miR-124抑制Notch通路促进神经干细胞增殖与分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0669

摘要/Abstract

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文题释义：
miR-124：是一种在线虫、小鼠和人体细胞内均有表达的非编码小RNA，前期研究发现miR-124是神经细胞中表达最为丰富的小RNA，并且在神经分化过程中起着极其重要的作用。
神经干细胞：是中枢神经系统中的一类细胞，具有细胞增殖和分化能力的特点，是神经细胞发育早期特定的细胞群体。深入研究神经干细胞的增殖与分化等生理过程，为神经系统损伤和退行性疾病的治疗带来了希望。

摘要
背景：如何在体外快速而高效的获得大量高纯度神经细胞是目前国内外细胞移植治疗领域所面临的一个巨大挑战和难题。
目的：探讨miR-124是否通过调控Notch通路对神经干细胞增殖与分化产生影响。
方法：分离胎鼠神经干细胞，利用免疫荧光法进行鉴定，采用RT-qPCR法检测神经干细胞分化1，2，4，7 d后miR-124表达情况，利用瞬时转染法分别过表达和干扰miR-124后，采用MTT法和免疫印迹法检测ki-67蛋白表达水平观察细胞增殖情况，采用RT-qPCR法和免疫印迹法检测β-tubulin Ⅲ表达水平观察细胞分化情况，采用RT-qPCR法检测Notch通路相关蛋白HES1，HEY2和CCND1的mRNA表达。
结果与结论：①神经干细胞在向神经细胞分化过程中，miR-124的表达水平显著升高；②过表达miR-124不仅能够促进细胞增殖与分化，同时对Notch通路相关蛋白起到了抑制作用；③抑制miR-124表达起到了与上述相反的作用；④以上结果提示miR-124可能通过抑制Notch通路促进神经干细胞的增殖与分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-5742-9252(何频)

关键词: miR-124, 神经干细胞, Notch, 细胞增殖, 细胞分化, 干细胞

Abstract:

BACKGROUND: How to quickly and efficiently obtain enough pure neurons in vitro is a huge challenge and problem faced by the scientists in the cell-transplantation field.
OBJECTIVE: To explore whether miR-124 can influence the proliferation and differentiation of neural stem cells by regulating the Notch pathway.
METHODS: The fetal rat neural stem cells were isolated and identified by immunofluorescence. RT-qPCR was used to detect the expression of miR-124 after 1, 2, 4, and 7 days of neural stem cell differentiation. After overexpression and interference with miR-124 via transient transfection, the expression of ki-67 protein was detected by MTT assay and immunoblotting. RT-qPCR and immunoblotting were used to detect β-tubulin III expression for determination of miR-124 effects on cell differentiation. RT-qPCR was used to detect the mRNA expression of Notch pathway-related proteins HES1, HEY2 and CCND1.
RESULTS AND CONCLUSION: During the differentiation of neural stem cells into neurons, the expression of miR-124 was significantly upregulated. Moreover, miR-124 overexpression promoted the proliferation and differentiation of NSCs, and suppressed the expression of proteins in the Notch pathway. Silencing the miR-124 expression, however, achieved the opposite results. The above results suggest that miR-124 may promote the proliferation and differentiation of neural stem cells by inhibiting the Notch pathway.

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Key words: MicroRNAs, Neural Stem Cells, Receptors, Notch, Cell Proliferation, Cell Differentiation, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

何频，郭富强. miR-124抑制Notch通路促进神经干细胞增殖与分化[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(33): 5344-5349.

He Pin, Guo Fu-qiang. miR-124 facilitates the proliferation and differentiation of neural stem cells by inhibiting the Notch pathway[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(33): 5344-5349.

图/表（结果） 2

2.1 大鼠神经干细胞形态及鉴定结果 分离的大鼠神经干细胞保持自我增殖和未分化状态，主要以神经球的形式贴壁生长，细胞排列紧密，克隆边缘清晰(图1A)。Nestin是神经干细胞的重要检测指标，细胞传代后24 h，利用免疫荧光法对细胞进行染色鉴定，约有90%以上神经干细胞为Nestin阳性，且与细胞核共定位(图1B-D)，说明分离的细胞为神经干细胞。

2.2 miR-124在大鼠神经干细胞中的表达 神经干细胞向神经细胞诱导分化1，2，4，7 d后，miR-124的表达水平随着时间推移显著升高(图2A)；然后通过瞬时转染miR-124 mimic过表达miR-124以及转染miR-124 inhibitor干扰miR-124表达，在转染48 h之后，过表达组和干扰组的miR-124水平与空载对照组比较差异有显著性意义(P < 0.01，图2B，C)，提示转染效果确切。

2.3 miR-124对神经干细胞增殖的影响 神经干细胞分别转染miR-124 mimic和miR-124 inhibitor 24，48，72 h后，采用MTT法检测各组细胞的体外增殖情况，在miR-124 mimic转染24 h后，miR-124过表达组的细胞增殖速度显著高于无意义链对照组(图3A)；在miR-124 inhibitor转染48 h后，miR-124干扰组的细胞增殖速度显著低于无意义链对照组(图3B)。为进一步验证上述实验结果，神经干细胞分别转染miR-124 mimic和miR-124 inhibitor 48 h后，又采用免疫印迹检测法检测各组细胞的细胞增殖标记物ki-67的表达水平(图3C和3D)，与MTT法检测结果类似。以上结果提示，miR-124表达可以显著促进大鼠神经干细胞在体外的增殖。

2.4 miR-124对神经干细胞分化的影响 神经干细胞分别转染miR-124 mimic和miR-124 inhibitor 48 h后，转染miR-124 mimic组神经元特异标记分子β-tubulin Ⅲ的mRNA(图4A)和蛋白(图4C)表达水平较对照组均显著升高。转染miR-124 inhibitor组β-tubulin Ⅲ的mRNA(图4B)和蛋白(图4D)表达水平较对照组均显著下降，提示miR-124可促进神经干细胞向神经元分化。

2.5 miR-124对神经干细胞Notch通路的影响 研究发现，Notch信号通路能够通过调节靶基因的表达，进而影响细胞的增殖、存活、凋亡等生理过程。在转染miR-124 mimic和miR-124 inhibitor 48 h后，通过RT-qPCR检测Notch信号通路下游靶基因HES1，HEY2和CCND1 mRNA表达。结果显示，转染miR-124 mimic后，HES1(图5A)，HEY2(图5B)和CCND1(图5C)的mRNA表达水平较对照组均显著降低。转染miR-124 inhibitor后，HES1(图5D)，HEY2(图5E)和CCND1(图5F)的mRNA表达水平较对照组均显著升高。以上结果提示，miR-124在体外促进神经干细胞的增殖和分化的作用可能是通过抑制Notch信号通路来实现的。

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引言

哺乳类动物神经系统的神经发生是一个极其复杂的生物过程，其中神经干细胞扮演了非常关键的角色。神经干细胞是一类位于室管膜和海马齿状回等区域的具有多向分化潜能、自我更新能力的未分化神经前体细胞^[1]，其可以分化为星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元等大脑各类型细胞^[2]。然而，如何在体外条件下快速而高效的获得大量高纯度神经干细胞仍是目前国内外科学家所面临的一个巨大挑战和难题^[3]。

miRNA是一类长度为22-24个核苷酸的单链非编码转录因子，其在特定条件下通过与靶基因的3'端配对结合后可成功启动转录抑制或者mRNA降解，从而参与细胞分化、增殖、凋亡和迁移等一系列生物学过程，而miRNA的调节异常已被证实与诸多疾病的发生发展有关^[4]。更重要的是，近年来越来越多的研究显示miRNA通过作用于各种干细胞调节因子，参与了神经干细胞的自我更新、发育、增殖和分化等过程^[5-7]。miR-124是特异性表达于成年大脑中的miRNA，是大脑中表达最丰富且研究最为透彻的miRNA之一^[8]。近年来有研究提示miR-124在神经分化过程中呈过表达状态^[9]，但是miR-124是否参与调节神经干细胞增殖和分化过程，以及分子机制目前仍未完全阐明。

Notch通路是在生物进化上高度保守的信号通路，其在细胞增殖、分化、凋亡等生物学过程中均扮演着关键的角色^[10-11]。作为神经干细胞的重要调节因子，已有大量证据显示Notch分子通路在神经系统的发育过程中具有重要作用^[12]。

实验结果证实miR-124在神经干细胞的分化过程中呈高表达状态，且随分化时间延长表达逐渐升高，同时过表达miR-124可显著促进神经干细胞的增殖和分化，其可能是通过抑制Notch通路活性来实现的，现报道如下。

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材料方法

1.1 设计 细胞学体外观察实验。

1.2 时间及地点 实验于2016年10月至2017年10月在西南医科大学临床医学院完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 SPF级孕13.5 d SD大鼠5只，体质量(250±30) g，购于西南医科大学实验动物中心。

1.3.2 实验试剂 0.25%胰蛋白酶、胎牛血清、表皮生长因子、碱性纤维细胞生长因子、L-谷氨酰胺(GIBCO公司，美国)；B27(Invitrogen公司，美国)；神经营养素3、脑源性神经营养因子(PeproTech公司，美国)；白血病抑制因子(Sigma公司，美国)；Anti-Nestin(Abcam公司，美国)；ki-67抗体、β-tubulin Ⅲ抗体(Abcam公司)；miR-124 mimic，miR-124 inhibitor和相应对照miR-control(吉满生物公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 大鼠神经干细胞的分离与培养 利用2%戊巴比妥钠麻醉SD孕鼠，无菌条件下取出胎鼠并在解剖镜下分离脑室管膜、脑室下区及海马等组织^[13-15]，剪碎后，加入0.25%胰蛋白酶消化约20 min，过40 μm滤网，用含胎牛血清的培养液终止消化，调整细胞浓度至5×10⁸ L^-1，接种于多聚赖氨酸包被的6孔板中，加入含有20 μg/L人表皮生长因子、10 μg/L碱性纤维细胞生长因子、1%N₂和青-链霉素的DMEM/F12培养基进行培养，置于37 ℃，体积分数为5% CO₂恒温培养箱中培养，每2 d半量换液。

1.4.2 细胞免疫荧光鉴定 将5×10⁸ L^-1神经干细胞接种于多聚赖氨酸包被的12孔板中，培养2 d后，加入40 g/L多聚甲醛室温固定10 min，PBS洗3遍，每次5 min；0.5% Triton X-100打孔5 min，PBS洗3遍，每次5 min；1%BSA室温孵育30 min后，加入1∶200稀释的Anti-Nestin抗体4 ℃孵育过夜，PBS洗3遍，每次5 min；加入1∶100稀释的Anti-Rabbit荧光二抗室温避光孵育1 h，PBS洗3遍，每次5 min；DAPI避光染色10 min，PBS洗3遍，用抗淬灭封固剂封固，荧光显微镜下观察。

1.4.3 神经干细胞向神经细胞分化 将5×10⁸ L^-1神经干细胞接种于多聚赖氨酸包被的12孔板中，加入分化培养基：含有1% N₂、2% B27、体积分数为0.5%胎牛血清、20 μg/L神经营养素3、20 μg/L脑源性神经营养因子、20 μg/L白血病抑制因子和2 mmol/L L-谷氨酰胺的DMEM/F12培养基，进行神经细胞分化培养。

1.4.4 神经干细胞过表达和干扰miR-124实验 将5×10⁸ L^-1神经干细胞接种于多聚赖氨酸包被的6孔板中，24 h后将10 μL转染试剂和10 μL miRNA(20 nmol/L)混和液加入细胞中，48 h后检测转染效率。

1.4.5 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)实验 神经干细胞诱导分化1，2，4，7 d检测miR-124表达水平，神经干细胞转染miRNA 48 h后检测细胞分化和Notch通路相关分子表达水平。移去培养液，加入Trizol裂解液，按RNA提取试剂盒说明书操作，提取总RNA并利用反转录试剂盒获得cDNA。RT-qPCR操作按照试剂盒说明书进行。分别以β-tubulin Ⅲ，HES1，HEY2，CCND1和miR-124为引物，以大鼠β-actin和U6作为内参，反应体系为20 μL。RT-qPCR引物见表1。

1.4.6 MTT法检测细胞增殖情况 神经干细胞转染miRNA 0，24，48，72 h，移去培养液，加入0.5 g/L的MTT 37 ℃孵育4 h，弃去MTT后加入150 μL二甲基亚砜，避光条件下培养板剧烈摇晃10 min，利用酶标仪测试570 nm下的吸光度值，每组实验至少重复3次并收集数据。

1.4.7 蛋白免疫印迹检测ki-67、β-tubulin Ⅲ蛋白表达 神经干细胞转染miRNA 48 h后，移去培养液，加入细胞裂解缓冲液，冰上裂解细胞10 min，12 000 r/min离心10 min，提取蛋白质，采用BCA法进行蛋白定量后将其煮沸变性，取等量样品以10%的SDS-PAGE进行电泳，将蛋白转印至硝酸纤维素膜上，将硝酸纤维素膜浸泡于5%脱脂牛奶中室温封闭2 h，加入ki-67，β-tubulin Ⅲ和GAPDH抗体(1∶1 000) 4 ℃孵育过夜，再用辣根过氧化物酶标记的特异性二抗(1∶5 000)室温摇床孵育1 h，1×TBST漂洗3遍，每遍5 min，加入化学发光底物并在凝胶成像系统进行显影，用美国国立卫生研究院开发的Image J软件对条带灰度进行分析。通过计算各组目的蛋白条带的灰度值与内参蛋白GAPDH灰度值的比值，对目的蛋白进行半定量并比较各组间表达水平的差异。

1.5 主要观察指标 ①神经干细胞的形态；②转染miR-124模拟剂、抑制剂后细胞增殖情况；③转染miR-124模拟剂、抑制剂后miR-124 mRNA表达、细胞分化和Notch通路相关分子mRNA表达；④转染miR-124模拟剂、抑制剂后细胞增殖和分化相关蛋白表达。

1.6 统计学分析 实验数据采用Image J软件进行采集，利用统计分析软件GraphPad Prism，采用t 检验或单因素方差分析进行比较，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

作为一种神经前体细胞，神经干细胞具有自我更新并分化为大脑各类细胞(如神经元、星形胶质细胞等)的能力^[2^，^16]。理论上，因其具有多向分化的潜能，基于该细胞的细胞替代治疗可为人类许多神经系统疾病带来希望。然而在实际的临床应用中，神经干细胞替代治疗仍处于非常早期的基础研究阶段，其最大的障碍是如何促进神经干细胞的增殖、分化、成熟和最终在受体大脑中建立具有神经功能的神经和突触联系^[17]。生理情况下，脊椎动物体内神经干细胞干性的维持及其分化都受到体内复杂信号网络的严格调控^[18]，也正由于其调控的复杂性，科学家们始终未能找到在体外有效控制神经干细胞增殖和分化的途径和方法。

实验成功分离出大鼠神经干细胞，并在后续的诱导分化实验中发现随着诱导时间的推移，miR-124在神经干细胞中的表达水平逐渐升高，这与前期文献报道的miR-124在神经分化过程中呈高表达的结果一致。为探究高表达的miR-124是否参与了神经干细胞向神经元的分化过程，分别向细胞内转染了过表达miR-124和干扰miR-124表达的质粒并观察二者对神经干细胞增殖和分化的影响，实验结果显示过表达miR-124可显著促进大鼠神经干细胞在体外的增殖。更重要的是，进一步研究结果发现过表达miR-124可显著提高神经元特异性标记物β-tubulin Ⅲ的mRNA和蛋白的表达水平，而干扰miR-124表达则观察到相反的结果，这提示miR-124过表达可以促进神经干细胞向神经元方向的分化。增殖和分化是干细胞的两大重要细胞生物学行为，二者虽说是一定程度上存在相对对立的关系，但事实上二者往往是你中有我、我中有你而伴随出现，在该研究中发现miR-124同时具有促进大鼠神经干细胞增殖和分化的作用，这与前期报道的miR-1297等作用相似^[19-21]，为miR-124对神经干细胞的作用增加了新的证据，也为miR-124在SD大鼠源性神经干细胞分化过程中的表达提供了更加连续性的表达规律，为进一步研究miR-124对神经干细胞的作用提供了线索。鉴于细胞增殖和分化既对立又密不可分的关系，作者推测miR-124虽对二者都有促进作用，但是在不同条件和时间窗下对二者的促进程度是存在差异化的，即在特定条件下促进干细胞增殖为主，促分化作用为辅，反之亦然。同时，有文献证实，miR-124过表达抑制了神经干细胞向胶质细胞分化，该结果不但证实了miR-124在神经干细胞神经向分化中的重要作用，也为将来在体内外诱导神经干细胞分化获取大量神经元提供了线索和潜在的途径。

Notch信号通路已经被诸多研究证实在神经发育过程中扮演着非常重要的角色。在神经发育过程中，表达于中枢神经系统的Notch配体和受体与神经前体细胞的增殖、维持和分化等过程密切相关^[22]。据文献报道，激活Notch信号通路有利于神经干细胞干性的维持，而抑制Notch信号通路则可促进神经干细胞的神经向分化过程^[23-25]。正是鉴于Notch信号通路在神经发育过程中的关键作用，作者推测Notch通路有可能也参与了miR-124对神经干细胞神经向分化的调节过程。在当前研究中，RT-qPCR结果表明过表达miR-124后，神经干细胞中Notch信号通路下游靶基因HES1，HEY2和CCND1均显著低于对照组水平，而与之相反，干扰神经干细胞中miR-124的表达则可显著上调3者的表达水平。因此，以上结果提示miR-124在体外促进神经干细胞的增殖和分化是通过抑制Notch信号通路来实现的，这与文献报道的抑制Notch信号通路可促进神经干细胞神经向分化的结果一致^[24]。

总之，该研究不但发现miR-124可以促进神经干细胞在体外的增殖和分化，更重要的是，抑制Notch信号通路是miR-124发挥对神经干细胞增殖和分化调节作用的重要分子机制，这也为神经退行性疾病等相关神经系统疾病提供了新的治疗策略。然而，尽管发现miR-124是通过调节Notch信号通路来参与调控神经干细胞的分化，但是其是否还作用Notch信号通路的其他靶点甚至其他信号通路而发挥其对神经干细胞分化的调节作用，仍需未来进一步的研究加以阐明。

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