2.1   大鼠肠道平滑肌细胞的生长与形态表征   倒置显微镜下观察新分离的细胞呈椭圆形或梭形，长度各异，提示细胞可能处于不同的收缩舒张状态。培养36 h后细胞均已贴壁，呈梭形或多边形，单个细胞核居中，为卵圆形；胞质向外伸出长短不一的突起，多数细胞有两三个突起；细胞较悬浮状态时折光度降低，立体感强，胞浆丰富，无明显颗粒和空泡，见图2A。细胞贴壁后可行体外传代扩增，但培养至第3代后，Ki67免疫荧光染色阳性细胞数量降低，占总细胞百分比减少，见图2B，C。第6代后细胞体积增加，形态呈衰老形态。



为了鉴定分离后的肠道平滑肌细胞，分别检测了平滑肌细胞的特异性标志蛋白α-SMA、Desmin的表达。免疫荧光染色显示：肠道平滑肌细胞均阳性表达α-SMA(+)、Desmin(+)，Vimentin(+)，见图3A。与之相一致，RT-PCR检测结果也显示：所分离的细胞在基因转录水平可高表达标志基因desmin，α-sma，vimentin，见图3B。上述结果证明已成功分离获得了新生大鼠肠道平滑肌细胞。



2.2   肠道平滑肌胶原条带的成功制备与表征   倒置相差显微镜下可观察到：大鼠肠道平滑肌细胞均呈现圆形，均匀分布于胶原凝胶内。胶原在模具内凝固后，大体可见胶原条带紧紧收缩环绕在琼脂糖凝胶柱的周边，见图1A。由于收缩后的条带变得更为致密，导致透光性下降，因而在镜下难以进行清晰成像拍照。但镜下仍能够辨认出肠道平滑肌细胞形态变得更加伸展。随着培养时间的延长，胶原条带内的细胞数量有所增加，这提示胶原不但能够为肠道平滑肌细胞体外维持培养提供三维培养空间，而且还有利于细胞增殖与活性的体外维持。
对胶原条带内肠道平滑肌细胞进行EthD-1/Calcein-AM活性染色发现：大多数细胞均显示绿色荧光，少有细胞被EthD-1染色而显示红色荧光，见图4A。该结果表明条带内肠道平滑肌细胞具有良好的细胞活性。
2.3   周期性拉伸维持培养对胶原条带平滑肌细胞生长表型与基因表达的影响   为了优化胶原条带的体外维持培养条件，实验室自行设计搭建了可用于胶原条带拉伸的机械装置。当把胶原条带搭载到拉伸臂后，因为受到机械张力的作用，游离的条带不会发生“shrink”，从而利于胶原条带和条带内细胞保持其初始形态。
Whole-mount洋红组织学染色结果显示：不同培养条件下(动态拉伸培养或静态培养)，胶原条带内细胞的生长形态差异显著，见图4B。经拉伸培养后，肠道平滑肌细胞形态显示为典型的长梭形，细胞长轴多沿胶原条带的长轴反向进行纵向排列，显示出明显的排列方向性—该特征与其体内形态更为接近。与该结果相一致，细胞活性染色和细胞骨架荧光染色结果又进一步明确了这种定向排列的分布特征：细胞方向性排列，具有良好的细胞活性。而与之相对比，静态培养胶原条带内的细胞形态并未呈现出明显的延展拉伸形态特征，且在胶原条带内的分布排列随机，并不具备明显的方向性。此外研究结果还发现：对比静态培养条件下的平滑肌胶原条带，经体外周期性拉伸培养的胶原条带内Ki67阳性表达的细胞数量增多，见图4A。这提示周期性拉伸动态培养条件可能更利于肠道平滑肌细胞在体外三维培养过程中维持增殖活性。 定量RT-PCR检测结果显示：与静态培养组相比，拉伸培养组内肠道平滑肌细胞可显著高表达标志性基因desmin、α-sma、vimentin，见图4C。该结果证明：周期性机械力学刺激能够促进肠道平滑肌细胞的功能性分化。

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人体肠道是消化、吸收营养和水分、抵御病原体以及清除废物的重要器官。多种肠道疾病比如炎症性肠病、短肠综合征[1]、癌症等严重影响了人类的生活质量和生命健康[2]。现有相关疾病的医疗策略有很大的局限性：一方面全胃肠外营养会导致短肠综合征患者死亡率升高[3-4]；另一方面肠道移植面临供者短缺、器官排斥和需要终身免疫抑制治疗等问题。因此，通过组织工程体外构建功能性肠道以实现替代治疗将可能为患者带来新的希望[5-6]。
生理肠道的肠壁主要包括黏膜层、黏膜下层、肌层以及外膜层4层组织结构。目前组织工程化肠道的体外构建大多聚焦于肠道黏膜上皮的构建与评价研究[7-8]。肠道内环外纵排列的平滑肌层不仅为肠壁提供主要的结构支持，而且在肠道的功能维持方面也发挥重要作用，比如肠道蠕动、免疫激活等。近年来肠平滑肌功能障碍被发现与多种疾病有关，包括肠假性梗阻、短肠综合征和帕金森病[9-10]。因此，优化肠道平滑肌细胞培养体系对于功能性组织工程化肠道的构建和肠道疾病的研究均具有重要意义，但目前相关研究并不多见。
该研究以大鼠原代肠道平滑肌细胞为种子细胞，以胶原基质为培养支架，尝试建立肠道平滑肌细胞胶原条带培养体系，同时结合自主设计的拉伸培养装置对胶原条带实施周期性动态拉伸培养，通过对照静态培养体系，初步探索不同培养条件对胶原条带内细胞生长活性以及功能基因表达的影响。该研究预期建立肠道平滑肌胶原条带体外维持培养体系，从而为功能性组织工程化肠道的优化构建和肠道平滑肌相关疾病的研究奠定理想的模型基础。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1   设计   体外组织工程构建与观察实验，以大鼠原代肠道平滑肌细胞为种子细胞，以胶原基质为培养支架，建立肠道平滑肌细胞胶原条带培养体系，并对其实施周期性动态拉伸培养，组间比较采用t检验。
1.2   时间及地点   实验于2023年3-7月在大连医科大学组织胚胎学实验室完成。
1.3   材料
1.3.1   实验动物   新生SD大鼠4-6只，雌雄不限，体质量12-16 g；雌性成年SD大鼠1只，体质量220 g，由大连医科大学动物实验中心提供。所有动物实验及操作均按照大连医科大学动物伦理委员会规定进行，审批号为AEE23106。
1.3.2   实验试剂和仪器   胶原酶Ⅱ型、高糖DMEM培养基(Gibco)；多聚赖氨酸(Beyotime)；青链霉素混合液 (Solarbio)；胰蛋白酶-EDTA消化液(Solarbio Life Sciences)；琼脂糖(Biowest)；洋红(Sigma)；多聚甲醛、抗体稀释液、中性树胶(Solarbio)；异丙醇、二甲苯(科密欧)；Trizol试剂(Ambion Life Technologies)；Live/Dead染色试剂盒(Invitrogen)；鼠尾胶原(Collagen I)(Corning)；DAPI、肌间线蛋白(Desmin)兔抗人多克隆抗体(Proteintech)；波形蛋白(Vimentin)兔抗人多克隆抗体、Ki67兔抗人多克隆抗体、α-平滑肌肌动蛋白(alpha- smooth muscle actin，α-SMA)兔抗人多克隆抗体(Abcam)；细胞培养箱、超净工作台(Thermo)；激光共聚焦显微镜(Leica DM4000B)；PCR仪(BIO-RAD)；恒温培养振荡器(上海智城)。
1.4   实验方法   
1.4.1   大鼠肠道平滑肌细胞的分离培养   新生SD大鼠经体积分数75%乙醇浸泡15-30 min后沿腹部正中线打开腹腔，取出小肠并纵向剖开，然后用含2%双抗的PBS溶液反复漂洗，保留1.0-2.0 cm小肠备用。在解剖显微镜下分离肠肌层，机械剪碎组织后加入0.2%胶原酶Ⅱ水浴(37 ℃)消化40 min；然后用细胞筛过滤收集所有消化后组织悬液；离心后(1 500 r/min，5 min)重悬细胞沉淀至含体积分数10%胎牛血清、1%青链霉素的高糖DMEM培养基；计数细胞数量，以5×106密度接种至经多聚赖氨酸溶液(0.01 mg/mL)预包被的10 cm培养皿中，置于37 ℃、体积分数5% CO2细胞培养箱中静置培养。此后每3 d更换1次培养基，待细胞达90%融合后常规消化传代，标记细胞代数。批量冻存原代细胞(P1-P3)以备实验使用。
1.4.2   大鼠肠道平滑肌细胞的鉴定
(1)免疫荧光染色：收集原代肠道平滑肌细胞的细胞爬片，经PBS冲洗后用40 g/L多聚甲醛溶液固定，经PBS清洗、0.5% Triton X-100溶液透膜、体积分数5%山羊血清封闭液处理后，分别与鼠抗人Ki67抗体(1∶200)，α-SMA抗体(1∶200)，Desmin抗体(1∶200)和Vimentin抗体(1∶200)于4 ℃冰箱中孵育12 h，经PBS充分清洗后与二抗羊抗鼠-Alexa Fluor™ 488(1∶1 000)于室温孵育约1 h，用DAPI液(2 μg/mL)室温复染细胞核15 min，抗猝灭封片剂封固，荧光显微镜下观察拍照。

(2)定量RT-PCR：取大鼠小肠组织以及离心收集原代肠道平滑肌细胞沉淀，加入TRIZOL液溶解后采用氯仿-异丙醇方法提取总RNA，微量核酸测定仪(Nanodrop2000)测定所提取RNA纯度与浓度。依据 PrimeScript™ RT Master Mix 试剂盒说明反转录合成cDNA，反应条件为：37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s、4 ℃保存。以cDNA为模板，依据SYBR® Premix Ex Taq™Ⅱ 试剂盒进行PCR扩增，引物序列见表1。

扩增条件为：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性3 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，40个循环。实验中以Gapdh为内参、使用2-ΔΔCt法计算相对表达量。每组样品至少设置 3个复孔并进行3次独立重复实验。
1.4.3   鼠尾胶原制备   取1只成年SD大鼠鼠尾，体积分数75%无水乙醇浸泡24 h灭菌，剥离皮肤后将其剪成小节，抽取暴露的尾腱，并将之剪碎溶于100 mL体积分数0.1%冰醋酸，4 ℃放置待其充分溶解后，干燥差重法粗测胶原溶液浓度，所得胶原溶液放置4 ℃保存备用。
1.4.4   肠道平滑肌胶原条带的体外构建与维持培养   应用2%琼脂糖溶液用于胶原条带制备的模具，见图1。待琼脂糖凝胶模具定型后，采用无血清高糖DMEM培养基平衡24 h。平滑肌胶原条带的制备过程：首先将胶原溶液(2 mg/mL)与10×高糖DMEM溶液按9∶1体积比混合，然后加入适量NaOH溶液(2 mol/L)调整pH值至中性，调整胶原溶液终质量浓度为2 mg/mL，置于冰浴内备用。
(1)静态培养：将原代肠道平滑肌细胞(1×109 L-1)与胶原溶液(2 mg/mL)充分混匀并快速接种至琼脂糖凝胶模具，第2天脱模，获得环状条带，将其放入6孔板中，加入肠道平滑肌细胞培养基维持培养4 d，隔天换液。
(2)拉伸培养：将原代肠道平滑肌细胞(1×109 L-1)与胶原溶液(2 mg/mL)充分混匀并快速接种至琼脂糖凝胶模具，第2天脱模，获得环状条带，将其挂载至拉伸装置的拉伸臂部，按照30次/min的频率进行拉伸，持续拉伸4 d，隔天换液。

采用自制拉伸装置对平滑肌胶原条带进行拉伸培养，见图1C。该胶原条带拉伸装置由作者所在实验室自行设计组装，主要包括电机主件和拉伸臂原件2个功能单元。实验前先对拉伸装置进行紫外照射灭菌处理，然后将平滑肌胶原条带从琼脂糖模具上缓慢脱离，挂载至拉伸装置的拉伸臂部，打开控制电机即可实现对胶原条带的周期性机械拉伸。设定参数为：频率30次/min，整个胶原条带拉伸培养装置在培养过程中放置于细胞培养箱内，体外培养4 d，更换新鲜培养基2次。

1.5   主要观察指标   
1.5.1   细胞活性染色   培养4 d后分别收集静态培养和拉伸培养的平滑肌胶原条带，PBS清洗后直接加入EthD-1/Calcein-AM细胞活性染液，37 ℃避光孵育2 h，然后用PBS清洗两三次以去除多余染液，最终置于激光共聚焦显微镜下进行观察、拍照。其中活细胞因产生钙黄绿素呈现绿色荧光，而死亡细胞则因细胞膜受到破坏而易于被EthD-1染色，呈现红色荧光。
1.5.2   洋红染色观察细胞的形态   培养4 d后分别收集静态培养和拉伸培养的平滑肌胶原条带，经PBS清洗后用40 g/L多聚甲醛室温固定，PBS冲洗，加入1%洋红染液，在室温避光条件下振荡染色24 h，然后将样品依次放入体积分数30%，70%，90%，100%无水乙醇中梯度脱水，再经二甲苯溶液透明后滴加中性树胶进行封固，37 ℃烘箱干燥，Keyence显微镜下观察并拍照。
1.5.3   细胞骨架-Ki67免疫荧光染色观察细胞的生长与增殖情况   培养4 d后分别收集静态培养和拉伸培养的平滑肌胶原条带，用40 g/L多聚甲醛室温固定，经PBS清洗、0.5% Triton X-100溶液透膜、体积分数5%山羊血清封闭液处理后，与鼠抗人Ki67抗体(1∶200)于4 ℃冰箱中孵育12 h，经PBS充分清洗后与二抗羊抗鼠-Alexa Fluor™ 488(1∶1 000)于室温孵育约1 h，经PBS充分清洗后用DAPI液(2 μg/mL)室温复染细胞核15 min，经PBS充分清洗后继续加入Phalloidin-FITC染液进行室温染色1 h，充分清洗后直接在激光共聚焦显微镜下进行观察、拍照。
1.5.4   定量RT-PCR检测平滑肌细胞的功能性基因表达   培养4 d后分别收集静态培养和拉伸培养的平滑肌胶原条带，加入TRIZOL液溶解后用氯仿-异丙醇方法提取总RNA，微量核酸测定仪(Nanodrop2000)测定所提取RNA纯度与浓度。反转录cDNA合成、目的基因PCR扩增以及结果分析如前1.4.2所述。
1.6   统计学分析   采用 GraphPad Prsim 8.0 软件进行统计分析，计量资料以x±s表示，组间比较采用t检验，P < 0.05为差异有显著性意义。该文统计学方法已经通过大连医科大学生物统计学专家审核。

肠道被称为人体的“第二大脑”，肠道的组织工程化构建研究越来越为基础医学和临床转化研究领域所关注[11-12]。功能性组织工程化肠道不但能够为肠道发育及疾病研究提供理想的生理与病理模型[13]，还能够为肠道衰竭患者提供理想的临床替代治疗潜能[14]，并且能够促进肠道术后恢复[15]，在临床具有广泛应用前景。
肠道的生理功能依赖于蠕动这一独特的运动模式[16]，主要由肠神经系统和平滑肌控制[17]。平滑肌是构成肠壁的重要组织结构，其特有的内环行、外纵行的组织学结构，不但能够为中空性肠壁提供机械支撑，而且还能协同肠道神经系统调控肠道功能所需的蠕动收缩力，其功能失调是导致肠动力障碍的重要因素。此外，肠道平滑肌细胞还参与肠道分化和维持黏膜上皮的稳态，在肠道炎症的发生、发展以及肠道神经-免疫微环境调节中发挥重要作用[18-19]。研究发现，在鸡胚中肠的胚胎发育过程中，肠神经系统的发育与早期肠平滑肌细胞的分化密切相关[20]。而在炎性肠病的早期阶段，肠道平滑肌还参与肠神经系统活性的调控，炎性细胞因子能够上调肠道平滑肌细胞中神经营养因子的表达水平[21]。在人类疾病和动物模型中，肠道平滑肌细胞的增生与肥大伴随炎性反应是肠道慢性炎症和纤维化的主要病理改变，即使在炎症缓解后也难以逆转，导致肠道狭窄，从而使肠道消化与吸收功能的异常[22]。由此可见，肠道平滑肌在肠道生理及病理性过程中均扮演重要角色。
该实验研究聚焦于肠道平滑肌层的组织工程化体外构建，以大鼠原代肠道平滑肌细胞为种子细胞，以鼠尾胶原为培养支架，同时结合自主设计的胶原条带拉伸培养装置，成功构建了肠道平滑肌细胞胶原条带培养体系，并建立了相关的细胞与组织学检测评价平台。前期也有肠道平滑肌模型体外构建的相关报道。有研究者先后以去细胞化细胞外基质[23-25]、胶原海绵[26-27]、负载生长因子的聚乙醇酸支架[28-29]、聚己内酯电纺丝为支架体外构建了平滑肌细胞的三维培养体系[30-31]。但这些培养体系内的平滑肌细胞随机分布，并不具备方向性排列，从而显著区别于体内肠道平滑肌“内环外纵”的特定排布特征。已有研究由于重建平滑肌层排列存在挑战而再生肠道平滑肌层失败[32]。为了进一步优化构建肠平滑肌三维模型，Bitar实验室通过接种兔结肠源纵层平滑肌细胞至经层粘连蛋白包被的具有纵行拓扑结构的硅胶模板表面，成功建立了具有纵向排列特征的平滑肌三维培养模型[33-34]；后期该团队进一步将兔结肠源环层平滑肌细胞接种在凝血酶聚合的纤维蛋白原水凝胶后再整合胶原-壳聚糖管状支架，成功构建了组织工程化环状平滑肌培养模型，该模型体系内平滑肌细胞不但具有与体内平滑肌细胞相似的组织形态学特征，而且还能够对生理相关神经递质如乙酰胆碱产生应答，从而表现出收缩与舒张的功能活性[28]。还有研宄通过构建取向性丝蛋白支架影响接种细胞的定向排列以模拟生理状态肠道结构[35]。近期作者所在实验室合作团队在此领域也有相关报道：采用经向和纬向卷曲整合的拓扑丝素蛋白纤维支架可仿生构建具有“内环外纵”结构特征的肠平滑肌层[36]。由此可见，肠道平滑肌的取向仿生构建已取得了若干具有重要意义的研究进展。
但需要指出是：上述研究中所构建的平滑肌培养模型却少有考虑机械力学因素对平滑肌细胞定向生长的影响。在胚胎早期，静态纵向的机械应力会导致肠道的延伸生长[37]，且肠道的蠕动高度依赖于机械刺激[38]。已有研究证明：机械力学刺激是促进肌细胞生长与分化的关键因素。对体外培养的心肌细胞施以周期性拉伸的机械刺激后，心肌细胞不但能够高表达特异性功能基因与蛋白(ZO-1，Occludin，Tropnin-T)，而且还能够改善肌丝定向排列和闰盘形成，进而增强细胞的功能活性[39]。与之相类似，对血管平滑肌细胞施加周期性力学刺激可显著提升血管平滑肌细胞的表型与功能活性[40]。该研究对所构建的肠道平滑肌胶原条带实施机械拉伸后，发现胶原条带内平滑肌细胞的增殖活性显著提高，且具有典型的拉伸后形态改变：长梭形胞体拉长，沿胶原条带长轴定向排列，同时显著上调标志性功能基因表达。这些结果均提示：机械力学刺激有利于平滑肌细胞在体外三维培养过程中维持体内的生长表型，并促进其功能性分化。该研究结果也为深入论证“机械力学刺激是促进肌细胞生长与分化的关键微环境因素”这一科学论点提供了新的实验数据支撑。
该研究模型构建采用大鼠原代肠道平滑肌细胞为种子细胞，原代细胞通常存在多次传代后增殖速度减慢的问题，因此控制种子细胞代数为3代以内。此外，所用的三维培养基质为生物相容性更为理想的胶原凝胶，这一方面更利于真实模拟体内肠道平滑肌细胞生长微环境中的基质因素，另一方面也利于在体外培养过程中实现机械性拉伸刺激。该研究对所构建的肠道平滑肌模型体系仅进行了细胞生长、形态和表型方面的基本评价，而有关功能活性的检测仍有待进一步深入完善。
综上，该研究以大鼠原代肠道平滑肌细胞为种子细胞，以鼠尾胶原条带为培养支架，同时结合自主设计的胶原条带拉伸培养装置，成功构建了肠道平滑肌细胞胶原条带培养体系。该研究工作将可能为组织工程化功能性肠道的体外构建奠定实验基础，同时所构建的肠道平滑肌胶原条带将可能为肠道平滑肌的生理及病理性研究提供新的模型工具。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：

胶原条带：鼠尾胶原溶液和10×高糖DMEM溶液与大鼠原代肠道平滑肌细胞混匀接种至琼脂糖凝胶模具，成胶后即获得胶原条带。
组织工程化肠道：由种子细胞和生物材料支架构成，通过组织工程方法体外模拟具有体内肠道组织细胞、形态和功能特性的模型。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

肠道是一个复杂的多层器官，由覆盖管腔表面的功能上皮、提供间充质框架的支持性黏膜下层和由肠神经系统支配的外部肌肉层组成，目前的肠道组织工程大部分局限于上皮或黏膜重建，已取得一些重要进展，比如使用患者来源的组织、通过血管内皮细胞的重新编程产生血管网络以及将现有结肠转化为小肠以治疗大鼠短肠综合征。本研究则着重于肠道肌层的构建。理想的组织工程化肠道需要考虑肠道的吸收、蠕动、内分泌、屏障和免疫等多个功能，未来的研究可能集中在优化利用干细胞和类器官技术，加快组织工程化肠道向临床的转化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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