姜黄素激活自噬干预非酒精性脂肪肝病模型大鼠氧化应激及炎症反应

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2505

中国组织工程研究 ›› 2020, Vol. 24 ›› Issue (11): 1720-1725.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2505

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姜黄素激活自噬干预非酒精性脂肪肝病模型大鼠氧化应激及炎症反应

吴鹏波^1，2，宋琪^1，2，俞媛洁^1，2，饶倩^1，2，张国³，郭一天^1，2，谭诗云^1，2

¹武汉大学人民医院消化内科，湖北省武汉市 430060；²消化系疾病湖北省重点实验室，湖北省武汉市 430060；³广西壮族自治区人民医院消化内科，广西壮族自治区南宁市 530000

收稿日期:2019-03-26 修回日期:2019-04-02 接受日期:2019-07-05 出版日期:2020-04-18 发布日期:2020-02-28
通讯作者: 谭诗云，博士，教授，武汉大学人民医院消化内科，湖北省武汉市 430060；消化系疾病湖北省重点实验室，湖北省武汉市 430060
作者简介:吴鹏波，男，1986年生，湖北省崇阳县人，汉族，2016年武汉大学毕业，博士，主治医生，主要从事非酒精性脂肪肝病研究。
基金资助:
中央部属高校青年教师资助项目(2042017kf0099)；湖北省自然科学基金(2018CFB236); 湖北省卫生和计划生育委员会面上项目(WJ2017M019)

Curcumin ameliorates inflammatory reaction and oxidative stress through activation of autophagy in experimental non-alcoholic fatty liver disease rats

Wu Pengbo^{1, 2}, Song Qi^{1, 2}, Yu Yuanjie^{1, 2}, Rao Qian^{1, 2}, Zhang Guo³, Guo Yitian^{1, 2}, Tan Shiyun^{1, 2}

¹Department of Digestion, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei Province, China; ²Hubei Provincial Key Laboratory of Digestive Diseases, Wuhan 430060, Hubei Province, China; ³Department of Digestion, the People’s Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning 530000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2019-03-26 Revised:2019-04-02 Accepted:2019-07-05 Online:2020-04-18 Published:2020-02-28
Contact: Tan Shiyun, MD, Professor, Department of Digestion, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei Province, China; Hubei Provincial Key Laboratory of Digestive Diseases, Wuhan 430060, Hubei Province, China
About author:Wu Pengbo, MD, Attending physician, Department of Digestion, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei Province, China; Hubei Provincial Key Laboratory of Digestive Diseases, Wuhan 430060, Hubei Province, China
Supported by:
the Funding Project for Young University Teachers, No. 2042017kf0099; the Natural Science Foundation of Hubei Province, No. 2018CFB236; the General Project of Hubei Provincial Health and Family Planning Commission, No. WJ2017M019

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
核因子κB：是一种具有多向性调节作用的蛋白质因子，不仅可介导肿瘤坏死因子α及白细胞介素6等多种炎性递质转录表达，还通过调控凋亡相关蛋白表达参与细胞凋亡的调控，它与炎性反应、氧化应激存在十分密切的联系。
非酒精性脂肪肝病：是指除酒精和病毒等明确因素外所致的肝脏内脂肪异常蓄积为主要特征的一种临床病理综合征。它可以进展为肝纤维化和肝硬化，甚至肝癌；增加糖尿病以及心血管疾病罹患风险。其发病与炎症反应，氧化应激紧密相关。

背景：自噬、氧化应激及炎症反应在非酒精性脂肪肝病中扮演重要角色，姜黄素具有调节自噬、氧化应激及炎症反应等生物活性。

目的：探讨姜黄素对非酒精性脂肪肝病大鼠模型保护作用以及机制研究。

方法：高糖高脂饮食8周建立非酒精性脂肪肝病大鼠模型，将40只SD大鼠分成对照组、模型组、姜黄素治疗组、姜黄素+3-甲基腺嘌呤组。在第8周末开始干预，对照组和模型组给予PBS灌胃，姜黄素组给予姜黄素500 mg/(kg·d)灌胃，姜黄素+3-甲基腺嘌呤组给予姜黄素500 mg/(kg·d)灌胃及2 mg/(kg·d)自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤腹腔注射，干预8周。检测大鼠血清丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶及总三酰甘油、总胆固醇、空腹血糖浓度；油红O染色观察各组大鼠肝内细胞脂滴分布，透射电镜观察肝细胞线粒体超微结构；采用硫代巴比妥酸法及黄嘌呤氧化酶法测定丙二醛及超氧化物歧化酶活性；Western blot检测自噬及炎症相关蛋白P62、LC3Ⅱ、Beclin-1、NF-κB的表达。实验方案经武汉大学人民医院动物实验伦理委员会批准(批准号2018-541)。

结果与结论：①大鼠血清丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶及总三酰甘油、总胆固醇水平：模型组均高于对照组(P < 0.05)，姜黄素治疗组显著低于模型组(P < 0.05)，姜黄素+3-甲基腺嘌呤组高于姜黄素治疗组但低于模型组(均<0.05)；②细胞脂质沉积：模型组明显多于对照组；姜黄素治疗组明显少于模型组，姜黄素+3-甲基腺嘌呤组明显高于姜黄素治疗组但低于模型组；③透射电镜观察发现对照组未见明显线粒体损伤，模型组线粒体明显水肿，嵴断裂或消失等，姜黄素可显著缓解线粒体损伤，姜黄素+3-甲基腺嘌呤组对线粒体损失在模型组及姜黄素之间；④肝组织内超氧化物歧化酶水平：模型组显著低于对照组，姜黄素治疗组显著高于模型组，姜黄素+3-甲基腺嘌呤组显著低于姜黄素治疗组但高于模型组；⑤肝组织丙二醛水平：模型组显著高于对照组，姜黄素治疗组显著低于模型组，姜黄素+3-甲基腺嘌呤组显著高于姜黄素治疗组但低于模型组；⑥Western blot检测：与对照组相比, 模型组肝组织P62、NF-κB蛋白表达均增加，而Beclin-1、LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ均降低(P均< 0.05)，经姜黄素治疗后P62、NF-κB蛋白表达均降低，而Beclin-1、LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ增加；姜黄素+3-甲基腺嘌呤组P62、NF-κB蛋白表达均低于模型组但高于姜黄素组，而Beclin-1、LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ高于模型组但低于姜黄素组，差异均有显著性意义(P均< 0.05)；⑦结果说明，姜黄素通过激活自噬调节炎症反应及氧化应激而改善非酒精脂肪肝病大鼠模型脂肪变性。

ORCID: 0000-0003-0959-8929(吴鹏波)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 姜黄素, 非酒精性脂肪肝病, 自噬, 炎症反应, 氧化应激

Abstract:

BACKGROUND: Autophagy, oxidative stress and inflammatory reactions play an important role in non-alcoholic fatty liver disease. Curcumin has biological activities such as regulating autophagy, oxidative stress and inflammatory reaction.

OBJECTIVE: To explore the effect and underlying mechanism of curcumin on experimental non-alcoholic fatty liver disease rats.

METHODS: Non-alcoholic fatty liver model was established in rats fed 8-week high-fat diets. Forty healthy SPF male Sprague-Dawley rats were randomly divided into control group, model group, curcumin treatment group, and curcumin and 3-methyladenine (3-MA, an autophagic flux blocker) treatment group. At the end of 8 weeks of high-fat diet, control and model groups were given PBS intragastrically, curcumin treatment group given curcumin 500 mg/kg per day intragastrically, and curcumin+3-MA given curcumin 500 mg/kg per day intragastrically and 3-MA 2 mg/kg per day intraperitoneally. The interventions in each group were given for 8 continuous weeks. The biochemical parameters including serum alanine aminotransferase, aspartate aminotransferase, total triglyceride, total cholesterol, fasting blood glucose level were measured in rats. Oil red O staining was used to characterize the change of hepatic pathology. The ultrastructure of mitochondria was examined by transmission electron microscopy. The hepatic malondialdehyde level and superoxide dismutase activity were measured by thiobarbituric acid method and xanthine oxidase method, respectively. Western blot assay was performed to detect the expression level of autophagic molecular signals including P62, Beclin, LC3B and nuclear factor-κB. The experimental protocol was approved by the Animal Ethic Committee of Renmin Hospital of Wuhan University (approval No. 2018-541).

RESULTS AND CONCLUSION: The serum alanine aminotransferase, aspartate aminotransferase, total triglyceride, and total cholesterol levels were significantly higher in the model group than the control group (P < 0.05). Compared with the model group, curcumin significantly decreased the levels of serum alanine aminotransferase, aspartate aminotransferase, total triglyceride, and total cholesterol (P < 0.05), but this effect was partly inhibited by 3-MA (P < 0.05). There was more cellular lipid deposition in the model group than the control group. Compared with the model group, curcumin significantly decreased cellular lipid deposition, but the decrease was partly inhibited by 3-MA. Compared with the control group, mitochondrial edema and cristae rupture (or even completely disappearing) were easily found in the model group. Curcumin significantly attenuated mitochondrial injury, which was partly inhibited by 3-MA. Hepatic superoxide dismutase activity in the model group was significantly lower than that in control group, and it significantly increased after curcumin treatment. The hepatic superoxide dismutase activity in the curcumin+3-MA group was higher than that in model group but lower than that in the curcumin group. Hepatic malondialdehyde level in the model group was higher than that in the control group, and it significantly decreased after curcumin treatment. Whereas the hepatic malondialdehyde level in the curcumin+3-MA group was lower than that in model group but higher than that in the curcumin group. Compared with the control group, the model group showed significantly increased expressions of P62, nuclear factor-κB but decreased expressions of Beclin-1 and LC3II/LC3I (all P < 0.05). Curcumin significantly decreased the expressions of P62 and nuclear factor -κB and increased the expressions of Beclin-1 and LC3II/LC3I; however, these changes were partly inhibited by 3-MA (all P < 0.05). Therefore, curcumin can effectively prevent hepatic steatosis in experimental non-alcoholic fatty liver disease rats by regulating inflammatory reaction and oxidative stress via activation of autophagy.

Key words: curcumin, non-alcoholic fatty liver disease, autophagy, inflammatory reaction, oxidative stress

中图分类号:

吴鹏波, 宋琪, 俞媛洁, 饶倩, 张国, 郭一天, 谭诗云. 姜黄素激活自噬干预非酒精性脂肪肝病模型大鼠氧化应激及炎症反应[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(11): 1720-1725.

Wu Pengbo, Song Qi, Yu Yuanjie, Rao Qian, Zhang Guo, Guo Yitian, Tan Shiyun. Curcumin ameliorates inflammatory reaction and oxidative stress through activation of autophagy in experimental non-alcoholic fatty liver disease rats [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2020, 24(11): 1720-1725.

图/表（结果） 6

2.1 实验动物数量分析实验选用大鼠40只，实验过程无脱失，全部进入结果分析。

2.2 姜黄素对大鼠血清丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶及总三酰甘油、总胆固醇、空腹血糖影响与对照组相比，模型组丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶及总三酰甘油、总胆固醇显著升高(P均< 0.05)；姜黄素治疗组丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶及总三酰甘油、总胆固醇显著降低(P < 0.05)。姜黄素+3-甲基腺嘌呤组大鼠血清丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶及总三酰甘油、总胆固醇显著低于模型组但高于对照组，差异均有统计学意义，空腹血糖在各组组间差异无显著性意义。见表1。

2.3 姜黄素对非酒精性脂肪肝大鼠肝内脂肪沉积的影响大鼠肝脏O油染色显示，对照组仅有少量的脂肪变性；模型可见大量的肝细胞脂肪变性；与模型组相比姜黄素治疗组及姜黄素+3-甲基腺嘌呤组大鼠肝内脂肪沉积明显减少；与姜黄素治疗组比，姜黄素+3-甲基腺嘌呤组大鼠肝内脂肪沉积明显增加。见图1。

2.4 姜黄素对非酒精性脂肪肝大鼠肝内丙二醛含量及超氧化物歧化酶活力的影响见图2。

与对照组相比，模型组肝组织内丙二醛含量显著增加(P < 0.01)；与模型组相比，姜黄素治疗组及姜黄素+3-甲基腺嘌呤组肝组织内丙二醛含量显著降低(P < 0.01)，姜黄素+3-甲基腺嘌呤组丙二醛含量显著高于姜黄素治疗组 (P < 0.05)，差异均有显著性意义；与对照组相比，模型组肝组织内超氧化物歧化酶活力显著降低(P < 0.01)；与模型组相比，姜黄素治疗组及姜黄素+3-甲基腺嘌呤组肝组织内超氧化物歧化酶活力显著增加(P < 0.01)，姜黄素+3-甲基腺嘌呤组超氧化物歧化酶活力显著低于姜黄素治疗组 (P < 0.05)，差异均有显著性意义。

2.5 姜黄素对非酒精性脂肪肝大鼠肝细胞线粒体影响见图3。根据细胞内线粒体水肿情况判断细胞氧化应激损伤情况。对照组大鼠肝细胞线粒体无明显水肿，嵴完整；模型组大鼠肝细胞线粒体明显水肿，嵴断裂或甚至完全消失；与模型组相比，姜黄素治疗组及姜黄素+3-甲基腺嘌呤组的大鼠肝细胞线粒体水肿明显缓解，嵴较少出现断裂或消失；姜黄素+3-甲基腺嘌呤组缓解作用弱于姜黄素治疗组。

2.6 姜黄素对非酒精性脂肪肝病大鼠肝组织自噬、炎症蛋白表达影响　见图4。

与对照组相比, 模型组肝组织P62、NF-κB蛋白表达均增加，而Beclin-1、LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ均降低(P均< 0.05)，经姜黄素治疗后P62、NF-κB蛋白表达均降低，而Beclin-1、LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ增加；姜黄素+3-甲基腺嘌呤组P62、NF-κB蛋白表达均低于模型组但高于姜黄素组，而Beclin-1、LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ高于模型组但低于姜黄素组，差异均有显著性意义(P均< 0.05)。

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引言

材料方法

1.1 设计动物分组对照观察。

1.2 时间及地点实验于2013年5月至2018年12月在消化系疾病湖北省重点实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 动物　SPF级健康成年雄性SD大鼠40只，由武汉大学动物实验中心提供；许可证号：SCXK(鄂)2016-0005。体质量180-190 g，姜黄素购于Sigma公司。自制高糖高脂饲料(82.5%基础饲料，2%胆固醇，0.5%胆酸钠，5%蔗糖，10%猪油)。

1.3.2 主要材料自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)、NF-κB、Beclin-1、LC3II抗体购于Sigma公司；P62购于武汉博士德生物有限公司；丙二醛, 超氧化物歧化酶购于南京建成生物有限公司(生产品号：20140017，20140026)、三酰甘油、总胆固醇、空腹血糖、天冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶购于南京建成生物有限公司。

1.4 实验方法　

1.4.1 建立非酒精性脂肪肝病大鼠模型随机将大鼠分对照组，模型组，姜黄素组，姜黄素+3-甲基腺嘌呤组，每组大鼠10只，适应性饲养1周。模型组、姜黄素组及姜黄素+3-甲基腺嘌呤组高糖高脂饲养制造非酒精性脂肪病模型，造模方法为高糖高脂饲料饲养8周，在8周末随机处死造模老鼠获取肝脏染色观察是否存在脂肪病变以验证造模是否成功。对照组正常饲料饲养8周，在第8周末开始干预，对照组和模型组给予PBS灌胃，姜黄素给药浓度参考文献[6]。姜黄素组给予姜黄素500 mg/(kg·d)灌胃，姜黄素+3-甲基腺嘌呤组给予姜黄素500 mg/(kg·d)灌胃及 2 mg/(kg·d)3-甲基腺嘌呤腹腔注射，各组大鼠干预8周。在第16周末早晨空腹所有大鼠静脉麻醉，腹主动脉采血，分离肝脏制作标本供油红O染色及电镜用。

1.4.2 血清指标检测采用酶联免疫双抗体夹心法测定血清中丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶及总三酰甘油、总胆固醇；氧化酶法空腹血糖浓度。

1.4.3 各组大鼠肝内细胞脂滴分布将肝脏用40 g/L多聚甲醛固定，组织切片油红O染液染色10 min，观察后半定量分析。

1.4.4 肝细胞线粒体超微结构用预冷的4%戊二醛固定大小为1 mm×1 mm×1 mm肝组织新鲜肝脏组织，PBS充分漂洗后1%饿酸固定，用乙醇及丙酮脱水后包埋，经醋酸铀-硝酸铅双重染色，进行透射电镜观察线粒体微结构。

1.4.5 大鼠肝脏丙二醛水平及超氧化物歧化酶活力检测将肝脏充分碾磨并裂解液裂解，考马斯亮蓝染色法测定蛋白含量。提取裂解液上清液采用硫代巴比妥酸法及黄嘌呤氧化酶法测定丙二醛及超氧化物歧化酶活性。

1.4.6 Western blot检测肝组织P62、NF-κB、Beclin-1、LC3蛋白表达将肝脏用蛋白充分碾磨并用裂解液裂解制作蛋白样品，在聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离蛋白，转膜后牛奶封闭抗体。经过一抗孵育后加入二抗，显影半定量分析各蛋白表达量。

1.5 主要观察指标 ①大鼠血清丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶及总三酰甘油、总胆固醇、空腹血糖浓度；②肝内细胞脂滴分布；③肝细胞线粒体超微结构；④肝脏丙二醛水平及超氧化物歧化酶活力；⑤肝组织P62、NF-κB、Beclin-1、LC3蛋白表达。

1.6 统计学分析采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，计量资料以x(_)±s表示，组间比较采用单因素方差分析, P < 0.05表示差异有显著性意义。

讨论

姜黄素是从植物姜黄块茎中提炼出来药物单体，被证实具有调节炎症及氧化应激等多种生物学功能^[5]，而炎症反应、氧化应激是非酒精性脂肪肝病发生发展的病理生理学基础^[1]。国内外学者对姜黄素在非酒精性脂肪肝病治疗方面进行大量研究，研究均认为姜黄素可有效缓解非酒精性脂肪肝病脂肪病变^[6-9]，其机制可能与减少肝细胞凋亡、缓解线粒体损伤、调节肠道菌群、调节机体脂肪因子分泌等有关^[6^，^8-9]。文章研究发现姜黄素可有效治疗非酒精性脂肪肝病，姜黄素可抑制肝组织NF-κB蛋白表达，抑制肝脏内丙二醛和增加超氧化物歧化酶表达，缓解线粒体损伤，提示姜黄素能够有效缓解非酒精性脂肪肝病氧化应激及炎性反应有关。姜黄素和自噬抑制剂联合给药发现姜黄素对肝脏炎性反应及氧化应激作用削弱，提示姜黄素可能通过上调自噬削弱非酒精性脂肪肝病肝脏炎性反应及氧化应激。

NF-κB是一种具有多向性调节作用的蛋白质因子，不仅可介导肿瘤坏死因子α及白细胞介素6等多种炎性递质转录表达，还通过调控凋亡相关蛋白表达参与细胞凋亡的调控^[10]。在肝脏组织中，NF-κB与肝脏的炎性反应、氧化应激存在十分密切的联系^[11-14]，在非酒精性脂肪病的发生发展过程中NF-κB起到了非常重要的作用^[15]。此次研究发现模型组NF-κB表达高于对照组，经姜黄素治疗后NF-κB表达降低。中国学者研究发现姜黄素可通过抑制NF-κB表达治疗溃疡性结肠炎^[16]。综上所述，姜黄素通过抑制NF-κ表达治疗非酒精性脂肪肝。

生理情况下机体氧化应激和抗氧化应激系统处于稳态平衡状态，即体内产生以丙二醛为代表的氧化物质以及超氧化物歧化酶为代表的保护性抗氧化物质处于动态平衡状态。因此，丙二醛和超氧化物歧化酶是机体内氧化应激的重要分子标记^[17-18]。此次研究发现与对照组相比，模型组肝组织内丙二醛含量显著增加；与模型组相比，姜黄素治疗组肝组织内丙二醛含量显著降低；与对照组相比，模型组肝组织内超氧化物歧化酶活力显著降低；与模型组相比，姜黄素治疗组肝组织内超氧化物歧化酶活力显著增加。线粒体损伤是氧化应激又一重要标记，当出现氧化应激时线粒体出现肿胀，出现空泡化以及线粒体嵴中断^[19-21]。结果发现对照组细胞线粒体未见明显肿胀、空泡化、嵴断裂，模型组线粒体明显肿胀、空泡化、嵴断裂，姜黄素治疗组细胞线粒体肿胀、空泡化、嵴断裂明显缓解。上述研究提示氧化应激损伤是非酒精性脂肪肝病重要病理生理学基础，姜黄素可通过作用丙二醛，超氧化物歧化酶和缓解线粒体损伤减轻非酒精性脂肪肝病氧化应激。

在探索姜黄素对非酒精性脂肪肝病保护作用的同时，一种新的细胞程序化死亡方式—细胞自噬进入了研究者的视线。自噬是细胞利用溶酶体降解身受损细胞器和大分子物质的过程，它参与非酒精性脂肪肝的发生发展^[2^，^22-28]。此次研究通过电镜检测自噬及蛋白印迹法检测Beclin-1、LC3Ⅱ及P62自噬相关蛋白发现与对照组相比，模型组大鼠肝组织自噬水平明显下降，姜黄素治疗模型组大鼠后肝组织自噬水平显著上升。为了进一步探讨姜黄素是否通过激活自噬调节非酒精性脂肪肝大鼠肝脏炎症反应、氧化应激以及细胞凋亡，实验中加入了姜黄素+3-甲基腺嘌呤组。研究结果表明抑制自噬后削弱了姜黄素对炎症反应、氧化应激抑制作用。

总之，多项研究自噬、炎症反应、氧化应激是非酒精性脂肪肝病的病理生理学基础。研究通过高糖高脂饮食建立非酒精性脂肪肝大鼠模型，证实姜黄素可有效改善非酒精性脂肪肝大鼠模型肝脏脂肪变性并对其机制进行了深入的探讨。研究结果表明，姜黄素通过激活自噬调控炎症反应、氧化应激改善非酒精脂肪肝病大鼠模型脂肪变性，然而其确切机制值得进一步研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

姜黄素激活自噬干预非酒精性脂肪肝病模型大鼠氧化应激及炎症反应

Curcumin ameliorates inflammatory reaction and oxidative stress through activation of autophagy in experimental non-alcoholic fatty liver disease rats

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