脂多糖与变形链球菌刺激牙髓干细胞中Toll样受体4的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0668

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (33): 5333-5337.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0668

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

脂多糖与变形链球菌刺激牙髓干细胞中Toll样受体4的表达

刘影¹，高杰²，吴补领^3，4

¹南方医科大学口腔医院(广东省口腔医院)，广东省广州市 510280；²广州医科大学口腔医学院，广东省广州市 510182；³南方医科大学口腔医学院，广东省广州市 510515；⁴南方医科大学南方医院口腔科，广东省广州市 510515

修回日期:2018-07-21 出版日期:2018-11-28 发布日期:2018-11-28
通讯作者: 吴补领，主任医师，教授，博士，南方医科大学口腔医学院，广东省广州市 510515；南方医科大学南方医院口腔科，广东省广州市 510515
作者简介:刘影，1985年生，山东省济南市人，汉族，2009年南方医科大学毕业，博士，主要从事牙体牙髓专业研究。
基金资助:
广东省自然科学基金项目(2015A030310071)；广东省医学科学技术研究基金项目(A2016212)

Expression of Toll-like receptor 4 in dental pulp stem cells under the stimulation of lipopolysaccharide and Streptococcus mutans

Liu Ying¹, Gao Jie², Wu Bu-ling^{3, 4}

¹Stomatological Hospital of Southern Medical University & Guangdong Provincial Stomatological Hospital, Guangzhou 510280, Guangdong Province, China; ²School of Stomatology, Guangzhou Medical University, Guangzhou 510182, Guangdong Province, China; ³School of Stomatology, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China; ⁴Department of Stomatology, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China

Revised:2018-07-21 Online:2018-11-28 Published:2018-11-28
Contact: Wu Bu-ling, MD, Chief physician, Professor, School of Stomatology, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China; Department of Stomatology, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China
About author:Liu Ying, MD, Stomatological Hospital of Southern Medical University & Guangdong Provincial Stomatological Hospital, Guangzhou 510280, Guangdong Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Guangdong Province, No. 2015A030310071; the Medical Science and Technology Research Foundation of Guangdong Province, No. A2016212

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
牙髓干细胞：2000年由Gronthos等首次从人牙髓组织中分离培养并命名。实验表明，牙髓干细胞的免疫表型与骨髓基质干细胞相似，可以形成分散而致密的矿化结节，并且将细胞移植至免疫缺陷小鼠皮下后，可以形成牙髓牙本质复合体样结构。由于其具有高度的自我更新能力和多向分化能力，为牙髓组织的修复和再生提供了新的思路，被认为是牙髓再生的种子细胞。但牙髓干细胞在牙髓天然免疫反应中的研究较少，其作用机制也尚不明确。
Toll样受体4：作为第一个被鉴定的人类Toll样受体，是脂多糖跨膜信号转导的关键受体，亦是机体激活固有免疫对抗病原微生物的重要因素。Toll样受体4可以广泛识别各种病原体刺激物，如革兰阴性菌胞壁成分脂多糖、热休克蛋白、纤维蛋白原、呼吸道病毒、肝素等。Toll样受体4广泛表达在单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞以及内皮细胞和上皮细胞等参与天然免疫的细胞。这些细胞是抵御侵入机体的病原微生物的首道防线。免疫组织化学方法发现健康牙髓组织成牙本质细胞层Toll样受体4阳性表达，部分牙髓内血管可见环状着色，血管内有阳性细胞存在。牙髓内部未见或偶见Toll样受体4阳性细胞。在小鼠的实验性龋坏模型中也同样发现巨噬细胞和树突样细胞表达Toll样受体4。

摘要
背景：深龋状态下牙髓干细胞受到细菌刺激后分化为成牙本质细胞并分泌形成修复性牙本质保护牙髓的过程，被认为是牙髓组织参与的天然免疫反应过程，Toll样受体4作为人体最为重要的免疫受体在此过程中的作用并不明确。
目的：探讨深龋状态下脂多糖及变形链球菌提取物对牙髓干细胞Toll样受体 4的作用。
方法：培养原代牙髓干细胞后，Toll样受体4的激动剂脂多糖及主要致龋菌变形链球菌提取物刺激牙髓干细胞24 h，RT-PCR检测牙髓干细胞中Toll样受体4 mRNA表达，Western blot及细胞免疫荧光检测牙髓干细胞中Toll样受体4蛋白表达。
结果与结论：与空白对照组相比，脂多糖及变形链球菌提取物刺激后，牙髓干细胞中Toll样受体4 mRNA及蛋白表达量均显著增加，提示Toll样受体4参与了深龋状态下牙髓干细胞的天然免疫反应。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-7073-1966(刘影)

关键词: 牙髓干细胞, Toll样受体4, 脂多糖, 变形链球菌, 天然免疫反应, 干细胞

Abstract:

BACKGROUND: During the process of deep caries, dental pulp stem cells (DPSCs) are induced to differentiate into odontoblast-like cells after bacterial stimulation, forming reparative dentin to protect pulp tissues. It is considered to be an important part of innate immune response of dental pulp. However, the role of Toll-like receptor 4 (TLR4) as the most important receptor of innate immune response is not clear.
OBJECTIVE: To study the expression of TLR4 with the stimulation of lipopolysaccharide and Streptococcus mutans during deep caries.
METHODS: Primary cultured DPSCs were stimulated by lipopolysaccharide and Streptococcus mutans extract for 24 hours. RT-PCR was then performed to test the expression of TLR4 mRNA. Western blot and immunocytochemical staining were performed to test the expression of TLR4 protein in DPSCs.
RESULTS AND CONCLUSION: Stimulations with lipopolysaccharide and Streptococcus mutans extract significantly up-regulated the mRNA and protein expression of TLR4, indicating TLR4 is involved in the innate immune response of DPSCs in the case of deep caries.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Dental Pulp, Stem Cells, Lipopolysaccharides, Streptococcus mutans, Toll-Like Receptor 4, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

刘影，高杰，吴补领. 脂多糖与变形链球菌刺激牙髓干细胞中Toll样受体4的表达[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(33): 5333-5337.

Liu Ying, Gao Jie, Wu Bu-ling. Expression of Toll-like receptor 4 in dental pulp stem cells under the stimulation of lipopolysaccharide and Streptococcus mutans[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(33): 5333-5337.

图/表（结果） 1

参考文献

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引言

材料方法

1.1 设计 细胞学体外实验。

1.2 时间及地点 实验于2013年9月至2014年9月在南方医科大学南方医院临床医学实验研究中心完成。

1.3 材料

1.3.1 标本 取自南方医科大学南方医院口腔颌面外科，18-26岁健康人因正畸或阻生而拔除的健康、完整、无龋坏的牙齿30颗(经患者本人及家属知情同意)。拔除前彻底消毒，拔出后沿釉牙骨质界面用高速手机环绕牙颈部磨出2 mm深度的沟槽，即刻放入预冷的含有1%双抗的不完全培养基中储存。

1.3.2 实验试剂及仪器 TLR4一抗(Abcom公司)；二抗试剂盒(中杉金桥)；DAPI(博士德)；变形链球菌UA159(中山大学)；DMEM、胎牛血清(Hocolny公司)；Ⅰ型胶原酶、二甲基亚砜、脂多糖(Sigma公司)；RNAiso Plus、RT-PCR试剂盒、SYBR Green PCR 试剂盒(Takara公司)；蛋白浓度检测试剂盒(Sigma公司)；0.22 μm滤器(Corning公司)；7500 PCR仪(ABI公司)；超声破碎仪(Rongyan公司)；CO₂培养箱(Shellab公司)；生物安全柜(Biobase公司)；倒置相差显微镜及照相系统(Olympus公司)；分光光度计(NanoDrop)。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞原代培养 在无菌环境下，超净台内将牙齿从培养基中取出，用含双抗的PBS冲洗3遍，将牙齿沿沟槽劈开，取出牙髓，去除根尖2 mm的牙髓组织，置于PBS内反复漂洗至少3次。根据文献[2]报道，用组织块酶消化法进行牙髓干细胞分离培养。用眼科剪将牙髓组织剪成约0.5 mm³大小的小块，加入Ⅰ型胶原酶(3 g/L)37 ℃消化组织块10 min，加入完全培养基终止消化，1 000 r/min离心3 min，弃上清，加入少量完全培养基，混匀后将悬浊液接种至6孔板内。将盖玻片压于组织之上，补充适量液体，放入CO₂孵箱内37 ℃培养，1 d后换液，以后每3 d换液，倒置显微镜下观察细胞生长情况。待细胞游出并达到70%-80%汇合时以0.25%胰酶消化，按1∶2传代。第3-5代细胞用于后续实验。

1.4.2 变形链球菌提取物的制备 挑取变形链球菌标准株UA159单克隆接种于脑心浸出液肉汤液体培养基，放入厌氧箱37 ℃培养24 h，离心(10 000×g，20 min，4 ℃)收集细菌于离心管中，PBS(pH=7.4)洗菌2次。利用超声破碎仪破碎细菌(超声30 s，间隔1 min，持续60 min，冰上操作)，离心(10 000×g，20 min，4 ℃)收集上清液，0.22 μm滤器过滤上清液，蛋白检测试剂盒检测变形链球菌提取物蛋白浓度，用DMEM稀释成质量浓度为1 g/L，分装后存放于-80 ℃冰箱，保存备用。

1.4.3 变形链球菌提取物或脂多糖刺激后牙髓干细胞中TLR4的表达 取处于对数生长期的第3-5代牙髓干细胞接种于6孔板中，待细胞贴壁，细胞增殖至80%汇合时，吸弃原培养液，更换含有1 mg/L脂多糖或1 mg/L变形链球菌提取物的完全培养基，空白对照组用普通完全培养基培养细胞，刺激24 h后收集细胞，Trizol抽提牙髓干细胞的总RNA，分光光度计检测RNA浓度，PrimeScriptR试剂盒将RNA反转录成cDNA，采用SYBR法进行PCR扩增，所有基因通过7500 RT-PCR仪进行检测，用相对定量法计算 2^-ΔΔCT值代表TLR4的相对表达强度。具体引物序列如下：β-actin上游：5'-GCG CGG CTA CAG CTT CA-3'，下游：5'-CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT-3'。TLR4上游： 5'-TGA GGA CCG ACA CAC CAA TG-3'，下游：5'-TGC AAT GGA TCA AGG ACC AG-3'。每组3个副孔，3次独立重复实验。

取处于对数生长期的第3-5代牙髓干细胞接种于6孔板中，待细胞贴壁，细胞增殖至80%汇合时，吸弃原培养液，更换含有1 mg/L脂多糖或1 mg/L变形链球菌提取物的完全培养基，空白对照组用普通完全培养基培养细胞，刺激24 h后蛋白裂解液抽提细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，SDS-PAGE电泳、转膜、封闭、免疫杂交、显色。每组3个样本，3次独立重复实验。

取处于对数生长期的第3-5代牙髓干细胞，以3×10³/孔细胞接种于铺有盖玻片的6孔板内，待细胞贴壁，吸弃原培养液，更换含有1 mg/L脂多糖或1 mg/L变形链球菌提取物的完全培养基，空白对照组用普通完全培养基培养细胞，刺激24 h后用体积分数为4%甲醛室温固定20 min，0.2% Triton X-100透化，体积分数为10%山羊血清封闭剂孵育10 min，TLR4鼠抗人一抗(1∶100) 4 ℃孵育过夜，PBX洗3次，FITC标记的兔抗鼠二抗(1∶500)室温避光孵育1 h，DAPI细胞核染色，防淬灭封固剂封固，正置荧光显微镜下观察、拍照。

1.5 主要观察指标 脂多糖及变形链球菌提取物刺激后，牙髓干细胞中TLR4 mRNA及蛋白表达量。

1.6 统计学分析 实验结果用SPSS 13.0统计软件处理，数据以x(_)±s表示。采用单因素方差分析进行显著性分析，然后用Levene’s test检验方差齐性(检验水准α=0.05)，如果方差齐则进一步对样本均数进行两两比较的Bonferroni检验，反之，方差不齐则采用近似F 检验的Welch方法进行方差分析后，Dunnett’T3检验进行两两比较，检验水准α，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程=0.05

讨论

2000年，Gronthos等^[3]首次从人牙髓组织中分离培养了牙髓干细胞，它是以具有自我更新和多向分化潜能为特征的未分化间充质细胞。已经证实，牙髓干细胞可以向神经元细胞、脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞等多种细胞方向分化^[4-10]。当龋坏发生、牙本质暴露时，细菌和其他机械性或化学性刺激沿牙本质小管传导至牙髓，牙髓干细胞分化为受损细胞形成修复性牙本质，对牙髓组织的保护和修复起到了至关重要的作用^[11]。

龋病是在以细菌为主的多因素影响下，牙体硬组织发生慢性进行性破坏的一种疾病。在龋病发展的早期，革兰阳性菌首先感染牙本质，随着龋病的进一步发展，当细菌感染到达牙髓牙本质交界处时，革兰阳性菌的数量逐渐减少，感染主要以革兰阴性菌为主^[12]，可见龋病的致病菌并非一种或一类细菌，而是多种细菌的混合感染，而牙髓组织则长期暴露于这种混合感染的微环境中。以往牙髓免疫反应的研究主要集中于革兰阴性菌与TLR4的关系，而对革兰阳性菌刺激后牙髓中TLR4表达少见报道。变形链球菌是最主要的致龋菌^[13]，属于革兰阳性菌，由于其具有强大的产酸能力和耐酸能力，可以使牙菌斑局部pH值下降至5.5以下，并维持较长时间，是牙齿脱矿、形成龋洞的主要细菌。实验选用变形链球菌和脂多糖模拟深龋情况下牙髓组织的微环境，研究革兰阳性菌和革兰阴性菌刺激后牙髓干细胞中TLR4的表达情况。

实验结果表明，用脂多糖及变形链球菌提取物刺激牙髓干细胞24 h后，TLR4 mRNA和蛋白表达量均显著增加。细胞免疫荧光染色结果得出同样结论，与空白对照组相比较，脂多糖及变形链球菌提取物刺激后牙髓干细胞中TLR4荧光强度明显增强。以上结果均可说明不仅脂多糖可以激活牙髓干细胞表面的TLR4表达，变形链球菌的提取物也可以刺激牙髓干细胞TLR4的表达。

TLR4存在于健康和深龋牙髓组织的成牙本质细胞层及血管周围，且深龋牙髓的TLR4表达量高于健康牙髓^[1^，^14-15]。脂多糖是革兰阴性菌胞壁表面的成分。深龋状态下，细菌及其产物入侵牙髓组织，且经过证实，脂多糖存在深龋的牙髓组织中^[16-17]。脂多糖作为激动剂，可以激活人体多种细胞表面的TLR4表达^[18-24]。

岳静等^[25]研究表明，变形链球菌刺激牙髓细胞后可以增强NOD2、TLR4等免疫受体的mRNA表达，说明变形链球菌提取物的成分可以刺激免疫受体的激活。也有实验表明，变形链球菌可以增加小鼠体内的TLR4表达^[26]。龋病过程中，细菌是作为一个整体发挥作用而非其中某一成分损伤牙髓组织，所以实验选择变形链球菌的全提取物作为牙髓干细胞的刺激物。实验仅用超声波破碎了变形链球菌的胞体而保留了细菌的所有组分，提取物中不仅包含了细菌的胞壁，还包含了蛋白、核酸等多种成分。但由于提取物的构成复杂，其激活TLR4的具体成分还不清楚，也未见相关报道，还需要进一步的研究。

TLR4属于模式识别受体的一种^[27]。当TLR4特异性识别细菌所携带的病原体相关分子模式，包括MyD88、TRIF、MAPKs、Akt在内的多条信号通路被激活^[28]，释放大量细胞因子，如肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、一氧化氮、巨噬细胞炎症蛋白2和前列腺素等^[29-31]。而这些细胞因子的生物活性与TLR4的磷酸化及信号通路的激活紧密相关^[32]。有文献报道，当牙乳头细胞中的TLR4被脂多糖激活后，可以释放大量的白细胞介素1β、6及8。同样，纤维细胞受到脂多糖刺激后白细胞介素1、CCL7、CCL26和CXCL11的分泌量增加。细胞因子造成细胞微环境的改变，刺激细胞生物学特性的改变，免疫反应启动^[33-35]。TLR4/MyD88-NF-κB信号通路是目前研究较为成熟的信号通路，已经证实，脂多糖刺激牙髓干细胞可以导致TLR4/ MyD88-NF-κB通路被激活，并且脂多糖通过TLR4/ MyD88-NF-κB及MAPK通路诱导牙髓干细胞释放白细胞介素8^[19]。

结论：实验用革兰阴性菌与革兰阳性菌作为刺激物模拟了深龋时牙髓内的微环境，结果证明脂多糖和变形链球菌提取物刺激后均可激活牙髓干细胞表面TLR4的表达，提示在深龋过程中，TLR4参与了牙髓干细胞的天然免疫反应，为日后龋病和牙髓病的防治提供了重要的理论基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

脂多糖与变形链球菌刺激牙髓干细胞中Toll样受体4的表达

Expression of Toll-like receptor 4 in dental pulp stem cells under the stimulation of lipopolysaccharide and Streptococcus mutans

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