骨髓间充质干细胞条件培养基加入罗格列酮后促进内皮祖细胞的增殖与迁移

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2155

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (1): 56-60.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2155

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骨髓间充质干细胞条件培养基加入罗格列酮后促进内皮祖细胞的增殖与迁移

陶贵录，楚同彬，张雷

大连医科大学附属第二医院创面修复科，辽宁省大连市 116031

收稿日期:2018-07-06 修回日期:2018-07-09 接受日期:2020-02-19 出版日期:2021-01-08 发布日期:2020-10-29
通讯作者: 陶贵录，博士，医师，大连医科大学附属第二医院创面修复科，辽宁省大连市 116031
作者简介:陶贵录，男，1986年生，黑龙江省海伦市人，汉族，博士，医师，主要从事糖尿病足及各种慢性创面的诊治研究。
基金资助:
大连市医学科学研究计划项目(18Z2006)

Proliferation and migration of endothelial progenitor cells promoted by bone marrow mesenchymal stem cells conditioned medium with rosiglitazone

Tao Guilu, Chu Tongbin, Zhang Lei

Department of Wound Healing, Second Hospital of Dalian Medical University, Dalian 116031, Liaoning Province, China

Received:2018-07-06 Revised:2018-07-09 Accepted:2020-02-19 Online:2021-01-08 Published:2020-10-29
Contact: Tao Guilu, MD, Physician, Department of Wound Healing, Second Hospital of Dalian Medical University, Dalian 116031, Liaoning Province, China
About author:Tao Guilu, MD, Physician, Department of Wound Healing, Second Hospital of Dalian Medical University, Dalian 116031, Liaoning Province, China
Supported by:
Dalian Medical Science Research Project, No. 18Z2006

摘要/Abstract

关键词: 干细胞, 骨髓间充质干细胞">, , 条件培养基">, , 罗格列酮">, , 祖细胞">, , 内皮祖细胞">, , 因子">, , 血管生成

Key words: stem cells">, , bone marrow mesenchymal stem cells">, , conditioned medium">, , rosiglitazone">, , progenitor cells">, , endothelial progenitor cells">, , factors">, , angiogenesis

中图分类号:

陶贵录, 楚同彬, 张雷. 骨髓间充质干细胞条件培养基加入罗格列酮后促进内皮祖细胞的增殖与迁移[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(1): 56-60.

Tao Guilu, Chu Tongbin, Zhang Lei. Proliferation and migration of endothelial progenitor cells promoted by bone marrow mesenchymal stem cells conditioned medium with rosiglitazone[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(1): 56-60.

图/表（结果） 5

2.1 内皮祖细胞的培养和鉴定结果密度梯度离心法初分离的细胞为圆形，接种1 d后可见圆形贴壁细胞，逐渐增多并变形；培养至第4-6天，贴壁细胞显著增多，细胞体积变大，细胞为类圆形、梭形或多边形，培养至第7-9天，细胞呈集落生长，大部分细胞呈多边形或长梭形；培养至第14天左右，贴壁细胞生长呈“铺路石”样外观，见图1。

荧光显微镜观察发现细胞摄取了DiI-Ac-LDL，呈红色；细胞膜结合了FITC-UEA-I，呈绿色，双染色阳性的细胞呈黄色，说明培养的细胞为内皮祖细胞，见图2。流式细胞仪检测显示，细胞表面高表达抗原标记KDR、CD31、CD144，阳性率分别为(92.2±3.1)%，(74.9±3.4)%和(71.3±8.9)%，不表达造血干细胞系表面抗原标记CD45。

2.2 各组条件培养基中血管内皮生长因子与基质细胞衍生因子1水平见图3。与正常组比较，高糖组条件培养基中的血管内皮生长因子与基质细胞衍生因子1水平均明显降低，差异有显著性意义(P < 0.05)；与高糖组比较，罗格列酮组条件培养基中血管内皮生长因子与基质细胞衍生因子1水平均明显升高，差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.3 各组内皮祖细胞增殖能力与对照组比较，模型组内皮祖细胞增殖能力明显下降，差异有显著性意义(P < 0.05)；与模型组比较，实验组内皮祖细胞增殖能力明显升高，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图4。

2.4 各组内皮祖细胞的迁移能力与对照组比较，模型组内皮祖细胞迁移能力明显下降，差异有显著性意义(P < 0.05)；与模型组比较，实验组内皮祖细胞迁移能力明显升高，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图5。

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引言

糖尿病是除肿瘤与心血管疾病外第3大威胁人类健康的公共卫生问题[1-2]，主要病因是患者体内胰岛素分泌不足或作用受到限制，临床表现为血糖升高并伴随着不同程度的体质量减轻[3]。糖尿病足溃疡是糖尿病较常见的并发症，发病率呈逐渐增加趋势，溃疡若进一步发展将导致患者截肢[4]。有研究认为血管内皮细胞功能障碍是糖尿病血管病变的始动环节，长期高糖环境下的血管内皮细胞功能紊乱，导致创面难以愈合[5-6]。因此，如何促进糖尿病溃疡创面愈合是目前医学领域的重点课题。
近年来干细胞技术的迅速发展，为糖尿病足溃疡创面治疗带来了新的思路。研究表明，间充质干细胞可促进糖尿病足溃疡创面的愈合，对预防截肢有一定的作用[7-9]，但是也有研究发现高糖环境明显抑制了间充质干细胞的存活[10-11]。因此控制溃疡创面的血糖浓度可能是保证治疗效果的关键环节。
罗格列酮是目前被广泛应用于临床的降血糖药物，属于噻唑烷二酮类胰岛素增敏剂，可起到降低血糖与改善胰岛素抵抗的作用。已有研究发现罗格列酮可促进间充质干细胞的分化[12-13]，提示其可影响间充质干细胞的功能，但是罗格列酮对高糖环境下间充质干细胞功能的影响，以及罗格列酮干预间充质干细胞培养基对内皮细胞功能的影响，还有待研究。
基于以上研究与假设，该研究主要观察罗格列酮干预骨髓间充质干细胞条件培养基对高糖环境下内皮祖细胞增殖、迁移的作用，以期为临床治疗糖尿病足溃疡创面提供理论借鉴和支持。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞实验。
1.2 时间及地点实验于2017年5月至2018年5月在大连医科大学附属第二医院中心实验室完成。
1.3 材料健康雄性昆明小鼠5只，清洁级，七八周龄，体质量为(28±6) g，由大连医科大学动物实验中心提供。实验过程中严格按照动物伦理学要求进行，实验已通过大连医科大学附属第二医院伦理委员会批准(批准编号2017099)。
实验细胞、试剂：人骨髓间充质干细胞(北京裕恒丰科技有限公司)；罗格列酮(美国Sigma公司)；含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养基(武汉艾美捷科技有限公司)；Percoll 分离液(上海联硕生物科技有限公司)；DMEM培养基(武汉普诺赛生命科技有限公司)；体积分数为10%胎牛血清(上海江林生物科技有限公司)；EGM-2MV完全培养基(北京泽平科技有限责任公司)；DiI-Ac-LDL(北京索莱宝科技有限公司)；FITC-UEA-I (杭州晓柚生物科技有限公司)；流式细胞仪(美国BD公司)；ELISA试剂盒(上海一研生物科技有限公司)。
1.4 方法
1.4.1 内皮祖细胞的分离培养与鉴定
密度梯度离心法培养内皮祖细胞：采用戊巴比妥钠麻醉昆明小鼠，随后颈椎脱臼处死，置于体积分数75%乙醇中浸泡5-10 min，无菌条件下获取胫骨与股骨骨髓液0.5 mL，加至等体积的Percoll分离液上，3 000 r/min离心30 min，用吸管吸出中间白色云雾状单个核细胞层，用5倍体积的DMEM培养基洗涤2次，重悬于含体积分数为10%胎牛血清的EGM-2 MV完全培养基中；以1×107/cm2的密度接种于包被纤维连接蛋白的培养瓶中，置于37 ℃、体积分数5%CO2、95%饱和湿度的培养箱中培养，3 d后去除未贴壁细胞，更换新的培养基继续培养[14]。
内皮祖细胞的鉴定：当内皮祖细胞培养至第7天时，采用双荧光染色法进行鉴定，简要步骤如下：采用无血清EGM-2 MV完全培养基饥饿培养细胞12 h后，与7.5 mg/L DiI-Ac-LDL在37 ℃避光孵育4-6 h；PBS冲洗3次，5 min/次；40 g/L多聚甲醛固定10 min；PBS洗涤3次，5 min/次；加入20 mg/L FITC-UEA-I 37 ℃孵育1 h；PBS洗涤3次，5 min/次；封固；在荧光显微镜下观察细胞摄取DiI-Ac-LDL与结合FITC-UEA-I的能力，双染色阳性细胞即为内皮祖细胞。当内皮祖细胞培养至第7天时，采用流式细胞仪检测细胞表面标记物KDR、CD31、CD144表达阳性率。
1.4.2 罗格列酮干预骨髓间充质干细胞以及条件培养基获取取对数生长期的人骨髓间充质干细胞，消化离心并重悬细胞，以3×107 L-1的细胞浓度接种于96孔板中，每孔100 μL，待细胞贴壁后分为正常组、高糖组、罗格列酮组，每组设置6个复孔。正常组加入含体积分数10%胎牛血清的α-MEM培养基培养；高糖组加入含体积分数10%胎牛血清、25 mmol/L葡萄糖的α-MEM培养基培养[15]；罗格列酮组加入含体积分数10%胎牛血清、25 mmol/L葡萄糖、10 μmol/L罗格列酮的α-MEM培养基培养[16]。将96孔板放于37 ℃、体积分数5%CO2、95%饱和湿度的培养箱中培养48 h后提取培养上清，0.22 μm滤膜过滤，作为条件培养基。
1.4.3 ELISA法检测血管内皮生长因子与基质细胞衍生因子1水平采用ELISA试剂盒检测各组条件培养基中血管内皮生长因子与基质细胞衍生因子1水平，依照试剂盒说明书操作进行，简要步骤如下：设标准品组、空白孔、待测样品组→
加样→加酶标溶液：标准品组、待测样本组各孔中加入
50 μL酶标溶液(空白对照孔除外)→温育：酶标板用封板纸密封后，放入湿盒内于37 ℃恒温孵育 1 h→洗板：用稀释后的洗涤液注满每孔，静置 15-30 s，充分清洗酶标板5次，用吸水纸彻底拍干→显色：各孔加显色剂A液50 μL后，再加显色剂B液50 μL→终止：25-37 ℃避光反应 10-15 min，加50 μL终止液→读板：在 450 nm 波长读取各孔吸光度值。
1.4.4 条件培养基干预内皮祖细胞取对数生长期的内皮祖细胞，消化离心并重悬细胞，以3×107 L-1的细胞浓度接种于96孔板中，每孔100 μL，待细胞贴壁后分为对照组、模型组、实验组，每组设置6个复孔。对照组加入含体积分数10%胎牛血清的EGM-2 MV培养基；模型组加入含体积分数10%胎牛血清、30 mmol/L葡萄糖的EGM-2 MV培养基[17]，同时按1∶5比例加入上述高糖组条件培养基；实验组加入含体积分数10%胎牛血清、30 mmol/L葡萄糖的EGM-2 MV培养基，同时按1∶5比例加入上述罗格列酮组条件培养基。
1.4.5 采用MTT法检测细胞增殖能力条件培养基干预24 h后，PBS清洗细胞3次，加入20 μL MTT溶液，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养4 h，终止培养，吸弃上清液，加入150 μL二甲基亚砜，振荡10 min，使用酶标仪检测
490 nm波长处的吸光度值。
1.4.6 Transwell小室实验检测细胞迁移能力条件培养基干预24 h后，消化离心并重悬细胞，将各组细胞以4×107 L-1的细胞浓度铺于Transwell小室上层腔室，每孔200 μL； Transwell小室下层腔室中，对照组加入500 μL EGM-2 MV培养基，模型组加入含30 mmol/L葡萄糖的EGM-2 MV培养基及1∶5比例的高糖组条件培养基，实验组加入含30 mmol/L葡萄糖的EGM-2 MV培养基及1∶5比例的罗格列酮组条件培养基，置于37 ℃、体积分数为5%CO2细胞培养箱中培养6 h，从培养箱中取出小室，擦去小室内底面的细胞，加入40 g/L多聚甲醛固定细胞30 min，PBS清洗3次，进行结晶紫染色，在显微镜下随机观察6个视野迁移至小室滤膜下方的内皮祖细胞数量。
1.5 主要观察指标 ①小鼠内皮祖细胞的培养及鉴定结果；②各组条件培养基中血管内皮生长因子与基质细胞衍生因子1水平；③各组内皮祖细胞的增殖和迁移能力。
1.6 统计学分析实验数据采用SPSS 19.0软件进行t检验和方差分析，每组实验重复3次，结果以x±s表示，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

世界卫生组织(WHO)将糖尿病患者因合并各种不同程度末梢血管病变和神经病变导致的下肢感染、溃疡和/或深部组织破坏，定义为糖尿病足[18]。目前关于糖尿病足的发病机制尚不完全清楚。治疗糖尿病足的措施主要有药物治疗、外科手术与血管腔内治疗等[19-20]，而促进血管生成、加快肢体侧支循环建立，是目前的研究方向[21]。由于间充质干细胞在一定条件下可分化为血管内皮细胞，分泌促血管生成因子，近年来在糖尿病足溃疡创面的应用越来越广泛。目前的动物实验已证实，在使用间充质干细胞移植治疗糖尿病足溃疡创面时，由于高糖、缺血缺氧等环境的影响，移植后的间充质干细胞存活时间较短，因此需要进一步提高干细胞的移植效率[22-23]。例如：柏力等[24]研究采用阿卡地新干预高糖环境下的骨髓间充质干细胞，通过流式细胞实验、Transwell迁移实验等发现阿卡地新可抑制高糖环境下骨髓间充质干细胞的凋亡，改善高糖环境下骨髓间充质干细胞的迁移能力；张昕桐等[25]采用超顺磁性氧化铁纳米颗粒标记原代培养的骨髓间充质干细胞，在磁场作用下能向糖尿病大鼠创面聚集，促进创面愈合。
基于以上研究的启示，该研究选择罗格列酮来保护高糖环境下骨髓间充质干细胞的功能。课题组前期实验已证实罗格列酮对高糖环境下骨髓间充质干细胞具有保护作用，MTT细胞增殖检测结果显示罗格列酮干预组骨髓间充质干细胞的增殖能力明显高于高糖组，说明在高糖环境下罗格列酮干预可促进骨髓间充质干细胞的增殖。Transwell小室实验显示，罗格列酮干预组骨髓间充质干细胞的迁移能力明显高于高糖组，说明在高糖环境下罗格列酮干预可促进骨髓间充质干细胞的迁移运动能力。
内皮祖细胞是血管内皮细胞的前体细胞，存在于外周血与骨髓中[26]，当机体受到缺氧、生长因子或趋化因子的刺激时，其可被动员至循环中，归巢至组织损伤部位，参与血管新生与损伤血管的修复[27]。该实验制备罗格列酮干预高糖环境下骨髓间充质干细胞条件培养基，观察其对内皮祖细胞的活化作用。MTT细胞增殖检测结果显示高糖环境刺激的间充质干细胞条件培养基中内皮祖细胞的增殖能力明显下降，而在罗格列酮干预高糖环境下的骨髓间充质干细胞条件培养基中内皮祖细胞的增殖又得到大幅度提升。Transwell小室实验显示高糖环境刺激的间充质干细胞条件培养基中内皮祖细胞的迁移能力明显下降，而在罗格列酮干预高糖环境下的骨髓间充质干细胞条件培养基中内皮祖细胞的迁移能力又得到大幅度提升，说明罗格列酮干预高糖环境下的骨髓间充质干细胞条件培养基对内皮祖细胞的增殖和迁移具有促进作用。
研究表明，创面生长因子及其受体的减少也是影响糖尿病创面难以愈合的重要因素[28-29]。间充质干细胞的旁分泌功能是其促进血管生成的重要机制，但在高糖环境下间充质干细胞的旁分泌功能受到了严重影响[30]。该研究结果也同样证实在高糖环境下骨髓间充质干细胞分泌血管内皮生长因子与基质细胞衍生因子1的能力显著下降。血管内皮生长因子与基质细胞衍生因子1都是促进内皮祖细胞活化的重要生长因子。研究证实，血管内皮细胞生长因子既可促进内皮祖细胞归巢，也可以抑制内皮祖细胞凋亡，是重要的促血管新生细胞因子；基质细胞衍生因子1可促进缺血部位内皮祖细胞的增殖，促进血管生成[31-32]。经过罗格列酮干预后，高糖环境下骨髓间充质干细胞分泌血管内皮生长因子与基质细胞衍生因子1的水平明显升高，说明罗格列酮干预不仅可保护骨髓间充质干细胞免于高糖刺激的损害，还能提高其旁分泌功能，发挥更好的促血管效应。当然在这一过程中可能会有更多的细胞因子参与其中，还需要进一步的研究。
综上所述，罗格列酮干预的骨髓间充质干细胞条件培养基可促进内皮祖细胞增殖与迁移，接下来将进行动物实验，进一步证实罗格列酮干预的骨髓间充质干细胞对糖尿病下肢缺血创面的修复效果。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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文题释义：#br# 创面愈合过程：机体出现创面后经历炎症期、增殖期和重塑期3个阶段的过程，整个过程涉及创伤部位和周围组织细胞的相互作用。骨髓间充质干细胞在促进皮肤创面愈合方面的贡献比CD45阳性造血细胞和纤维母细胞更大，其主要作用在炎症期后，参与新生的真皮组织形成，且分泌Ⅰ型和Ⅲ型胶原。#br# 糖尿病创面：是典型的难愈性创面，其迁延难愈的原因是在创面基础上常常合并有局部血运、神经的病变。最新研究显示皮肤功能异常也是糖尿病创面难愈的原因，研究表明糖尿病皮肤细胞始终处于高糖环境中，形成一种被称之为糖基化终末产物的蛋白，这种蛋白会引起组织、细胞功能紊乱，影响创面愈合。#br# #br# 摘要#br# 背景：研究表明间充质干细胞可参与修复糖尿病引发的创面损伤，但高糖环境明显抑制了间充质干细胞的功能与移植效果。#br# 目的：观察罗格列酮干预的骨髓间充质干细胞条件培养基对高糖环境下内皮祖细胞增殖、迁移的作用。#br# 方法：①取对数生长期的骨髓间充质干细胞，分3组培养，正常组加入含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养基培养；高糖组加入含体积分数为10%胎牛血清、25 mmol/L葡萄糖的α-MEM培养基培养；罗格列酮组加入含体积分数为10%胎牛血清、25 mmol/L葡萄糖、10 μmol/L罗格列酮的α-MEM培养基培养，培养48 h后提取培养上清作为条件培养基，ELISA法检测条件培养基中血管内皮生长因子与基质细胞衍生因子1水平。②取对数生长期的内皮祖细胞，分3组干预，对照组加入含体积分数为10%胎牛血清的EGM-2 MV培养基；模型组加入含体积分数为10%胎牛血清、30 mmol/L葡萄糖、高糖组条件培养基的EGM-2 MV培养基；实验组加入含体积分数为10%胎牛血清、30 mmol/L葡萄糖、罗格列酮组条件培养基的EGM-2 MV培养基，培养24 h后进行细胞增殖与迁移能力检测。#br# 结果与结论：①高糖组条件培养基中血管内皮生长因子与基质细胞衍生因子1水平明显低于正常组(P < 0.05)，罗格列酮组条件培养基中血管内皮生长因子与基质细胞衍生因子1水平均明显高于高糖组(P < 0.05)；②模型组内皮祖细胞的增殖与迁移能力明显低于对照组(P < 0.05)；实验组内皮祖细胞的增殖与迁移能力高于模型组(P < 0.05)；③结果提示罗格列酮干预的骨髓间充质干细胞条件培养基可促进内皮祖细胞的增殖与迁移。#br#

ORCID:0000-0002-5985-3871(陶贵录) #br#

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程#br#

骨髓间充质干细胞条件培养基加入罗格列酮后促进内皮祖细胞的增殖与迁移

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[1]	林清凡, 解一新, 陈婉清, 叶振忠, 陈幼芳. 人胎盘源间充质干细胞条件培养液可上调缺氧状态下BeWo细胞活力和紧密连接因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 4970-4975.
[2]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[3]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.
[4]	王正东, 黄娜, 陈婧娴, 郑作兵, 胡鑫宇, 李梅, 苏晓, 苏学森, 颜南. 丁酸钠抑制氟中毒可诱导小胶质细胞活化及炎症因子表达增多[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1075-1080.
[5]	汪显耀, 关亚琳, 刘忠山. 提高间充质干细胞治疗难愈性创面的策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1081-1087.
[6]	万然, 史旭, 刘京松, 王岩松. 间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1088-1095.
[7]	廖成成, 安家兴, 谭张雪, 王倩, 刘建国. 口腔鳞状细胞癌干细胞的治疗靶点及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1096-1103.
[8]	谢文佳, 夏天娇, 周卿云, 刘羽佳, 顾小萍. 小胶质细胞介导神经元损伤在神经退行性疾病中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1109-1115.
[9]	李珊珊, 郭笑霄, 尤冉, 杨秀芬, 赵露, 陈曦, 王艳玲. 感光细胞替代治疗视网膜变性疾病[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1116-1121.
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[11]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
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[13]	孔德胜, 何晶晶, 冯宝峰, 郭瑞云, Asiamah Ernest Amponsah, 吕飞, 张舒涵, 张晓琳, 马隽, 崔慧先. 间充质干细胞修复大动物模型脊髓损伤疗效评价的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1142-1148.
[14]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.
[15]	史洋洋, 秦英飞, 吴福玲, 何潇, 张雪静. 胎盘间充质干细胞预处理预防小鼠毛细支气管炎[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 991-995.