(P < 0.01)；肺痹方高剂量组α-平滑肌肌动蛋白表达低于肺痹方中剂量组，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图4。

空白对照组小鼠肺组织Ⅰ型胶原表达最低，与模型组、肺痹方低剂量组相比，差异有显著性意义(P < 0.05，P < 0.01)；与模型组相比，用药各组Ⅰ型胶原表达均有不同程度降低，模型组Ⅰ型胶原表达与肺痹方中、高剂量组相比，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图4。

与空白对照组相比，各组Ⅲ型胶原表达均不同程度增高(P < 0.05，P < 0.01)，模型组表达最高(P < 0.01)；肺痹方低剂量组Ⅲ型胶原表达明显高于吡非尼酮组、肺痹方中剂量组、肺痹方高剂量组，差异有显著性意义(P < 0.05，P < 0.01)，见图4。

参考文献

[1] GEORGE PM, PATTERSON CM, REED AK, et al. Lung transplantation for idiopathic pulmonary fibrosis.Lancet Respir Med.2019;7(3): 271-282.

[2] MARTINEZ FJ, COLLARD HR, PARDO A, et al. Idiopathic pulmonary fibrosis. Nat Rev Dis Primers. 2017;3:17074.

[3] GAO L, JIANG D, GENG J, et al. Hydrogen inhalation attenuated bleomycin-induced pulmonary fibrosis by inhibiting transforming growth factor-β1 and relevant oxidative stress and epithelial-to- mesenchymal transition. Exp Physiol. 2019;104(12):1942-1951.

[4] LI YQ, XIANG MR, RONG R, et al. Inhibitory effect of Glehniae Radix petroleum ether part on TGF-β1-induced epithelial mesenchymal transition in A549 cells. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 2017;42(9): 1736-1741.

[5] NATHAN SD, BARNETT SD, MORAN B, et al. Interferon gamma-1b as therapy for idiopathic pulmonary fibrosis. An intrapatient analysis. Respiration. 2004;71(1):77-82.

[6] 吴银根,唐斌擎.吴银根肺系疾病中医诊疗思路与经验[M].上海:上海科学技术出版社,2016:198.

[7] 程雪,王丽新,孙鼎,等.基于中医传承辅助系统挖掘吴银根治疗特发性肺纤维化的用药规律[J].中国中医基础医学杂志, 2018,24(11):1562-1564.

[8] 程雪,李少滨,吴银根,等.吴银根治疗间质性肺炎用药规律研究[J].山东中医杂志,2018,37(5):392-394,408.

[9] 程雪,方泓,吴银根.肺痹方对肺纤维化小鼠抗氧化作用的实验研究[J].中国中医急症,2018,27(3):394-397,409.

[10] MAEDA A, HIYAMA K, YAMAKIDO H, et al. Increased expression of platelet-derived growth factor A and insulin-like growth factor-I in BAL cells during the development of bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice. Chest. 1996;109(3):780-786.

[11] 章元沛.药理学实验[M].北京:人民卫生出版社,1996:238.

[12] SZAPIEL SV, ELSON NA, FULMER JD, et al. Bleomycin-induced interstitial pulmonary disease in the nude, athymic mouse. Am Rev Respir Dis. 1979;120(4):893-899.

[13] CHUA F, GAULDIE J, LAURENT GJ. Pulmonary fibrosis: searching for model answers. Am J Respir Cell Mol Biol. 2005;33(1):9-13.

[14] 卢锦辉,张丽,刘子豪,等.博来霉素诱导小鼠肺纤维化模型的建立及评价[J].兰州大学学报(医学版),2019,45(6):37-42.

[15] 李丽娜,王华,周蕾,等.博莱霉素诱导小鼠肺间质纤维化造模方式的选择[J].中国免疫学杂志,2010,26(3):254-257.

[16] 李戎,闫志勇,李文军,等.肺纤维化发生与防治机理的重要因素—细胞因子作用机制研究[J].中国中医药现代远程教育, 2004,2(6):23-26.

[17] SENAVIRATHNA LK, HUANG C, PUSHPARAJ S, et al. Hypoxia and transforming growth factor β1 regulation of long non-coding RNA transcriptomes in human pulmonary fibroblasts. Physiol Rep. 2020; 8(1):e14343.

[18] SUN J, USUNE S, ZHAO Y, et al. Multidrug resistance protein transporter and Ins(1,4,5)P₃-sensitive Ca²+-signaling involved in adenosine triphosphate export via Gq protein-coupled NK₂-receptor stimulation with neurokinin A. J Pharmacol Sci. 2010;114(1):92-98.

[19] KOMMAJOSYULA SP, RANDALL ME, FAINGOLD CL. Inhibition of adenosine metabolism induces changes in post-ictal depression, respiration, and mortality in genetically epilepsy prone rats. Epilepsy Res. 2016;119:13-19.

[20] HIGGINS DF, KIMURA K, BERNHARDT WM, et al. Hypoxia promotes fibrogenesis in vivo via HIF-1 stimulation of epithelial-to-mesenchymal transition. J Clin Invest. 2007;117(12):3810-3820.

[21] LIU RM. Oxidative stress, plasminogen activator inhibitor 1, and lung fibrosis. Antioxid Redox Signal. 2008;10(2):303-319.

[22] GOLAN-GERSTL R, WALLACH-DAYAN SB, AMIR G, et al. Epithelial cell apoptosis by fas ligand-positive myofibroblasts in lung fibrosis. Am J Respir Cell Mol Biol. 2007;36(3):270-275.

[23] LUCATTELLI M, FINESCHI S, SELVI E, et al. Ajulemic acid exerts potent anti-fibrotic effect during the fibrogenic phase of bleomycin lung. Respir Res. 2016;17(1):49.

[24] 张天嵩,吴银根.通补肺络法治疗肺纤维化理论探讨[J].中医杂志, 2002, 43(11):808-810.

[25] 刘晓明,朱雪,张伟.化痰类中药干预肺纤维化模型大鼠肺组织中Nrf2含量的研究[J].时珍国医国药,2017,28(9):2081-2084.

[26] 赵霞,王丽新.特发性肺纤维化治验[J].湖南中医杂志, 2012,28(3):92-93.

[27] 孟丽红,张晓梅,董环,等.养阴益气合剂对肺纤维化大鼠TGF-β/Smad信号通路的影响[J].环球中医药, 2019,12(12):1810-1815.

[28] 牟玮,宋雅琳,张硕,等.冬虫夏草治疗慢性阻塞性肺疾病临床疗效的系统评价[J].中国循证医学杂志,2013,13(11):1373-1381.

[29] 宋建平,刘方州,李伟,等.金匮肾气丸对肺纤维化大鼠组织中肿瘤坏死因子a表达的影响[J].中成药,2006,28(1):78-81.

[30] 薛娟.川芎嗪对人胚肺成纤维细胞系MRC-5细胞增殖及胶原蛋白合成的作用[D].石家庄:河北大学,2014.

引言

材料方法

1.1 设计体内动物实验，肺组织中胶原蛋白表达检测。

1.2 时间及地点实验于2019年3至9月在河南中医药大学动物实验研究中心完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 SPF级C57BL/6雄性小鼠60只，五六周龄，体质量18-20 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号SCXK(京)2016-0011。

1.3.2 实验药物及试剂肺痹方组成：三棱、法半夏、地黄、女贞子，药物饮片由上海中医药大学附属龙华医院提供；吡非尼酮(100 mg/粒，北京康蒂尼药业有限公司，批准文号：国药准字H20133376)；注射用盐酸博莱霉素 (50 mg/瓶，大连美仑生物技术有限公司，批号：D1221A)；转化生长因子β1 ELISA试剂盒(ARG80211)、肿瘤坏死因子α ELISA试剂盒(ARG80206，上海恒斐生物科技有限公司)；兔多抗Ⅰ型胶原抗体(ab7778)、Ⅲ型胶原抗体(ab34710)、α-平滑肌肌动蛋白抗体(ab32575)、Anti-GAPDH抗体(ab8245，Abcam公司)。

1.3.3 实验仪器电热恒温水槽(DNB-501S)、电热恒温培养箱(DNP-9052，上海精宏实验设备有限公司)；定轨振荡器(VORTEX-5，海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；光学显微镜)(403497，上海衡洁仪器有限公司)；轮转切片机(RM2235，上海涵荣医疗器械有限公司)；电子分析天平(BSA-124S，赛马利斯科学仪器有限公司)；酶标仪(SynergyH1MF，美国伯腾仪器有限公司)；4 ℃冰箱(BCD-312WDBA，青岛海尔有限股份公司)；-80 ℃冰箱(905-ults，赛墨飞世尔科技有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 肺痹方药物提取取三棱、法半夏、地黄、女贞子4种药物，按比例1∶1∶1∶2组成，加入8倍剂量的水煎煮1 h后过滤，药渣加入6倍的水煎煮1 h后过滤，两煎合并，浓缩至1，2，4 g/mL，分装后存放于4 ℃冰箱备用。

1.4.2 实验分组 60只小鼠随机区组分为空白对照组、模型组、吡非尼酮组、肺痹方低剂量组、肺痹方中剂量组、肺痹方高剂量组，每组10只。动物自由进食、饮水，喂标准颗粒饲料，室温18-22 ℃，常规饲养观察1周后使用。

1.4.3 肺纤维化小鼠模型建立适应性喂养结束后第2天开始造模。模型组按7.5 mg/(kg·d)腹腔注射盐酸博莱霉素^[10]，连续注射10 d；空白对照组小鼠腹腔注射等量生理盐水，连续注射10 d；其余各组造模方法同模型组。

1.4.4 动物给药方法造模成功后第1天，根据人与动物体表面积折算的等效剂量比值计算^[11]，各组给予不同浓度肺痹方进行干预，低、中、高浓度剂量组分别按照人-鼠等效量的1，2，4倍给药。吡非尼酮组按照51.43 mg/(kg·d)的剂量给予吡非尼酮灌胃，肺痹方低、中、高剂量组分别按照6.43，12.86，25.72 g/(kg·d)的剂量灌胃，空白对照组及模型组给予等量的生理盐水灌胃。给药时间共4周，每周称取各组小鼠体质量。

1.5 主要观察指标用药28 d后，采取眼球放血处死小鼠，收集血液，继之开胸，分离出小鼠双肺，大体观察双肺后滤纸吸水称质量。按照转化生长因子β1、肿瘤坏死因子α ELISA试剂盒说明书操作检测血清中转化生长因子β1、肿瘤坏死因子α水平。取左肺固定于40 g/L多聚甲醛溶液中，用于苏木精-伊红染色和Masson染色，肺组织病理切片根据SZAPIEL等^[12]方法确定肺泡炎症和肺纤维化的程度，见表1。

取右肺放入冰生理盐水中充分漂洗后，用滤纸吸干表面水分，放入冻存管中，于-80 ℃冰箱中保存，采用Western blot法测定肺组织中α-平滑肌肌动蛋白、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原表达。取100 g肺组织，加入裂解液，用高度分散均质机充分研磨制备成10%组织匀浆液，离心，提取上清液，测匀浆蛋白浓度；配置SDS-PAGE凝胶，电泳，转膜，用5%脱脂牛奶在摇床上室温封闭；将PVDF膜平铺于孵育盒中，加入5%脱脂奶粉稀释的α-平滑肌肌动蛋白、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和GAPDH抗体，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜10 min×4次，加入5%脱脂奶粉稀释后的二抗，室温孵育1 h，TBST洗膜10 min×4次，将膜从TBST中取出，吸水纸稍吸干，用ECL化学发光显色液，置于凝胶成像系统曝光显影成像。

1.6 统计学分析使用SPSS 21.0进行相关统计学分析。实验数据计量资料用x(_)±s表示，多组间检验用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

肺纤维化是由多种因素引起的弥散性肺间质疾病，博莱霉素是一种细胞毒性抗癌药物，有致肺纤维化的毒副作用，用博莱霉素复制肺纤维化动物模型被认为是最接近特发性肺纤维化病理改变模型^[13-14]，而腹腔注射法形成的肺纤维化最接近人类特发性肺纤维化的影像学表现^[15]。在肺纤维化演变过程中涉及到多种复杂的细胞因子。转化生长因子β被认为是致纤维化关键因子，是迄今发现导致细胞外基质沉积的最强因子^[16-17]，转化生长因子β1是其中一种表型，不仅可以促进肌纤维母细胞及胶原蛋白合成，还能促进炎性因子的趋化激活^[18-19]。肿瘤坏死因子α是临床发生肺纤维化时常见的促纤维化细胞因子，它可以降低细胞外基质的降解，促进肺纤维化的发生^[20-21]。在肺纤维化的发生过程中，肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化起着关键性的作用，而α-平滑肌肌动蛋白被认为是肌成纤维细胞一种特有的标记^[22]。从α-平滑肌肌动蛋白表达水平的高低，可得知肌成纤维细胞的合成、胶原分泌程度^[23]，两者主要分泌的Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白是细胞外基质的主要成分。

肺痹方以补肾养阴与活血化瘀相结合，其组成三棱、法半夏、地黄、女贞子。吴银根教授认为肺纤维化为“肺络痹阻”^[24]，而本病之“本”为肺肾气虚，肺络中血行迟滞、络脉失养，痰瘀互结阻于络中。三棱为活血化瘀药，吴老师认为对于肺络阻痹之瘀血，非三棱、莪术等破血之品不为功，但三棱通气分，莪术入血分，三棱相对于莪术力量小，使用更安全。法半夏能燥湿化痰，消痞散结^[25]。地黄，《本经逢原》：“干地黄，内专凉血滋阴，外润皮肤荣泽，病人虚而有热者宜加用之……”。女贞子具有滋补肝肾，乌须明目的作用^[26]。全方共奏活血通络、补肾养阴，符合肺纤维化肺络痹阻的特点。前期临床研究发现，肺痹方能够改善患者胸闷、气短、喘咳等症状，提高患者的生存质量。实验研究表明，补肾养阴的药物能抑制肺组织中转化生长因子β、肿瘤坏死因子α表达及细胞外基质过度沉积，从而发挥抗肺纤维化作用^[27-29]。而活血化瘀药能使胶原蛋白有所减少，Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原mRNA表达下降^[30]。

该实验通过腹腔内注射博莱霉素诱导小鼠肺纤维化形成，同时给予肺痹方进行干预，结果发现肺痹方能够改善肺纤维化小鼠的肺泡炎和肺纤维化形成，且具有剂量依赖性；降低血清中相关因子转化生长因子β1、肿瘤坏死因子α水平，其效果最佳的是肺痹方高剂量组，而且能够降低肺纤维化小鼠肺组织α-平滑肌肌动蛋白、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原的表达，这表明肺痹方可以通过减少肺纤维化小鼠细胞外基质的沉积，从而达到延缓肺纤维化进程，具有良好的治疗作用。但是尚缺乏对肺纤维化体外模型研究的开展，下一步需要对肺成纤维细胞进行体外培养，以肺痹方含药血清或重要单体进行干预，以期揭示肺痹方治疗肺纤维化的作用机制。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

肺痹方干预肺纤维化模型小鼠细胞外基质转化的机制

Interventional mechanism of Feibi prescription on extracellular matrix transformation in a mouse model of pulmonary fibrosis

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