人参皂苷Rg1对骨髓来源内皮祖细胞损伤的保护作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0646

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
内皮祖细胞：是由Asahara等首次从人外周血单个核细胞分离出来的CD34⁺和VEGFR2⁺单核细胞，可归巢于新生血管组织，具有分化为成熟内皮细胞的能力，在内皮修复与血管新生中发挥着重要作用。研究证实，内皮祖细胞的数量和功能受损可导致血管内皮细胞功能障碍，促使动脉粥样硬化的发生。因此，保护内皮祖细胞的功能可延缓或防止动脉粥样硬化的发生。
人参皂苷Rg1：是人参皂苷中一种含量较高的重要单体成分，为四环三萜类衍生物，具有多种药理活性，可作用于神经系统、心血管系统、血液和免疫系统，尤其对心血管系统和神经系统有显著调节作用。

摘要
背景：研究证实，人参皂苷Rg1对血管内皮细胞具有保护作用，但其作用机制尚不明确。
目的：探讨人参皂苷Rg1对过氧化氢诱导的大鼠骨髓来源内皮祖细胞损伤的保护作用及机制。
方法：采用直接贴壁法分离培养SD大鼠骨髓来源内皮祖细胞。将对数生长期的内皮祖细胞分为3组：空白对照组，不进行任何干预，常规培养24 h；细胞损伤组，加入含100 μmol/L过氧化氢的EMG-2培养基培养24 h；人参皂苷Rg1组，先以64 μmol/L人参皂苷Rg1预先干预2 h，然后加入含100 μmol/L过氧化氢的EMG-2培养基培养22 h。采用CCK-8、Tunel、划痕实验检测细胞增殖、细胞凋亡及迁移能力，Western Blot检测细胞内Akt、p-Akt、Bax、Bcl-2蛋白的表达，ELISA法检测细胞内超氧化物歧化酶、丙二醛、一氧化氮水平。
结果与结论：①与细胞损伤组比较，人参皂苷Rg1组细胞存活率明显增高(P < 0.05)，细胞凋亡数量明显降低(P < 0.05)，细胞迁移能力明显提高(P < 0.05)；②与细胞损伤组比较，人参皂苷Rg1组超氧化物歧化酶、一氧化氮水平明显升高，丙二醛水平显著降低(P均< 0.05)；③3组间Akt蛋白表达无差异，人参皂苷Rg1组p-Akt蛋白表达高于细胞损伤组(P < 0.05)；④人参皂苷Rg1组Bcl-2蛋白表达高于细胞损伤组(P < 0.05)，Bax蛋白表达低于细胞损伤组(P < 0.05)；⑤结果表明，人参皂苷Rg1能对抗过氧化氢诱导的大鼠骨髓来源内皮祖细胞损伤，提高细胞活力，抑制细胞凋亡，降低氧化应激损伤，Akt信号通路在其中可能发挥了一定作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-7215-6627(蒋文捷)

关键词: 人参皂苷Rg1, 过氧化氢, 内皮祖细胞, 细胞增殖, 细胞凋亡, 氧化应激, 干细胞

Abstract:

BACKGROUND: Studies have confirmed that ginsenoside Rg1 has protective effects on vascular endothelial cells, but its underlying mechanism is still unclear.
OBJECTIVE: To investigate the mechanism by which ginsenoside Rg1 protects against hydrogen peroxide induced injury of rat bone marrow-derived endothelial progenitor cells.
METHODS: Endothelial progenitor cells derived from bone marrow of Sprague-Dawley rats were isolated and cultured by direct adherent method. The endothelial progenitor cells in logarithmic growth period were divided into three groups: control group, no intervention but conventional culture for 24 hours; cell injury group, cells were cultured in EMG-2 medium containing 100 μmol/L hydrogen peroxide for 24 hours; combined intervention group, cells were pretreated with ginsenoside Rg1 (64 μmol/L) for 2 hours, then cultured in EMG-2 medium containing 100 μmol/L hydrogen peroxide for 22 hours. Cell proliferation, apoptosis and migration were detected using cell counting kit-8, TUNEL, and cell scratch test, respectively. The expression of Akt, p-Akt, Bax, and Bcl-2 proteins was measured using western blot assay. The levels of intracellular superoxide dismutase, malondialdehyde and nitric oxide were determined using ELISA method.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with the cell injury group, the cell survival rate and cell migration ability were significantly increased, while the number of apoptotic cells reduced significantly in the combined intervention group (all P < 0.05). (2) Compared with the cell injury group, the levels of intracellular superoxide dismutase and nitric oxide were significantly increased, while the level of malondialdehyde was significantly reduced in the combined intervention group (all P < 0.05). (3) No significant difference in the expression of Akt protein was detected among the three groups, but the expression of p-Akt protein was significantly higher in the combined intervention group than the cell injury group (P < 0.05). Moreover, significantly increased Bcl-2 expression and decreased Bax expression were observed in the combined intervention group as compared with the cell injury group. In conclusion, ginsenoside Rg1 can antagonize hydrogen peroxide-induced damage to rat bone marrow-derived endothelial progenitor cells, increase cell viability, inhibit cell apoptosis, and reduce oxidative stress injury via the Erk signaling pathway.

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Key words: Panax, Saponins, Endothelial Cells, Hydrogen Peroxide, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

蒋文捷，梁雪梅. 人参皂苷Rg1对骨髓来源内皮祖细胞损伤的保护作用[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(33): 5338-5343.

Jiang Wen-jie, Liang Xue-mei. Ginsenoside Rg1 protects against hydrogen peroxide induced damage to bone marrow-derived endothelial progenitor cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(33): 5338-5343.

图/表（结果） 1

2.1 骨髓来源内皮祖细胞的培养及鉴定结果 原代培养48 h后，镜下可见少量细胞贴壁，以小的圆形细胞为主。随着培养时间延长，细胞体积逐渐增大，呈梭形。培养至第六七天时，形成细胞集落，可见部分细胞由梭形变为菱形(图1A)；荧光显微镜下双染色显示，DiI-Ac-LDL染色后细胞呈红色(图1B)，FITC-UEA-1染色后细胞呈绿色(图1C)，双染细胞叠加呈黄色(图1D)；流式细胞仪检测结果显示，细胞高表达CD133、CD34及KDR，阳性表达率分别为(78.6±9.9)%，(58.7±10.5)%，(88.6±6.8)%，以上结果提示实验获得的为早期内皮祖细胞。

2.2 各组细胞增殖能力 经100 μmol/L过氧化氢干预后，细胞损伤组的细胞存活率较空白对照组明显降低，差异有显著性意义(P < 0.05)；经过人参皂苷Rg1预干预后，人参皂苷Rg1组细胞存活率明显高于细胞损伤组，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图2。

2.3 各组细胞凋亡数量 见图3。Tunnel检测显示，经 100 μmol/L过氧化氢干预后，细胞损伤组的细胞凋亡数量较空白对照组明显增多，差异有显著性意义(P < 0.05)；经过人参皂苷Rg1预干预后，人参皂苷Rg1组细胞凋亡数量明显少于细胞损伤组，差异有显著性意义(P < 0.05)；空白对照组、细胞损伤组、人参皂苷Rg1组细胞凋亡率分别为(2.33±0.36)%，(18.46±4.55)%，(10.29±3.97)%，组间两两比较差异均有显著性意义(P < 0.05)。

2.4 各组细胞超氧化物歧化酶、丙二醛、一氧化氮水平 见表1。与空白对照组相比较，细胞损伤组超氧化物歧化酶、一氧化氮水平明显降低，丙二醛浓度显著升高，差异均有显著性意义(P < 0.05)；与细胞损伤组相比较，人参皂苷Rg1组超氧化物歧化酶、一氧化氮水平明显升高，丙二醛水平显著降低，差异均有显著性意义(P < 0.05)。

2.5 各组细胞迁移能力 划痕距离越大说明细胞迁移能力越差。空白对照组、细胞损伤组、人参皂苷Rg1组24 h的划痕距离分别为(0.32±0.01) mm，(0.63±0.02) mm，(0.49±0.02) mm；与空白对照组比较，细胞损伤组内皮祖细胞迁移能力明显下降，差异有显著性意义(P < 0.05)；与细胞损伤组比较，人参皂苷Rg1组细胞迁移能力有明显提高，差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.6 各组细胞相关蛋白表达 Western Blot检测结果显示，3组间Akt蛋白表达无差异，p-Akt蛋白表达有差异，细胞损伤组p-Akt蛋白表达明显低于空白对照组，人参皂苷Rg1组p-Akt蛋白表达明显高于细胞损伤组，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图4。

各组细胞凋亡相关蛋白表达，见图5。结果显示，细胞损伤组Bcl-2蛋白表达低于空白对照组(P < 0.05)，Bax蛋白表达高于空白对照组(P < 0.05)；人参皂苷Rg1组Bcl-2蛋白表达高于细胞损伤组(P < 0.05)，Bax蛋白表达低于细胞损伤组(P < 0.05)。

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引言

心脑血管疾病是当今世界较为常见的疾病，致残率与致死率较高，动脉粥样硬化是其主要的病理生理变化^[1-3]。研究已证实，血管内皮功能障碍是动脉粥样硬化等相关血管疾病的早期表现，也是动脉粥样硬化相关血管疾病发生和发展的重要基础与初始环节^[4-6]。血管内皮细胞功能障碍是指在各种病理因素刺激下，例如感染、机械性损伤、缺氧、高脂血症、血流动力学异常等，血管内皮细胞失去了原有的正常生理功能。内皮祖细胞是血管内皮细胞的前体细胞，可分化为成熟的内皮细胞，广泛存在于骨髓、脐血、成人外周血及成人组织器官的大、中血管，在血管损伤时能趋化迁移至受损部位，代替凋亡的内皮细胞，维持血管内膜的完整性，在血管内皮损伤修复中扮演着重要角色^[7-10]。研究已证实，多种心血管疾病(如糖尿病^[11-12]、高血压^[13-14]、动脉粥样硬化^[15]、肺动脉高压^[16])的发病机制与内皮祖细胞的衰老有关。内皮祖细胞衰老后，其迁移、黏附功能和血管形成能力均降低，导致血管内皮修复能力减弱。因此，增强或恢复内皮祖细胞的生物学活性与功能是目前研究的热点。

人参皂苷Rg1是人参皂苷中一种含量较高的重要单体成分，为四环三萜类衍生物，具有多种药理活性，可作用于神经系统、心血管系统、血液和免疫系统，尤其对心血管系统和神经系统有显著调节作用^[17-21]。在心血管系统中，陈协辉等^[22]研究证实采用人参皂苷Rg1治疗大鼠急性心肌梗死，可动员骨髓干细胞归巢于缺血心肌，上调血管内皮生长因子和其受体Flk-1的表达，促进微血管生成，缩小心肌梗死面积；还有研究发现人参皂苷Rg1联合丹酚酸B可以减少大鼠心肌梗死面积，增强心脏收缩力^[23]。上述研究均证实，人参皂苷Rg1对血管内皮细胞具有保护作用，但其作用机制尚未完全明了^[24]。

实验采用过氧化氢诱导骨髓来源内皮祖细胞损伤模型，观察人参皂苷Rg1对内皮祖细胞损伤的保护作用及可能机制。

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材料方法

1.1 设计 对比观察体外细胞学实验。

1.2 时间及地点 实验于2017年1至4月在西南医科大学完成。

1.3 材料

1.3.1 实验试剂与仪器 人参皂苷Rg1购自上海纯优生物科技有限公司，纯度≥ 98%，相对分子质量801.012 68；DiI-Ac-LDL、FITC-UEA-1均购自北京百诺威生物科技有限公司；EMG-2培养基购自上海哈灵生物科技有限公司；鼠抗人单抗PE-CD34、PE-CD133、PE-KDR及同型对照PE-IgG1购自上海谷研科技有限公司；CCK-8试剂盒购自北京智杰方远科技有限公司；Tunel细胞凋亡检测试剂盒购自上海翊圣生物科技有限公司；过氧化氢购自无锡瑞勃化工有限公司；超氧化物歧化酶、丙二醛、一氧化氮试剂盒购自索莱宝科技有限公司；兔抗大鼠Akt抗体、兔抗大鼠p-Akt抗体、兔抗大鼠Bax抗体、兔抗大鼠Bcl-2抗体购自广东蓝岛生物技术有限公司；小鼠抗大鼠β-actin抗体购自武汉塞维尔生物科技有限公司；荧光显微镜购自北京上光仪器有限公司；酶标仪购自成都贝斯达仪器有限公司；流式细胞仪购自北京德利卡生物技术有限公司。

1.3.2 实验动物 4周龄雄性SD大鼠3只，清洁级，体质量(65.9±8.7) g，由西南医科大学动物实验中心提供。

1.4 实验方法

1.4.1 骨髓来源内皮祖细胞的分离培养 参照方晓等^[25]研究方法进行。腹腔注射水合氯醛(5 mL/kg)麻醉SD大鼠，麻醉生效后颈椎脱臼处死，将其浸泡于体积分数为75%乙醇中5-10 min，无菌条件下分离胫骨、股骨及肱骨，去除周围软组织，保留干骺端；采用PBS反复冲洗骨髓腔，以不锈钢过滤网过滤冲洗液，轻柔吹打，获得均匀的骨髓悬液，加入红细胞裂解液离心重悬，获得细胞浓度为1×10⁹L^-1的细胞悬液，接种至包被纤维连接蛋白的6孔板中，每孔加入EMG-2培养基，放于37 ℃、体积分数5% CO₂培养箱中培养；48 h首次换液，去除未贴壁细胞，补充新鲜培养基继续培养；以后每两三天换液1次，当原代细胞80%融合时，以1∶2或1∶3的比例传代。

1.4.2 内皮祖细胞的鉴定

内皮祖细胞功能鉴定：取培养第7天的内皮祖细胞，在含10 mg/L DiI-Ac-LDL的培养基中避光孵育10 h，随后以体积分数为10%中性甲醛固定10 h，PBS漂洗，加入含10 mg/L FITC-UEA-1的培养基中避光孵育1 h，PBS漂洗后，荧光显微镜下观察。

内皮祖细胞表面标记物鉴定：取培养第7天的内皮祖细胞，PBS清洗后制备成1×10⁹ L^-1的细胞悬液，放入EP管中，每管约含2×10⁸个细胞，分别加入鼠抗人单抗PE-CD34、PE-CD133、PE-KDR及同型对照PE-IgG1，混匀后室温反应20 min，进行流式细胞仪检测。

1.4.3 内皮祖细胞损伤模型的建立及人参皂苷Rg1的干预 取对数生长期的内皮祖细胞，制成细胞悬液，以3×10⁷ L^-1的细胞浓度接种于96孔板，100 μL/孔，置于37 ℃培养箱中培养24 h，弃掉培养基，以PBS洗去未贴壁细胞，再以无血清培养基培养8 h，随后将细胞分3组：空白对照组，不进行任何干预，常规培养24 h；细胞损伤组，加入含100 μmol/L过氧化氢的EMG-2培养基培养24 h；人参皂苷Rg1组，首先用64 μmol/L人参皂苷Rg1预先干预2 h，然后加入含100 μmol/L过氧化氢的EMG-2培养基培养22 h；每组设6个复孔。

1.4.4 CCK-8法检测细胞增殖 培养24 h后，每孔加10 μL CCK-8溶液，将培养板在培养箱内孵育4 h，在培养的不同时间点应用酶标仪在450 nm处检测吸光度值，描绘细胞生长曲线，计算细胞存活率。实验重复3次，取均值。细胞存活率=实验组吸光度值÷空白对照组吸光度值×100%。

1.4.5 Tunel法检测细胞凋亡 严格按照试剂盒说明书进行操作。培养24 h后，去除各组细胞培养基，PBS清洗2次，按常规方法脱蜡至水，PBS漂洗3次，5 min/次；加入蛋白酶K工作液，37 ℃反应15-30 min，PBS漂洗3次，5 min/次；室温固定15-30 min，PBS漂洗3次，5 min/次；浸入封闭液中，室温封闭10 min，PBS漂洗3次，5 min/次；小心用滤纸吸去载玻片上组织周围的多余液体，在切片上滴加100 μL TdT酶反应液，37 ℃避光反应60 min；用去离子水按1∶10稀释20×SSC，终止反应，室温15 min，PBS漂洗3次，5 min/次；浸入体积分数3% H₂O₂/PBS中封闭内源性过氧化物酶活性，室温孵育3-5 min，PBS漂洗3次，5 min/次；滴加100 μL Streptavidin-HRP工作液，37 ℃反应30-60 min，PBS漂洗3次，5 min/次；DAB显色，苏木精复染，去离子水漂洗数次，中性树胶封固，荧光显微镜下每张切片随机选取10个视野进行观察，计数视野中凋亡细胞数，取平均值。

1.4.6 细胞内超氧化物歧化酶、丙二醛、一氧化氮的检测 培养24 h后，消化各组细胞，收集到EP管中，离心去上清，制成细胞悬液，反复冻融细胞3次，破碎细胞，离心取上清液，采用TBA方法检测丙二醛浓度，采用黄嘌呤氧化酶方法检测超氧化物歧化酶水平，采用硝酸还原酶方法检测一氧化氮水平，严格按照各试剂盒说明书进行。

1.4.7 细胞迁移能力检测 先用marker笔在12孔板背后用直尺均匀地划横线，每隔0.5-1.0 cm一道，横穿过孔。培养24 h后，消化收集各组细胞，接种于12孔板，在第2天用枪头比着直尺，垂至于背后的横线划痕，PBS洗细胞3次，去除划下的细胞，加入无血清培养基，置于37 ℃、体积分数5% CO₂培养箱培养0，24 h取样，拍照。

1.4.8 Western Blot检测Akt、p-Akt、Bax、Bcl-2蛋白表达 培养24 h后，消化收集各组细胞，提取细胞总蛋白，取蛋白约30 μg，加入总蛋白抽提试剂1 mL(含蛋白酶抑制剂)，制成匀浆，抽提总蛋白。按BCA蛋白质定量试剂盒操作说明，检测样品浓度。将准备好的样品液和预染蛋白marker分别上样，电泳分离蛋白。将蛋白质转移到PVDF膜，按Bio-Rad蛋白转移装置说明组装滤纸凝胶纤维素夹层，在30 mA恒流条件下4 ℃转移过夜。将膜在5%脱脂奶粉溶液中室温孵育1 h，在封闭过的膜中加入一抗(小鼠抗大鼠β-actin抗体、兔抗大鼠Akt抗体、兔抗大鼠p-Akt抗体、兔抗大鼠Bax抗体、兔抗大鼠Bcl-2抗体)室温孵育1.5 h，加入HRP标记的二抗室温孵育1 h，进行ECL化学发光法检测。采用凝胶成像分析软件计算目的蛋白相对表达量。

1.5 主要观察指标 ①各组内皮祖细胞的增殖、凋亡及迁移能力；②各组内皮祖细胞的Akt、p-Akt、Bax、Bcl-2蛋白表达；③各组内皮祖细胞内超氧化物歧化酶、丙二醛、一氧化氮水平。

1.6 统计学分析 研究结果采用统计学软件SPSS 20.0进行统计学分析，如符合计量资料正态分布，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

内皮祖细胞是由Asahara等^[26]首次从人外周血单个核细胞分离出来的CD34⁺和VEGFR2⁺单核细胞，可归巢于新生血管组织，为具有分化为成熟内皮细胞能力的干细胞，在内皮修复与血管新生中发挥着重要作用。研究证实，内皮祖细胞的数量和功能受损可导致血管内皮细胞功能障碍，促使动脉粥样硬化的发生^[27-28]。因此，保护内皮祖细胞的功能可延缓或防止动脉粥样硬化的发生。

天然动植物活性成分具有较强的生理活性，并且毒副反应小，近年来受到广泛关注。人参皂苷是人参的主要活性成分，组成成分复杂，目前已知的人参皂苷单体有40多种，主要分为Rg组与Rb组。人参皂苷药理作用广泛，对心脑血管系统、中枢神经系统、血液系统和免疫系统均有良好的药理作用^[29-31]，其单体成分的作用也逐渐成为研究热点。人参皂苷Rg1作为人参皂苷的主要单体成分，近年来在心血管疾病方面展现了良好的药理活性，因此该研究主要观察人参皂苷Rg1对内皮祖细胞损伤的保护作用及可能机制。

研究表明，氧化应激损伤是大多数心脑血管疾病中内皮细胞损伤的重要机制，如动脉粥样硬化、糖尿病、高血压与心肌梗死等^[32-34]。该研究采用过氧化氢诱导内皮祖细胞氧化应激损伤模型，研究已证实此系统具有稳定性、科学性，且简便易行^[35-36]。研究结果显示经100 μmol/L过氧化氢干预后，内皮祖细胞的存活率明显下降，凋亡明显增加，迁移能力明显下降，说明内皮祖细胞功能受损。采用64 μmol/L的人参皂苷Rg1预干预后，人参皂苷Rg1组内皮祖细胞的存活率明显上升，凋亡明显减少，迁移能力明显提高，说明人参皂苷Rg1可对抗过氧化氢对内皮祖细胞的氧化应激损伤，发挥保护作用。

氧化应激损伤主要是体内氧化与抗氧化平衡被破坏，自由基生成过多而导致的^[33-34]。一氧化氮是由一氧化氮合酶合成的自由基，具有重要的功能效应，可保护血管内皮细胞，调节血管张力，抑制血小板聚集，抑制炎症反应，抗动脉粥样硬化^[37]。实验结果显示，经100 μmol/L过氧化氢干预后，内皮祖细胞内一氧化氮水平明显下降，说明一氧化氮的生物利用度降低，内皮祖细胞功能发生障碍；采用64 μmol/L人参皂苷Rg1预先干预后，人参皂苷Rg1组内皮祖细胞的一氧化氮水平明显提升，说明人参皂苷Rg1可对抗过氧化氢对内皮祖细胞的氧化应激损伤，保护细胞功能。超氧化物歧化酶是一种通过歧化方式清除体内氧自由基，保护细胞与细胞基质的生物酶，其可对抗或阻断氧自由基对细胞造成的损伤，修复受损细胞，恢复其功能，可作为机体清除自由基能力的间接指标^[38]。研究结果显示过氧化氢干预后，内皮祖细胞超氧化物歧化酶活性明显下降，而人参皂苷Rg1可提升超氧化物歧化酶活性，修复内皮祖细胞损伤。丙二醛是评估机体脂质过氧化程度的一个重要指标，其含量可间接反映细胞损伤程度^[39]。研究结果显示过氧化氢干预后，内皮祖细胞丙二醛水平明显升高，而人参皂苷Rg1可降低内皮祖细胞内丙二醛水平，修复内皮祖细胞损伤。实验结果证实，人参皂苷Rg1可降低过氧化氢诱导的内皮祖细胞氧化应激损伤，发挥细胞保护作用。

Akt信号通路是与细胞增殖、凋亡、迁移相关的信号通路^[40]。研究结果发现过氧化氢干预后，内皮祖细胞Akt蛋白表达无明显变化，但是p-Akt蛋白表达明显下降；说明氧化应激损伤抑制了Akt蛋白的活化，诱发细胞凋亡；人参皂苷Rg1可明显抑制氧化应激损伤造成的p-Akt蛋白表达下降，抑制细胞凋亡。研究结果表明，人参皂苷Rg1可能通过激活Akt信号通路，对抗过氧化氢造成的内皮祖细胞氧化应激损伤，发挥细胞保护作用。但是内皮祖细胞修复机制复杂，可能涉及不同的信号通路，具体的信号通路研究仍需探索。另外下一步将分析人参皂苷Rg1干预浓度与时间对过氧化氢诱导内皮祖细胞损伤的作用，同时将进一步明确Akt信号通路的具体作用。

综上可以看出，人参皂苷Rg1可对抗过氧化氢诱导的内皮祖细胞损伤，提高细胞活力，抑制细胞凋亡，降低氧化应激损伤，Akt信号通路在其中可能发挥了一定作用。

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