褪黑素通过视黄酸相关孤儿受体α可抑制骨髓间充质干细胞的成脂肪分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.19.003

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (19): 2968-2974.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.19.003

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褪黑素通过视黄酸相关孤儿受体α可抑制骨髓间充质干细胞的成脂肪分化

张良明¹，王璇^1，高文杰²，黄东生²，戎利民¹

1中山大学附属第三医院脊柱外科，广东省广州市 510630
2中山大学孙逸仙纪念医院脊柱外科，广东省广州市 510120

修回日期:2014-03-07 出版日期:2014-05-07 发布日期:2014-05-07
通讯作者: 戎利民，医学博士，教授，主任医师，博士生导师，中山大学附属第三医院脊柱外科，广东省广州市 510630
作者简介:张良明，男，1983年生，广东省化州市人，2012年中山大学毕业，医学博士，中山大学附属第三医院脊柱外科医师，主要从事干细胞分化与骨骼系统发育的分子机制研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助(81301524，81171674)；广东省自然科学基金资助(S2013040015484)；高等学校博士学科点专项科研基金资助(20110171110067)

Melatonin inhibits adipogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells through retinoid-related orphan receptor alpha

Zhang Liang-ming¹, Wang Xuan¹, Gao Wen-jie², Huang Dong-sheng², Rong Li-min¹

1Department of Spine Surgery, the Third Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510630, Guangdong Province, China
2Department of Spine Surgery, Sun Yat-sen Memorial Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510120, Guangdong Province, China

Revised:2014-03-07 Online:2014-05-07 Published:2014-05-07
Contact: Rong Li-min, M.D., Professor, Chief physician, Doctoral supervisor, Department of Spine Surgery, the Third Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510630, Guangdong Province, China
About author:Zhang Liang-ming, M.D., Physician, Department of Spine Surgery, the Third Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510630, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81301524, 81171674; the Natural Science Foundation of Guangdong Province, No. S2013040015484; the Specialized Research Fund for the Doctoral Program of Higher Education, No. 20110171110067

摘要/Abstract

摘要：

背景：前期研究发现，褪黑素能够抑制骨髓间充质干细胞向脂肪细胞诱导分化，但其作用机制有待进一步研究。
目的：探索褪黑素是否通过核受体视黄酸相关孤儿受体α介导抑制骨髓间充质干细胞向脂肪细胞诱导分化的作用机制。
方法：无菌采集骨髓样本，采用密度梯度离心结合贴壁培养分离培养人骨髓间充质干细胞，用流式细胞仪鉴定细胞表面表型。然后将细胞分为褪黑素组、CGP52608组和对照组，分别以含褪黑素、CGP52608脂肪维持液和正常的脂肪诱导液进行诱导，用荧光定量PCR和Western blot法检测核受体视黄酸相关孤儿受体α在骨髓间充质干细胞以及其成脂肪分化过程中的表达特征。用受体特异性激活剂CGP52608，考察核受体视黄酸相关孤儿受体α激活状态下，骨髓间充质干细胞成脂肪分化的影响。
结果与结论：原代分离的骨髓间充质干细胞生长旺盛，呈纤维梭状，流式鉴定间充质干细胞表型结果示，CD34 和CD45表达阴性，CD29，CD44与CD105表达阳性。荧光定量PCR发现骨髓间充质干细胞高表达褪黑素核受体视黄酸相关孤儿受体α，而且褪黑素能够呈浓度依赖性促进骨髓间充质干细胞表达视黄酸相关孤儿受体α；Western blot检测结果也证实褪黑素呈浓度依赖性促进视黄酸相关孤儿受体α在蛋白水平的表达。在成脂肪分化过程中，褪黑素在早期明显上调视黄酸相关孤儿受体α表达，但在中后期就维持在相对低水平。最后，用CGP52608激活视黄酸相关孤儿受体α后，骨髓间充质干细胞成脂肪分化被抑制。因此，褪黑素通过核受体视黄酸相关孤儿受体α抑制骨髓间充质干细胞成脂肪分化，褪黑素在调节脂肪细胞分化过程中发挥重要作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 间充质干细胞, 褪黑素, 骨髓, 脂肪细胞, 脂肪分化, 褪黑素受体, 视黄酸相关孤儿受体α, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Our previous studies have demonstrated that melatonin inhibits the adipogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells. However, the mechanism underlying the effect of melatonin on adipogenesis is still unknown.
OBJECTIVE: To determine whether melatonin can inhibit the adipogenesis of bone marrow mesenchymal stem cells through retinoid-related orphan receptor α.
METHODS: Bone marrow mesenchymal stem cells were isolated and purified by density gradient centrifugation combined with cell attachment culture. The phenotype was investigated by flow cytometry. Then, cells were induced for adipogenic differentiation with melatonin, CGP52608 and normal adipose tissue, respectively. The levels of retinoid-related orphan receptor α mRNA and protein were investigated by real-time RT-PCR and western blot assay, respectively. Further, the effect of retinoid-related orphan receptor α on the dipogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells was investigated by CGP52608.
RESULTS AND CONCLUSION: The primary isolated bone marrow mesenchymal stem cells were spindle-shaped fibroblast-like cells. These cells did not express hematopoietic stem cells markers: CD34 and CD45; and highly expressed MSC markers: CD29, CD44, and CD10. The result of RT-PCR demonstrated that melatonin nuclear receptor, retinoid-related orphan receptor α, was highly expressed in bone marrow mesenchymal stem cells and the expression of retinoid-related orphan receptor α was further enhanced by melatonin in a dose-dependent manner, which was confirmed at protein level by western blot assay. During adiogenesis, the expression of retinoid-related orphan receptor α mRNA was up-regulated in the early stage, but maintained at a low level in the mild-later stage. While the retinoid-related orphan receptor α was activated by agonist CGP52608, the adipogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells was inhibited, which was similar to the inhibitory effect of melatonin. Therefore, melatonin inhibited the adipogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells through retinoid-related orphan receptor α, suggesting that melatonin plays an important role in the differentiation of adipocytes.

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Key words: melatonin, receptors, melatonin, orphan nuclear receptors, cell differentiation

中图分类号:

R394.2

张良明，王璇，高文杰，黄东生，戎利民 . 褪黑素通过视黄酸相关孤儿受体α可抑制骨髓间充质干细胞的成脂肪分化[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(19): 2968-2974.

Zhang Liang-ming, Wang Xuan, Gao Wen-jie, Huang Dong-sheng, Rong Li-min . Melatonin inhibits adipogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells through retinoid-related orphan receptor alpha[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(19): 2968-2974.

图/表（结果） 3

2.1 原代骨髓间充质干细胞的形态与鉴定 骨髓稀释液经过密度梯度离心后，骨髓稀释液被分成数层：血清、单个核细胞层、淋巴细胞分离液、血细胞层。小心吸取呈云雾状单个核细胞层进行原代细胞培养。培养早期以悬浮、折光性强的圆形细胞为主，通过换液悬浮细胞逐渐被清除。骨髓间充质干细胞开始时呈散在细胞克隆生长，为梭形纤维状，数量为3-10个不等。细胞克隆逐渐铺长，最后多个克隆细胞融合在一起，形成梭形纤维状细胞单层，细胞排列有方向性，呈平行、漩涡状生长。一般在10-12 d，细胞可以达到80%-90%融合(图1)。体外培养的第3代骨髓间充质干细胞，采用流式细胞仪计算荧光表达率，检测骨髓间充质干细胞的细胞表面CD分子表达情况。造血干细胞表面标记：CD34表达率2.12%，CD45表达率0.27%；间充质干细胞细胞表面标记：CD29表达率94.81%，CD44表达率94.50%，CD105表达率96.36%(图2)。

2.2 视黄酸相关孤儿受体α在骨髓间充质干细胞以及其成脂肪分化过程中的表达特征 荧光定量PCR发现骨髓间充质干细胞高表达视黄酸相关孤儿受体α核受体。视黄酸相关孤儿受体α的4种转录异构体中，只有视黄酸相关孤儿受体α1和视黄酸相关孤儿受体α4在骨髓间充质干细胞上表达，其中以视黄酸相关孤儿受体α4表达最为丰富，其表达量约为视黄酸相关孤儿受体α1的2倍(图3)。视黄酸相关孤儿受体α2和视黄酸相关孤儿受体α3在骨髓间充质干细胞没有表达。

在不同浓度的褪黑素的作用下，骨髓间充质干细胞表达视黄酸相关孤儿受体α的量被上调，而且这种作用随着褪黑素的浓度上升而增强(图4A)。进一步，用Western blot检测视黄酸相关孤儿受体α蛋白水平表达量也证实了褪黑素的这种浓度依赖性作用(图4B)。

在骨髓间充质干细胞成脂肪分化过程中，视黄酸相关孤儿受体α在早期(1，3，6 d)有明显的上调表达(P < 0.05)，在中后期就维持在相对低水平(图5)。褪黑素抑制成脂肪分化的作用可能与此相关。

2.3 褪黑素和视黄酸相关孤儿受体α受体特异性激动剂抑制骨髓间充质干细胞成脂肪分化 CGP52608是视黄酸相关孤儿受体α受体特异性激动剂^[15-16]。在骨髓间充质干细胞成脂肪分化过程中，相对阳性诱导组，CGP52608明显抑制了脂肪细胞形成(图6C)，这和褪黑素抑制脂肪形成的作用类似(图6B)。因此，褪黑素有可能通过核受体视黄酸相关孤儿受体α介导抑制成脂肪分化的作用。

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引言

材料方法

设计：细胞学体外实验。

时间及地点：实验于2012年1月至2013年6月在中山大学附属第三医院中心实验室和孙逸仙纪念医院中心实验室完成实验。

材料：

组织：在知情同意下，抽取8名健康成年志愿者骨髓样本，其中男4名，女4名，年龄20-40岁。实验经过中山大学附属第三医院伦理道德委员会批准。

实验方法：

人骨髓间充质干细胞分离和原代培养：采用密度梯度离心结合细胞贴壁培养的方法分离纯化骨髓间充质干细胞^{[12, 17]}。首先，用PBS按照1∶1的比例稀释骨髓后，小心地将稀释好的骨髓铺到淋巴细胞分离液上面，注意保持二者之间的界限清晰，按照淋细胞分离液∶骨髓稀释液=2∶3的比例。然后，2 000 r/min离心20 min；吸取单个核细胞层，加入PBS清洗，离心去除上清后，加入LD-DMEM完全培养基，种到培养瓶，此后，每3 d换液1次。待细胞90%融合时即可传代。用0.25%胰酶消化细胞，以1∶2比例传代。至3-6代时即可应用于后续的分化诱导及其他试验，剩余细胞冻存备用。

骨髓间充质干细胞细胞表型鉴定：取培养的第3代骨髓间充质干细胞，0.25%胰酶消化细胞，制作单细胞悬液，以3×10⁵细胞分别与抗CD34，CD45，CD29，CD44和CD105抗体于室温下反应30 min。然后，用PBS清洗2次，再与FITC标记的二抗避光反应15 min。将洗涤后的细胞用PBS重悬后，用流式细胞仪检测分析。

实验分组以及骨髓间充质干细胞成脂肪诱导分化：将传代扩增后的骨髓间充质干细胞，按5×10³/cm²密度接种于6孔板中。细胞分为褪黑素组、CGP52608组和对照组。褪黑素组用含100 μmol/L褪黑素的脂肪诱导液(H-DMEM，体积分数10%胎牛血清，1 μmol/L地塞米松，0.5 mmol/L IBMX，10 mg/L牛胰岛素，0.2 mmol/L吲哚美辛)培养3 d后，更换为含100 μmol/L褪黑素的脂肪维持液(H-DMEM，体积分数10%胎牛血清，10 mg/L牛胰岛素)培养1 d，再换成脂肪诱导液培养3 d，如此循环3次后，用脂肪维持液培养至14 d。CGP52608组和对照组在相同的诱导方法下，用含100 nmol/L CGP52608或者不含褪黑素的脂肪诱导液和维持液，诱导骨髓间充质干细胞成脂肪分化至14 d。

油红O染色鉴定脂肪细胞以及脂肪定量测定：在诱导14 d后，用PBS洗涤3次，体积分数10%中性甲醛室温固定1 h，油红O染色1 h，体积分数60%异丙醇稍洗去多余染液，蒸馏水洗，显微镜观察拍照。油红O染色后，PBS洗涤，去水，充分干燥后，用异丙醇萃取脂肪细胞中橙色的脂肪滴，稀释5倍后，酶联免疫检测仪于510 nm处测量萃取液的吸光值。

实时荧光定量PCR检测：将传代扩增后的骨髓间充质干细胞，按5×10³/cm²密度接种于6孔板，细胞达到完全融合后，加入不同浓度的褪黑素(0，50，500 nmol/L，50 μmol/L)培养液，处理48 h后，裂解细胞，采用经典的TRIzol法提取细胞总RNA^[18-19]，反转录成cDNA。用荧光定量PCR仪进行实时荧光定量PCR检测视黄酸相关孤儿受体α以及其4个转录异构体(视黄酸相关孤儿受体α1-4)在骨髓间充质干细胞以及它们在褪黑素作用下的表达变化。

所有的基因表达均以18 s RNA作为内参基因。每个PCR反应做3个重复，每个基因取其平均Ct值。实时荧光大量PCR的结果采用2^-^??Ct法进行数据处理。

Western blot分析：骨髓间充质干细胞种植于6孔板，在含褪黑素的培养基作用3 d后，弃去培养液，PBS洗涤细胞3次。添加100 μL蛋白裂解液，冰上裂解30 min。然后用细胞刮收集细胞裂解液，并转移至1.5 mL离心管。4 ℃条件下12 000 r/min离心30 min，取上清分装至 EP管，置于-80 ℃冰箱保存备用。采用Bradford方法^[20]，按照试剂盒操作方法检测细胞裂解液的总蛋白含量，并对照标准蛋白曲线，计算出样本蛋白浓度。依次配制10%的分离胶和4%的浓缩胶。依据样本的蛋白浓度，准确准备20-50 μg蛋白样品，加入上样缓冲液，沸水煮5 min使蛋白变性。把等量的蛋白样品液体小心加到浓缩胶泳道中，样品两侧的泳道用等体积的上样缓冲液。然后浓缩胶用80 V，电泳20 min，分离胶用180 V，电泳30 min。取出分离胶，制作转膜三明治：黑夹板-海绵-滤纸-胶-PVDF-滤纸-海绵。然后，电压110 V 223 mA，电泳1.5 h。转膜后，用脱脂奶粉 0.7 g/15 mL TBST缓冲液封闭PVDF膜1 h。用脱脂奶粉配制一抗溶液，4 ℃过夜。充分洗涤后，室温下摇床孵育二抗(1∶5 000稀释) 1 h。用ECL发光液均匀铺在PVDF膜上，室温作用2 min，暗室中曝光X射线片后，显影定影。将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和吸光度值。

主要观察指标：褪黑素核受体视黄酸相关孤儿受体α在骨髓间充质干细胞以及其成脂肪分化过程中的表达特征，核受体视黄酸相关孤儿受体α激活对骨髓间充质干细胞成脂肪分化的影响。

统计学分析：采用SPSS 16.0统计软件包(美国SPSS公司)进行统计学处理，数据以x(_)±s表示。多个组别数据比较时，采用单因素方差分析及S-N-K方法分析。两组比较时，采用Student t-test统计学方法分析。以P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

1917年，McCord等^[21]发现牛松果体提取物能使蟾蜍皮肤颜色变浅，首次揭示了褪黑素的生理学活性，标志着褪黑素研究的开始。1959年Lerner等^[22-23]分离纯化并确定了该物质的结构,将其命名为褪黑素，其分子式为C13N2H16O2，化学名称为N-乙酰基-5-甲氧基色胺。此后，褪黑素的研究开始逐渐展开，目前研究表明褪黑素在节律调节、抗肿瘤、抗氧化等多方面发挥重要作用^[24-28]。除大脑松果体外，骨髓细胞也能合成和分泌褪黑素，并在维持骨髓功能中有重要意义^[7-8]。作者前期的研究也发现褪黑素能抑制骨髓间充质干细胞成脂肪分化，但其作用机制不明^[12]。实验将首次探讨褪黑素是否通过其核受体视黄酸相关孤儿受体α抑制间充质干细胞成脂肪分化。

研究证实，褪黑素在脂肪细胞分化和代谢中发挥重要作用。在松果体切除的兔子模型，血清褪黑素水平维持在很低水平，脂肪分解代谢明显减少，同时脂肪细胞的形成比例增加^[29]，而且每天晚上给予褪黑素能显著抑制兔子腹部脂肪组织的积蓄^[30]。在体外，褪黑素膜受体在脂肪组织有表达，而且长期褪黑素干预能通过膜受体降低葡萄糖转运蛋白4的表达和糖的摄取，从而调节脂肪的代谢^[31]。此外，褪黑素能促进兔子脂肪细胞表达瘦素，当以一种生理节律形式给予褪黑素干预时，这种促进作用会被进一步放大，从而调节身体脂肪和能量的代谢^[32]。最近，褪黑素还被报道能够抑制前脂肪细胞3T3L1细胞向脂肪细胞分化成熟^[33]。在作者也发现褪黑素明显抑制骨髓间充质干细胞成脂肪分化。因此，褪黑素在脂肪细胞的生理作用中起着负调节的作用。

褪黑素通过以下几个途径发挥作用^[25-26^，^34-35]。首先，与细胞表面膜受体结合，这是目前褪黑素机制研究中涉及最多最为深入的一种作用途径。其次，直接和细胞内的相关蛋白结合，或者清除自由基发挥抗氧化作用。此外，褪黑素还被发现有核受体视黄酸相关孤儿受体α并通过其结合而起作用。作者前期的研究发现褪黑素抑制骨髓间充质干细胞成脂肪分化，但其作用并不通过膜受体起作用^[12]。

核受体视黄酸相关孤儿受体α是一种核受体类型转录因子，其表达广泛，包括肝，脑，骨骼肌，肺等，在组织的分化和发育中发挥重要作用^[13^，^36]。视黄酸相关孤儿受体α包括4个不同的转录异构体，这些不同的异构体在各个组织中的表达情况不一^[13^，^36]。在骨髓间充质干细胞中，实验发现视黄酸相关孤儿受体α1和视黄酸相关孤儿受体α4都有表达，其中视黄酸相关孤儿受体α4的表达水平约是视黄酸相关孤儿受体α1的2倍，但视黄酸相关孤儿受体α2和视黄酸相关孤儿受体α3转录异构体未能检测到表达，这些表达特征和其在人脂肪细胞的表达特征类似^[37]。视黄酸相关孤儿受体α在早期研究中被认为是个孤儿核受体，但目前已有研究证实褪黑素是体内天然的视黄酸相关孤儿受体α受体的特异性配体^[14-16]。在作者发现褪黑素核受体视黄酸相关孤儿受体α在骨髓间充质干细胞以及其成脂肪分化过程中高表达，并且褪黑素的作用下，视黄酸相关孤儿受体α在成脂肪分化的早期被明显上调，但在中后期就维持在一个平稳水平，这提示褪黑素有可能通过视黄酸相关孤儿受体α受体而调节脂肪分化过程。

视黄酸相关孤儿受体α在脂肪形成过程中发挥重要作用。Duez等^[37]发现视黄酸相关孤儿受体α在人脂肪组织高表达，并在3T3L1细胞中过表达视黄酸相关孤儿受体α能抑制其脂肪分化，而敲除该基因后能显著促进脂肪分化。Ohoka等^[38]作了更深入研究，发现视黄酸相关孤儿受体α能通过抑制CCAAT 增强子结合蛋白β活性(并不影响其表达)而抑制成脂肪关键转录因子过氧化物酶体增殖物活化受体γ和CCAAT 增强子结合蛋白α的表达，从而抑制3T3L1细胞成脂肪分化。在视黄酸相关孤儿受体α对骨髓间充质干细胞成脂肪分化方面，目前还缺乏研究。作者化学合成的噻唑烷二酮类药物CGP52608(视黄酸相关孤儿受体α受体特异性激活剂)，被用来模拟褪黑素激活视黄酸相关孤儿受体α受体作用^[15-16]。在间充质干细胞成脂肪分化过程中，CGP52608特异性激活视黄酸相关孤儿受体α受体后，脂肪分化被明显抑制，这和褪黑素作用类似，表明褪黑素可能和CGP52608一样，是通过激活视黄酸相关孤儿受体α核受体而介导抑制脂肪分化的作用。

因此表明，视黄酸相关孤儿受体α核受体在骨髓间充质干细胞以及其成脂肪分化过程中高表达，并且褪黑素可以通过激活视黄酸相关孤儿受体α核受体而抑制骨髓间充质干细胞成脂肪分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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褪黑素通过视黄酸相关孤儿受体α可抑制骨髓间充质干细胞的成脂肪分化

Melatonin inhibits adipogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells through retinoid-related orphan receptor alpha

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