静脉移植人脐血间充质干细胞心肌梗死小鼠心内、外单核巨噬细胞M1/M2亚型的转化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0643

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (33): 5327-5332.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0643

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静脉移植人脐血间充质干细胞心肌梗死小鼠心内、外单核巨噬细胞M1/M2亚型的转化

彭漪，陈柄全，赵吉玲，彭智勇，徐维芳，余国龙

中南大学湘雅医院心内科，湖南省长沙市 410008

修回日期:2018-06-29 出版日期:2018-11-28 发布日期:2018-11-28
通讯作者: 余国龙，博士，中南大学湘雅医院心内科，湖南省长沙市 410008
作者简介:彭漪，女，1989年生，湖南省吉首市人，土家族，中南大学湘雅医学院在读博士，主要从事间充质干细胞移植改善心肌梗死预后等相关研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81570266)

Effects of intravenous transplantation of human umbilical cord blood mesenchymal stem cells on conversion of intra-and extra-cardiac monocyte-macrophages M1/M2 subtypes in mice with acute myocardial infarction

Peng Yi, Chen Bing-quan, Zhao Ji-ling, Peng Zhi-yong, Xu Wei-fang, Yu Guo-long

Department of Cardiology, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410008, Hunan Province, China

Revised:2018-06-29 Online:2018-11-28 Published:2018-11-28
Contact: Yu Guo-long, MD, Department of Cardiology, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410008, Hunan Province, China
About author:Peng Yi, Doctorate candidate, Department of Cardiology, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410008, Hunan Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81570266

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
人脐血间充质干细胞：2000年，Erices等学者首次发表从人脐血中可以分离培养出间充质样细胞，其功能特点和免疫表型与骨髓来源间充质干细胞相似，亦具有分化为软骨细胞、脂肪细胞等潜能。研究表明，85%以上的人脐血间充质干细胞处于G₁/G₀期，其中只有5%处于G₀期，而骨髓间充质干细胞有20%处于G₀期，说明人脐血间充质干细胞有更好的活性和扩增性。有研究对于人脐血间充质干细胞移植治疗的安全性进行了较全面的相关实验，所有检测显示实验动物无明显异常，证明人脐血间充质干细胞可作为一种安全有效的移植细胞。
炎症：是具有血管系统的活体组织对损伤因子所发生的复杂的防御反应，凡是能引起组织和细胞损伤的因子都能引起炎症，包括缺血或缺氧等原因引起的组织坏死。坏死组织是潜在的致炎因子，在新鲜梗死灶边缘所出现的出血充血带和炎症细胞浸润都是炎症的表现。急性炎症期浸润的炎症细胞主要为中性粒细胞，后期主要的炎症细胞是单核/巨噬细胞系统。由于临床希望改善心肌梗死患者长期预后促进心肌修复，故心肌梗死的炎症与修复相关研究多关注单核/巨噬系统的动态改变、相关炎症因子与心功能的关系。

摘要
背景：研究表明人脐血间充质干细胞移植可能对炎症有调控作用，参与心肌梗死后缺血心肌保护和改善心功能等，但其对炎症影响的效果仍不明确。
目的：探讨经静脉移植人脐血间充质干细胞对急性心肌梗死小鼠心内、心外单核细胞/巨噬细胞M1/M2亚型转化效应及心脏保护作用。
方法：七八周龄雄性Balb/C小鼠随机分为实验组(7只)和对照组(8只)。心肌梗死造模1周后实验组尾静脉注射含1×10⁶人脐血间充质干细胞的生理盐水0.2 mL，对照组注射等量生理盐水。治疗4周后，流式细胞仪检测外周血及脾脏单核细胞M1/M2比值，超声心动图检测心功能，苏木精-伊红染色观察心肌病理变化、Masson染色观察胶原沉积情况，TUNEL染色检测心肌凋亡及免疫荧光检测心肌组织巨噬细胞M1/M2比值。
结果与结论：①与对照组相比，实验组外周血、脾脏及梗死心肌周边单核细胞/巨噬细胞M1/M2比值较低(P < 0.05)；②实验组左心室收缩末期内径、左心室舒张末期内径低于对照组，左室射血分数显著高于对照组(P < 0.05)；③实验组心肌梗死区域及周边心肌组织炎症细胞计数低于对照组(P < 0.05)；④实验组心肌胶原组织沉积低于对照组(P < 0.05)；⑤实验组凋亡指数低于对照组，但差异无显著性意义(P > 0.05)；⑥实验证实静脉移植人脐血间充质干细胞可通过调控小鼠心肌梗死局灶及全身系统炎症反应从而改善心功能，是人脐血间充质干细胞移植治疗心肌梗死产生心脏保护效应机制之一。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-2920-7876(彭漪)

关键词: 急性心肌梗死, 脐血间充质干细胞, 静脉移植, 单核/巨噬细胞, 炎症, 干细胞, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that transplantation of human umbilical cord blood mesenchyme stem cells (hUCB-MSCs) may reduce inflammation, improve cardiac function and participate in ischemic myocardial protection. However, there is still no final conclusion on the anti-inflammatory effect of hUC-MSCs.
OBJECTIVE: To investigate the effects of intravenous transplantation of hUCB-MSCs on the conversion of intra- and extra-cardiac monocyte-macrophages subtypes LY-6C hi (M1)/LY-6 low (M2) and cardiac protection in mice with acute myocardial infarction (AMI).
METHODS: Balb/C mice with AMI, aged 7-8 weeks, were randomly divided into experimental group (n=7) and control group (n=8). At 1 week after AMI, the experimental group was injected with 0.2 mL of saline containing 1×10⁶ hUCB-MSCs via tail vein, and the control group was given 0.2 mL of saline with no cells. At 4 weeks after treatment, the M1/M2 ratio in the peripheral blood and spleen was measured by flow cytometry. Cardiac function was measured by echocardiography. Pathological changes of the myocardium, collagen sediment, apoptosis in myocardial cells, and myocardial macrophage M1/M2 cell count were detected by hematoxylin-eosin staining, Masson staining, TUNEL staining and immunofluorescence analysis, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, monocyte-macrophages M1/M2 ratio in the peripheral blood, spleen and peri-infarcted myocardial tissue was lower in the experimental group (P < 0.05). Compared with the control group, cardiac functions were significantly improved in the experimental group presenting with lower left ventricular end-systolic diameter, left ventricular end-diastolic diameter as well as higher left ventricular ejection fraction (P < 0.05). Compared with the control group, the inflammatory cell count in the infarction area and surrounding tissue was significantly lower in the experimental group (P < 0.05). Compared with the control group, the amount of collagen sediment was significantly less in the experimental group (P < 0.05). Compared with the control group, the apoptosis index was lower in the experimental group, but there was no significant difference between the two groups (P > 0.05). These experimental findings verify that the intravenous transplantation of hUCB-MSCs can improve cardiac function of AMI mice by regulating systemic inflammatory responses and focal infarct lesions, which is one of the mechanisms by which hUCB-MSCs transplantation for myocardial infarction produces myocardial protection.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Myocardial Infarction, Cord Blood Stem Cell Transplantation, Injections, Intravenous, Mononuclear Phagocyte System, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

彭漪，陈柄全，赵吉玲，彭智勇，徐维芳，余国龙. 静脉移植人脐血间充质干细胞心肌梗死小鼠心内、外单核巨噬细胞M1/M2亚型的转化[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(33): 5327-5332.

Peng Yi, Chen Bing-quan, Zhao Ji-ling, Peng Zhi-yong, Xu Wei-fang, Yu Guo-long. Effects of intravenous transplantation of human umbilical cord blood mesenchymal stem cells on conversion of intra-and extra-cardiac monocyte-macrophages M1/M2 subtypes in mice with acute myocardial infarction[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(33): 5327-5332.

图/表（结果） 2

2.1 hUCB-MSCs的形态 冷冻复苏后显微镜下观察hUCB-MSCs状况良好，贴壁牢固，形态呈长梭形，呈极性排列，少量未贴壁细胞呈圆形漂浮，培养基透亮度佳(图1)。

2.2 hUCB-MSCs经小鼠尾缘静脉注射及小鼠实验期间内生存状况 细胞移植后每日观察小鼠存活情况，实验组小鼠全体存活致实验结束，对照组1只小鼠于治疗后25 d死亡，解剖发现该鼠出现左室前壁大面积梗死，其左室明显扩大，室壁变薄。所有小鼠实验结束解剖肝、肺、肾、脑等实质器官，均未引起新生明显实质性病变占位。

2.3 两组外周血及脾脏单核细胞M1/M2亚型比较 治疗4周后，实验组外周血和脾脏单核细胞亚型M1/M2比值显著低于对照组，差异有显著性意义(外周血1.636±0.147，2.866±0.383；脾脏1.808±0.082，5.040±0.483，n=7，P均< 0.05)，见图2。

2.4 两组间免疫荧光巨噬细胞计数及M1/M2比值比较 如图3及表1所示，治疗4周后，实验组心肌组织内巨噬细胞总数、M1细胞数、M1/M2比值均低于对照组(P < 0.05)，但M2型细胞数差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.5 两组间梗死区域残存心肌面积比例及心肌纤维化比较 如图4所示，两组小鼠心脏横截面切片经Masson染色，治疗4周后，实验组残存心肌面积较对照组显著增多，梗死区胶原纤维数量显著减少。

2.6 两组间缺血梗死区病理学检测及白细胞计数比较 由图5(箭头所示为白细胞)所示，治疗后4周，缺血梗死区苏木精-伊红染色病理学检测，显微镜下均有心肌梗死区域及边缘处心肌水肿，胞质疏松，部分肌纤维及核溶解消失，心肌细胞排列紊乱，单核淋巴细胞浸润，梗死边缘区心肌细胞代偿性肥大。与对照组比较，实验组残存心肌细胞数量较多，单核淋巴细胞浸润减少。实验组心肌组织内浸润白细胞计数为(15.93±0.88)/高倍视野，明显低于对照组(27.27±0.52)/高倍视野，差异有显著性意义(n=5，P < 0.05)。

2.7 两组小鼠心肌凋亡指数比较 TUNEL法检测结果显示正常心肌细胞核呈蓝色，而凋亡阳性心肌细胞核呈棕褐色(图6，箭头标记为凋亡细胞核)，实验组治疗后4周心肌细胞凋亡指数低于对照组，但差异无显著性意义[(30.55±3.97)%，(32.41±2.27)%，n=5，P=0.705]。

2.8 两组小鼠心脏重构与心功能比较 与对照组比较，治疗后4周实验组左室射血分数显著高于对照组[(40.00±2.52)%，(30.00±2.27)%，n=7]，实验组左心室收缩末期内径[(2.91±0.08) mm，(4.16±0.31) mm，n=7]以及左心室舒张末期内径[(3.47±0.14) mm，(4.72±0.42) mm，n=7]均低于对照组，差异均有显著性意义(P < 0.05)。

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引言

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 于2017年6至12月在中南大学湘雅医院医学实验研究中心和中南大学实验动物学部完成。

1.3 材料 15只七八周龄雄性Balb/C小鼠，体质量25-28 g，由中南大学实验动物部提供。第2代hUCB-MSCs购自广州赛业生物科技有限公司(货号：HUXUB-01001；批号：130606L01)，在质检报告中对其生长状态、分化能力、传代能力均进行了检测并出示了书面报告。hUCB-MSCs的CD29、CD44、CD73、CD105表面抗原表达率> 98%，CD34、CD45、CD11b细胞分化表面标记物表达率均≤1%。

1.4 实验方法

1.4.1 小鼠心肌梗死模型 心肌梗死模型建立与模型成功判断参照文献[5，7-8]。腹腔注射1%戊巴比妥钠(80 mg/kg)麻醉后，行气管插管，在呼吸机辅助呼吸下，分离胸大肌及胸小肌，第2，3肋间隙开胸，左心耳下缘1.0-2.0 mm处结扎冠脉左前降支，以观察到左室前壁颜色变白，活动减弱和心电图V2等导联ST段弓背样抬高为模型构建成功标志。

1.4.2 实验动物分组与hUCB-MSCs移植 第2代hUCB-MSCs常规解冻复苏，用含体积分数为15%胎牛血清的DMEM培养基漂洗2次，重悬于含体积分数为15%胎牛血清的低糖DMEM培养基的培养瓶中，接种密度为2×10⁵/cm²，于37 ℃、体积分数为5%CO₂饱和湿度培养箱中培养，每隔3 d或4 d更换培养液，未贴壁细胞弃之，待贴壁细胞近乎完全铺满培养瓶底，加入0.05%胰蛋白酶/0.02%EDTA在37 ℃条件下消化贴壁细胞，按1∶3的比例重新接种传代，然后每隔3 d或4 d更换培养液，换液时弃去非贴壁细胞，待细胞长到80%融合时再次传代，无菌条件下扩增至第5代，重悬于生理盐水中，调整细胞浓度为5×10⁹ L^-1。

心肌梗死造模成功后1周，随机选取7只Balb/C小鼠作为实验组，经尾静脉注射细胞悬液0.2 mL(约含细胞数1×10⁶)，另8只Balb/C小鼠为对照组，经尾静脉注射不含细胞的生理盐水0.2 mL。

1.4.3 超声心动图检测心功能 治疗4周后，采用GE vivid7彩色超声心动图仪，11.5 MHz探头行超声检测，检测指标为左心室收缩末期内径(LVDs)、左心室舒张末期内径(LVDd)、左室射血分数(LVEF)。

1.4.4 流式细胞技术检测外周血、脾脏单核细胞亚群 每组取7只小鼠，于腹腔注射1%戊巴比妥钠(80 mg/kg)麻醉情况下摘眼球取血，并用肝素钠抗凝。取血后将小鼠颈椎脱臼法处死，取脾脏于200目滤网上研磨，收集细胞悬液，按10倍细胞体积的比例向外周血及脾脏细胞沉淀中加入BD红细胞裂解液轻轻吹打混匀，室温避光裂解5 min；400×g离心5 min，弃去上层红色清液；收集沉淀部分，加入PBS离心洗2次。

将从外周血及脾脏提取出的细胞用流式染色缓冲液重悬，调整细胞数为1×10⁶/100 μL。取100 μL细胞悬液冰上孵育直标抗体(FITC anti-mouse CD11b与PE anti-mouse Ly-6C)30 min，细胞重悬至300 μL PBS中，流式细胞仪(美国BD公司)检测单核细胞中Ly-6C^hi细胞(CD11b⁺，Ly-6C⁺⁺，M1型单核细胞)与Ly-6C^low细胞(CD11b⁺，Ly-6C⁺，M2型单核细胞)比例。

1.4.5 心脏组织病理检测 每组取上述5只小鼠心脏，于左室前壁心肌梗死部分中点处，沿心脏长轴约等分为3部分，沿下1/3处切开，心尖处的1/3左室放进冻存管于液氮中保存，用于后续Western Blot检测，上2/3部分左室用40 g/L多聚甲醛溶液固定24 h，用于病理切片检测。

苏木精-伊红染色病理检测：取40 g/L多聚甲醛溶液固定的心脏组织，常规脱水，石蜡包埋，以厚度4 μm切片，常规苏木精-伊红染色。使用数字扫描仪扫描全片，每只小鼠于心肌梗死区随机取5个非血管区高倍视野(1×400)，使用image pro plus图片处理软件计算白细胞数，取其均值。

Masson染色病理检测：取40 g/L多聚甲醛溶液固定的心脏组织，常规脱水，石蜡包埋，以厚度4 μm切片，常规Masson染色。放大2倍视野，image pro plus图片处理软件计算每只小鼠心肌梗死区域残存心肌所占面积比例、心肌纤维化比例。

脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL法)原位标记凋亡细胞核：取40 g/L多聚甲醛溶液固定的心脏组织，常规脱水，石蜡包埋，以厚度4 μm切片，按照凋亡染色试剂盒(Roche)步骤标记凋亡细胞核。每只小鼠于心肌梗死周边区域随机取5个非血管区高倍视野(1×400)，使用image pro plus图片处理软件计算每个视野中凋亡细胞数占总细胞数比例，取其均值。

免疫荧光检测：巨噬细胞标记物F4/80一抗为大鼠抗小鼠抗体(美国R&D公司)，二抗为Cy3荧光山羊抗鼠抗体(武汉谷歌生物)，M1型细胞标记物iNOS一抗为兔抗鼠抗体(美国CST公司)，二抗为FITC标记的山羊抗兔抗体，DAPI复染细胞核。每只小鼠随机取5个高倍视野(10×40)，image pro plus程序对图片进行分析。根据DAPI染色阳性，红色荧光表达的细胞核数确定巨噬细胞数(F4/80⁺)，其中有绿色荧光表达(iNOS⁺)的F4/80⁺细胞核数为M1型细胞(F4/80⁺iNOS⁺)，而iNOS^-为M2型巨噬细胞(F4/80⁺iNOS^-)。

1.5 主要观察指标 ①超声心动图指标(左室收缩及舒张末期直径、左室射血分数)；②心内外单核巨噬细胞M1/M2比值；③心肌梗死周边炎症浸润情况；④梗死区域残存心肌所占面积比例；⑤心肌细胞凋亡指数。

1.6 统计学分析 数据均表示为x(_)±s，组间样本采用独立样本t 检验。统计分析采用SPSS 17.0软件，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

近年实验研究与临床初步研究表明对急性心肌梗死进行脐血间充质干细胞或骨髓间充质干细胞移植治疗有肯定的疗效^[9^，^12]，且有相关文献证明hUCB-MSCs免疫原性低，证实其异种移植的安全性^[13]。干细胞移植治疗急性心肌梗死的机制仍有待进一步探讨，绝大多数研究者认为干细胞移植治疗急性心肌梗死获益是旁分泌机制挽救缺血心肌，而非预期的心肌细胞再生^[9^，^14]。作者前期研究及国内外相关研究证实间充质干细胞治疗急性心肌梗死的疗效主要通过旁分泌机制对心肌梗死后炎症双重效应的调节^[2^，⁹^，^14-16]。近期实验研究证实，单核细胞/巨噬细胞M1与M2之间的亚型转化，是炎性损伤向炎症修复之间转折的生物学标志^[5^，^7-8^，^17-19]，有实验研究结果提示间充质干细胞移植主要通过促心肌梗死局灶组织巨噬细胞M1/M2亚型转化机制，发挥抗炎与促心脏修复效应^[4^，¹⁰^，^12]。

多项实验研究显示经静脉移植间充质干细胞治疗急性心肌梗死，仅2%细胞归巢；即使心肌内移植，4 h后就有90%流失，24 h后仅1%细胞定植^[9-10]。作者认为心肌组织内间充质干细胞定植时间过短及数量过少，难以解释心肌组织内巨噬细胞M1/M2亚型转化的强度和持续时间(可持续到心肌梗死后10-14 d)。

经静脉或经心内移植的间充质干细胞在体内迁移的情况国内外关注较少，大部分研究主要观察间充质干细胞移植后可能发生的不良反应^[9^，^20]。作者前期工作及Lee等^[20-21]研究发现经静脉移植间充质干细胞，大量细胞停滞在肺循环，少部分迁移植脾、肝和骨髓。对急性心肌梗死实验动物多次静脉移植hUCB-MSCs^[20]，其增强的抗炎效应和心脏保护作用与心内定植的移植细胞数量并不呈直线相关。值得关注的是Borlongan等^[22]研究结果发现经静脉注射hUCB-MSCs治疗脑梗死，脑组织内没有移植细胞，但仍然产生对脑梗死的保护效应。Lee等^[21]研究亦发现经静脉移植间充质干细胞，仅有微量细胞迁移致心脏，但仍可产生抗炎和心肌保护效应。综上所述，仅仅用局灶组织内是否有移植细胞或数量的多少，不足以解释上述研究间充质干细胞产生的抗炎效应和心脑保护作用。

Balb/C小鼠急性心肌梗死实验模型制备1周后经静脉移植hUCB-MSCs治疗4周，外周血、脾脏单核细胞M1/M2比值和心肌组织巨噬细胞M1数量显著降低，心肌梗死区域及周边心肌组织白细胞计数显著减少，进一步阐明hUCB-MSCs促进心肌梗死局灶组织巨噬细胞M1/M2亚型转化同时，还具有促进外周血、脾脏等心外单核细胞M1/M2亚型转化效应的作用。实验结果还显示实验组小鼠梗死区域残存心肌细胞显著多于对照组，心肌胶原组织沉积少于对照组，且心脏重构指标及心功能显著改善，说明静脉移植hUCB-MSCs调控体内及心脏局灶炎性反应同时，还产生对心脏的保护效应。该研究进一步证实心外单核细胞是参与急性心肌梗死炎症反应的主要功能细胞，且hUCB-MSCs促进心内巨噬细胞M1/M2亚型转化的同时，还可能导致心肌组织外循环单核细胞M1/M2亚型转化，调控体内的免疫机制，参与心肌梗死的急性炎症反应。心肌梗死区域周边心肌的凋亡指数无明显差异，考虑为心肌修复凋亡已进入终末期，故无显著差异。

近期Cho等^[23]、Ben-Mordechai等^[24]、Holladay等^[25]多项研究证实间充质干细胞移植促进心肌梗死组织巨噬细胞M1亚型向M2亚型转化，伴有心脏重构与心功能改善。目前仅有Dayan等^[8]实验研究中间充质干细胞移植涉及循环单核细胞M1/M2亚型转化，结果证实间充质干细胞移植促进心肌组织内巨噬细胞M1/M2亚型转化的同时，还导致外周血单核细胞M1/M2亚型发生相同变化。该研究首次证实急性心肌梗死小鼠静脉移植hUCB-MSCs促进心肌组织内巨噬细胞M1/M2亚型转化的同时，还促进脾脏、外周血单核细胞M1/M2亚型转化。

国内外学者与作者前期研究已经证实骨髓或人脐血间充质干细胞移植对急性心肌梗死炎症反应的双重效应具有调节作用^[15^，²⁰^，^26]，间充质干细胞移植增加抗炎因子白细胞介素10在血浆与心肌组织中的表达强度，而降低促炎因子白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α在血浆与心肌组织中的表达强度。结合该研究结果，作者认为间充质干细胞移植对急性心肌梗死炎症反应的双重效应调节作用，与间充质干细胞促心肌组织内巨噬细胞以及脾脏、外周血单核细胞M1/M2亚型转化密切相关，该研究结果对临床推广间充质干细胞移植治疗急性心肌梗死临床应用提供了实验佐证。但间充质干细胞促进M1向M2亚型转化效应机制目前尚未明确，有待于进一步探讨。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

静脉移植人脐血间充质干细胞心肌梗死小鼠心内、外单核巨噬细胞M1/M2亚型的转化

Effects of intravenous transplantation of human umbilical cord blood mesenchymal stem cells on conversion of intra-and extra-cardiac monocyte-macrophages M1/M2 subtypes in mice with acute myocardial infarction

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