葛根素通过Notch1信号通路抑制Raw264.7细胞向破骨细胞的分化

doi:10.12307/2024.595

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (35): 5636-5641.doi: 10.12307/2024.595

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葛根素通过Notch1信号通路抑制Raw264.7细胞向破骨细胞的分化

刘春丽，闫雨娟，莫礼文，吴志杰，张黎

海南医学院口腔医学院，海南省海口市 571101

收稿日期:2023-11-11 接受日期:2023-12-21 出版日期:2024-12-18 发布日期:2024-03-15
通讯作者: 张黎，副教授，海南医学院口腔医学院，海南省海口市 571101
作者简介:刘春丽，女，1989年生，海南省海口市人，汉族，主治医师，主要从事牙周病学研究。
基金资助:
海南省财政科技计划资助项目-海南省2020年重点研发计划社会发展专项(ZDYF2020166)，项目负责人：张黎；海南省财政科技计划资助项目-海南省2023年重点研发社会发展专项(ZDYF2023SHFZ095)，项目负责人：张黎

Puerarin inhibits the differentiation of Raw264.7 cells into osteoclasts through the Notch signaling pathway

Liu Chunli, Yan Yujuan, Mo Liwen, Wu Zhijie, Zhang Li

School of Stomatology, Hainan Medical University, Haikou 571101, Hainan Province, China

Received:2023-11-11 Accepted:2023-12-21 Online:2024-12-18 Published:2024-03-15
Contact: Zhang Li, Associate chief physician, School of Stomatology, Hainan Medical University, Haikou 571101, Hainan Province, China
About author:Liu Chunli, Attending physician, School of Stomatology, Hainan Medical University, Haikou 571101, Hainan Province, China
Supported by:
Hainan Provincial Finance Science and Technology Program Funding Project - Hainan Provincial Key R&D Program for Social Development in 2020, No. ZDYF2020166 (to ZL); Hainan Provincial Finance Science and Technology Program Funding Project - Hainan Provincial Key R&D Program for Social Development in 2023, No. ZDYF2023SHFZ095 (to ZL)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

葛根素：分离自临床常用中药葛根，是一种具有改善血液循环、预防肿瘤、抗炎和抗氧化的异黄酮衍生物，作者前期研究表明葛根素可以治疗牙周炎病变，抑制破骨细胞的分化和成熟。
Notch1信号通路：通过Notch1受体和配体的相互结合完成信息交换，可以调控细胞分化和功能。Notch信号通路是骨骼稳态调控的一种重要途径。

背景：前期研究表明葛根素干预后破骨细胞的分化被抑制，Notch1、HES1、Jagged1等Notch信号通路相关蛋白表达量下降，但Notch1信号通路对于葛根素抑制破骨细胞分化的作用机制尚不明确。

目的：探究Notch信号通路对葛根素抑制小鼠巨噬细胞Raw264.7分化为破骨细胞的影响。
方法：将Raw264.7细胞分为7组干预培养，空白对照组采用DMEM高糖完全培养基培养，破骨细胞诱导组采用破骨诱导培养基培养，葛根素干预组在破骨诱导的同时加入50 μmol/L葛根素培养，葛根素+Notch1 siRNA 对照组、葛根素+Notch1 siRNA组、葛根素+Notch1过表达对照组、葛根素+Notch1过表达组分别采用Notch1 siRNA对照序列、Notch1 siRNA序列、Notch1过表达对照质粒、Notch1过表达质粒转染Raw264.7细胞后，加入破骨诱导培养基和葛根素进行培养。培养7 d后，采用抗酒石酸酸性磷酸酶染色观察破骨细胞的数量和大小，F-actin染色观察破骨细胞骨架形成情况，RT-PCR检测破骨细胞形成标志物的基因表达水平。

结果与结论：①抗酒石酸酸性磷酸酶染色显示：葛根素干预可以抑制破骨细胞的生成，Notch1沉默会进一步减少破骨细胞的生成数量，Notch1过表达后破骨细胞生成数量明显增加；②F-actin染色显示：Raw264.7细胞经破骨诱导可以形成边界清晰的F-actin环，葛根素干预会抑制细胞骨架的形成，Notch1沉默会增强葛根素的抑制作用，而Notch1过表达则能减弱葛根素的抑制作用；③RT-PCR检测显示，葛根素可以抑制抗酒石酸酸性磷酸酶、组织蛋白酶K和c-Fos的mRNA表达，Notch1沉默后上述3个因子的mRNA表达进一步降低，Notch1过表达后上述3个因子的mRNA表达增加。结果表明：Notch信号通路在Raw264.7细胞分化为破骨细胞的过程中发挥作用，葛根素通过抑制Notch信号通路抑制Raw264.7细胞分化为破骨细胞。

https://orcid.org/0000-0003-2174-022X(刘春丽)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 葛根素, Raw264.7细胞, Notch1, 过表达, 沉默, 破骨诱导, 破骨细胞, 牙周炎

Abstract: BACKGROUND: Previous studies have shown that puerarin can inhibit the differentiation of osteoclasts, and the expression of Notch signaling pathway-related proteins such as Notch1, HES1, and Jagged1 is decreased. However, the specific mechanism of the Notch1 signaling pathway for the inhibition of osteoclast differentiation by puerarin is not clear.
OBJECTIVE: To explore the effect of Notch signaling pathway on puerarin inhibiting the differentiation of mouse macrophage Raw264.7 into osteoclasts.
METHODS: Raw264.7 cells were divided into seven groups for intervention culture. Blank control group was cultured in high-sugar DMEM medium; the osteoclast induction group was cultured in osteoclast induction medium; the puerarin intervention group was cultured with 50 μmol/L puerarin at the same time of osteoclast induction; Notch1 siRNA control group, Notch1 siRNA group, Notch1 overexpression control group and Notch1 overexpression group were transfected with Notch1 siRNA control sequence, Notch1 siRNA, Notch1 overexpression control plasmid and Notch1 overexpression plasmid, respectively, and then cultured with osteoclast induction medium and puerarin. The number and size of osteoclasts were observed by tartrate-resistant acid phosphatase staining, the skeleton formation of osteoclasts was observed by F-actin staining, and the gene expression level of osteoclast formation markers was detected by RT-PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: Tartrate-resistant acid phosphatase staining results showed that puerarin intervention could inhibit the generation of osteoclasts, Notch1 silencing could further reduce the number of osteoclasts, while the number of osteoclasts in the osteoclast-induced group increased significantly after Notch1 overexpression. The results of F-actin showed that Raw264.7 cells could form a well-defined F-actin ring after osteoclast induction. Puerarin intervention would inhibit the formation of cytoskeleton, and Notch1 silencing could aggravate the inhibitory effect of cytoskeleton formation, while Notch1 overexpression could alleviate this inhibitory effect of puerarin. RT-PCR results showed that puerarin could inhibit the mRNA expression levels of tartrate-resistant acid phosphatase, Cathepsin K and c-Fos, the expression of the above-mentioned three factors decreased significantly after Notch1 gene silencing, and Notch1 overexpression could upregulate the expression of these factors. These finding indicate that puerarin inhibits the differentiation of Raw264.7 cells into osteoclasts through the Notch signaling pathway.

Key words: puerarin, Raw264.7 cells, Notch1, overexpression, silence, osteoclast induction, osteoclast, periodontitis

中图分类号:

刘春丽, 闫雨娟, 莫礼文, 吴志杰, 张黎. 葛根素通过Notch1信号通路抑制Raw264.7细胞向破骨细胞的分化[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(35): 5636-5641.

Liu Chunli, Yan Yujuan, Mo Liwen, Wu Zhijie, Zhang Li. Puerarin inhibits the differentiation of Raw264.7 cells into osteoclasts through the Notch signaling pathway[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(35): 5636-5641.

图/表（结果） 6

2.1 Notch1干扰序列和过表达质粒筛选
2.1.1 Notch1 siRNA沉默效率与对照组相比，siRNA NC组Notch1 mRNA表达水平无明显差异，Notch1 siRNA1组、Notch1 siRNA2组、Notch1 siRNA3组Notch1 mRNA表达水平均显著降低，见图1。Notch1 siRNA1干扰效率最高，故后续实验选取Notch1 siRNA1序列进行基因沉默。

2.1.2 Notch1过表达质粒构建采用PCR体外扩增Notch1胞内编码区NCID，电泳结果显示在2 400 bp左右，与预期目标一致，见图2。A260/A280值位于1.8-2.0之间，纯度符合要求。实验成功采用双酶切法将扩增序列构建至pcDNA3.1-EGFP载体上。

2.2 沉默及过表达后Notch1及Hes1蛋白表达量与空白对照组相比，Raw264.7细胞转染siRNA 对照序列或过表达对照质粒后Hes1及Notch1蛋白表达水平无明显差异，而转染Notch1 siRNA后Notch1及Hes1蛋白表达水平明显下降，转染Notch1过表达质粒后Notch1及Hes1蛋白表达水平明显上升，见图3。

2.3 破骨细胞形成情况抗酒石酸酸性磷酸酶特异性表达于破骨细胞膜表面，抗酒石酸酸性磷酸酶染色结果显示：与空白对照组相比，Raw264.7细胞经破骨诱导后破骨细胞生成数显著增加；与破骨细胞诱导组相比，葛根素干预组、葛根素+Notch1 siRNA对照组、葛根素+Notch1 siRNA组、葛根素+Notch1过表达对照组破骨细胞生成数明显下降。与葛根素干预组相比，葛根素+Notch1 siRNA对照组、葛根素+Notch1 siRNA组、葛根素+Notch1过表达对照组破骨细胞生成数无明显差异。与葛根素+Notch1 siRNA对照组相比，葛根素+Notch1 siRNA组破骨细胞生成数无明显差异。与葛根素干预组及葛根素+Notch1过表达对照组相比，葛根素+Notch1过表达组破骨细胞生成数明显增加，见图4。

2.4 破骨细胞骨架形成情况肌动蛋白F-actin染色可以反映细胞骨架的形成情况。与空白对照组相比，Raw264.7细胞经破骨诱导后可见边界明显的F-actin环。与破骨细胞诱导组相比，葛根素干预组、葛根素+Notch1 siRNA对照组、葛根素+Notch1 siRNA组、葛根素+Notch1过表达对照组F-actin环数量及大小均有所下降。与葛根素干预组相比，葛根素+Notch1 siRNA对照组、葛根素+Notch1过表达对照组F-actin环数量及大小无明显差异。与葛根素干预组及葛根素+Notch1 siRNA对照组相比，葛根素+Notch1 siRNA组F-actin环数量及大小均有所下降。与葛根素干预组及葛根素+ Notch1过表达对照组相比，葛根素+Notch1过表达组F-actin环数量及大小有所增加，见图5。

2.5 破骨形成相关基因表达 RT-PCR检测结果显示：与空白对照组相比，Raw264.7细胞经破骨诱导后破骨相关基因抗酒石酸酸性磷酸酶、组织蛋白酶K和c-Fos mRNA表达水平显著上升。与破骨细胞诱导组相比，葛根素干预组、葛根素+Notch1 siRNA对照组、葛根素+Notch1 siRNA组、葛根素+Notch1过表达对照组抗酒石酸酸性磷酸酶、组织蛋白酶K和c-Fos mRNA表达水平明显下降。与葛根素干预组相比，葛根素+ Notch1 siRNA对照组、葛根素+Notch1过表达对照组抗酒石酸酸性磷酸酶、组织蛋白酶K和c-Fos mRNA表达水平无明显差异。与葛根素干预组及葛根素+Notch1 siRNA对照组相比，葛根素+Notch1 siRNA组抗酒石酸酸性磷酸酶、组织蛋白酶K和c-Fos mRNA表达水平明显下降。与葛根素干预组及葛根素+Notch1过表达对照组相比，葛根素+Notch1过表达组抗酒石酸酸性磷酸酶、组织蛋白酶K和c-Fos mRNA表达水平明显上升，见图6。

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引言

牙周炎是以牙周结缔组织炎性浸润为主要特点，以牙槽骨吸收为主要临床特征的慢性感染性疾病[1]。当病原菌作用于牙周支持组织时，会刺激牙周膜成纤维细胞表达核因子κB受体激活因子配体(receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand，RANKL)，RANKL与增殖性单核巨噬细胞表面的核因子κB受体活化因子(receptor activator of nuclear factor-kappa B，RANK)结合，促进破骨细胞的形成进而导致牙槽骨过度吸收[2]。牙槽骨吸收是牙周炎中骨骼动态变化的最终结局，破骨细胞和成骨细胞的数量及功能稳定是骨稳态的基础，如果破骨细胞过度活化，骨吸收作用加强，则骨稳态被打破[3]。由此可见，抑制破骨细胞的活化和形成是缓解牙周炎进程的良好手段。
葛根素是一类异黄酮衍生物，分离自临床常用中药葛根，目前已经证实葛根素在抑制炎症、扩张血管、杀伤肿瘤等方面具有良好的效果[4]。近些年越来越多的研究表明葛根素在骨代谢平衡方向具有保护作用。闫波[5]采用葛根素干预聚甲基丙烯酸甲酯颗粒诱导破骨细胞形成的过程，发现葛根素可以抑制破骨细胞的分化成熟。杨一秋等[6]采用葛根素干预绝经后骨质疏松大鼠，发现葛根素可以通过PTEN/PI3K/AKT通路抑制骨质疏松。詹乐等[7]采用葛根素干预牙周炎大鼠，发现葛根素会影响Th17/Treg细胞免疫平衡缓解牙周炎。由此可见，葛根素在骨稳态过程中发挥了重要作用，但具体的影响机制尚需要进一步探究。
Notch信号通路是细胞间信息交换的重要途径，通过Notch受体与配体结合，激活下游通路完成相邻细胞间信息交换。有研究表明，Notch1信号通路激活后诱导RANKL的表达，对破骨细胞的分化成熟产生影响[8-9]。Notch1信号通路激活可以促进骨保护素的表达[10]，从而影响破骨细胞的生成[11]。Notch信号通路在机体维持骨组织稳态过程中发挥作用。课题组前期发现葛根素通过抑制Notch信号通路来抑制RAW264.7细胞的破骨分化能力[12]。为进一步探究Notch1信号通路在破骨细胞分化中的作用，此次研究分别沉默和过表达Notch1，观察Notch1信号通路在破骨细胞分化过程中的作用。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞干预实验。
1.2 时间及地点实验于2022年10月至2023年5月在海南医学院科学实验中心进行。
1.3 材料小鼠单核巨噬细胞Raw264.7(Hibio，中国)；葛根素(纯度99.2%，Mce，美国)；胎牛血清、DMEM高糖培养基、胰蛋白酶、青链霉素(Gibco，美国)；破骨诱导培养基、抗酒石酸酸性磷酸酶染色试剂盒(CTCC，中国)；Trizol(Invitrogen，美国)；SYBP Green PCR试剂盒、反转录试剂盒(Thermo，美国)；Lipo8000转染试剂盒、F-actin染色试剂盒(Beyotime，中国)；Notch1、Hes1蛋白抗体(Abcam，英国)。
1.4 实验方法

1.4.1 Notch1干扰序列和过表达质粒构建及活性筛选针对小鼠Notch1基因序列设计合成3条siRNA及1条无同源性对照序列(碱基序列见表1)。

将Raw264.7细胞以5×105/孔的密度接种于6孔板，待细胞融合至80%时，按照Lipo8000™转染试剂盒操作说明转染，继续培养48 h后收集细胞，RT-PCR检测Notch1基因表达量。查找Notch1 cDNA序列，体外扩增Notch1胞内编码区(NICD)，采用双酶切法将其构建至pcDNA3.1-EGFP载体上。将Raw264.7细胞以5×105/孔的密度接种于6孔板，待细胞融合至80%时，按照Lipo8000™转染试剂盒操作说明转染，继续培养48 h后收集细胞，采用Western blot检测Notch1及下游靶基因Hes1的蛋白表达量。Notch1体外扩增引物序列如下：Notch1(mouse)-F：5’-GGA CCT CAT CAA CTC ACA T-3’，Notch1(mouse)-R：5’-AAC AGC AGC ATC CAC ATT-3’。
1.4.2 Raw264.7细胞培养及诱导分化实验选用Raw264.7细胞为破骨细胞前体细胞，采用DMEM高糖培养基进行培养，调整细胞浓度至1×109 L-1，将细胞接种于48孔板中，每孔100 μL，以破骨诱导培养基(含20 ng/mL巨噬细胞集落刺激因子和50 ng/mL RANKL的DMEM高糖培养基)诱导Raw264.7细胞分化成熟，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱内诱导培养7 d，每隔两三天更换破骨诱导培养基。
1.4.3 葛根素分组及干预将Raw264.7细胞分为空白对照组、破骨细胞诱导组、葛根素干预组、葛根素+Notch1 siRNA对照组、葛根素+Notch1 siRNA组、葛根素+Notch1过表达对照组、葛根素+Notch1过表达组。空白对照组采用含双抗的DMEM高糖完全培养基培养；破骨细胞诱导组采用破骨诱导培养基培养；葛根素干预组在破骨诱导的同时加入50 μmol/L葛根素培养[12]；葛根素+Notch1 siRNA 对照组、葛根素+Notch1 siRNA组、葛根素+Notch1 过表达对照组、葛根素+Notch1 过表达组分别采用Notch1 siRNA对照序列、Notch1 siRNA序列、Notch1过表达对照质粒、Notch1过表达质粒转染Raw264.7细胞后，加入破骨诱导培养基和葛根素进行培养。Raw264.7细胞以1×105/孔的密度接种于48孔细胞培养板，置于CO2恒温培养箱中诱导培养7 d。
1.4.4 抗酒石酸酸性磷酸酶染色按照1.4.3分组诱导培养7 d，弃掉孔板中培养基并用PBS多次漂洗，使用40 g/L多聚甲醛固定细胞15 min，严格按照抗酒石酸酸性磷酸酶试剂盒染色说明进行操作，于显微镜下随机挑取5个视野，统计多核破骨细胞数量。
1.4.5 F-actin染色按照1.4.3分组诱导培养7 d，弃掉孔板中培养基并用PBS多次漂洗，使用40 g/L多聚甲醛固定细胞15 min，0.1%曲拉通X-100破膜20 min，磷酸盐缓冲液反复漂洗后使用F-actin荧光探针孵育1 h，加入Hoechst 33258孵育10 min，于荧光显微镜下随机挑取5个视野，观察细胞骨架形态。

1.4.6 RT-PCR检测抗酒石酸酸性磷酸酶、组织蛋白酶K、c-Fos的基因表达量按照1.4.3分组诱导培养7 d，弃掉孔板中培养基并用PBS多次漂洗，胰酶消化后离心收集细胞沉淀，Trizol法提取总RNA，反转录合成cDNA。在PCR反应管中分别加入ddH2O、SybrGreen qPCR Master Mix、Forward primer、Reverse primer、cDNA配制RT-PCR反应体系。扩增条件为94 ℃ 10 min，(94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s)×40个循环。使用引物见表2。

1.5 主要观察指标 ①RT-PCR和琼脂糖凝胶电泳验证过干扰序列和过表达质粒是否构建成功；②Western blot验证沉默或者激活Notch1信号通路对下游蛋白的影响；③采用抗酒石酸酸性磷酸酶染色观察破骨细胞的数量和大小；④F-actin染色观察破骨细胞骨架形成情况；⑤RT-PCR检测破骨细胞形成标志物的基因表达水平。
1.6 统计学分析采用SPSS 20.0进行统计分析，选择t检验和单因素方差分析方法进行组间比较，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过海南医学院统计学老师审核。

讨论

牙周炎是由于口腔病原微生物感染引起的病理性骨吸收疾病。牙槽骨中具有溶骨能力的破骨细胞过度形成及活化是牙周炎骨流失的主要原因[13]。破骨细胞通过与成骨细胞相互作用维持骨骼代谢平衡，抑制破骨细胞的形成可以促进牙周支持组织再生，是牙周炎治疗的重要方向[14-16]。目前治疗牙周炎的主要方式为牙周基础治疗(即洗牙、刮治和根面平整)配合后期药物辅助，虽然已经可以达到一定的治疗效果，但药物长期应用会导致机体耐受，毒副作用明显[17-19]。葛根素作为一种中药提取物，在抗炎方向的作用已经被广泛报道[20-22]。课题组前期通过葛根素干预大鼠牙周炎模型发现牙周炎病程进展得到有效缓解，通过葛根素干预破骨细胞形成过程发现破骨细胞分化被抑制，且Notch1、Hes1、Jagged1等Noctch1信号通路相关蛋白表达量下降。为进一步验证葛根素是否通过抑制Notch信号通路抑制破骨细胞分化，从而起到治疗牙周炎的作用，此次研究通过沉默和过表达Notch1蛋白表达，探究葛根素调控破骨细胞分化成熟过程中Notch1信号通路的作用。
破骨细胞的增殖分化受到巨噬细胞集落刺激因子和RANKL的影响[23]。巨噬细胞集落刺激因子可以维持破骨细胞的存活并促进其增殖，而RANKL与RANK的结合可以促进破骨细胞分化和功能激活[24-25]。此次实验中选用Raw264.7细胞作为破骨细胞前体细胞，采用课题组已经建立成熟的巨噬细胞集落刺激因子联合RANKL诱导法，成功在体外诱导形成多核破骨细胞。抗酒石酸酸性磷酸酶是第5型酸性磷酸酶，在破骨细胞中广泛分布，而其前体细胞中则几乎不含抗酒石酸酸性磷酸酶，因此常把抗酒石酸酸性磷酸酶作为破骨细胞的特异性标志物，采用抗酒石酸酸性磷酸酶染色鉴定破骨细胞的大小和数量[26-27]，破骨前体细胞经过诱导后抗酒石酸酸性磷酸酶阳性细胞数量明显增加，分化成熟的破骨细胞胞体巨大，多核且细胞核占比较小。有研究表明，随着破骨细胞的分化其胞体变大，形成相应的环状骨架[28]，细胞骨架的变化与细胞的生长、分化及成熟相关，可采用F-actin染色佐证破骨细胞的形成，破骨细胞诱导成熟后会出现边界清晰的环状结构。
Notch1信号通路在细胞生长和凋亡过程中发挥作用，参与维持细胞稳态[29-31]。Notch1受体与配体结合，Notch蛋白成熟后会被转运至细胞膜上，经过膜蛋白酶剪切形成Notch1蛋白胞内段NICD，NICD转运入核后可影响下游基因转录并完成信号传递[32-33]。胡超等[34]研究发现，外源性NICD片段会促进人牙髓干细胞的增殖；龙晏等[35]在牙周膜干细胞的增殖分化中未观察到一致现象，Notch1基因的作用在不同细胞中有所差异。研究表明，RANKL和RANK结合后通过上调Notch1蛋白表达，促进破骨细胞的形成[36-37]。
此次研究分别将Notch1 siRNA序列和外源性NICD胞内片段转染至Raw264.7细胞内，通过检测发现沉默Notch1基因后Notch1及下游靶蛋白Hes1蛋白表达水平明显下降，过表达Notch1基因则会导致Notch1及下游靶蛋白Hes1蛋白表达水平明显上升，表明沉默序列和过表达载体转染成功。抗酒石酸酸性磷酸酶染色结果显示：葛根素干预后，分化受到抑制的破骨细胞数量增加，此类细胞相对成熟，破骨细胞体积变小，胞内结构更加紧致，核体积占比更高，沉默Notch后抗酒石酸酸性磷酸酶阳性细胞数量减少更加明显，分化抑制也更加明显，过表达Notch则可以促进抗酒石酸酸性磷酸酶阳性细胞生成，缓解葛根素干预导致的破骨细胞分化抑制。F-actin染色结果显示：葛根素干预后，细胞骨架环状结构变小，数量变少，沉默Notch后具有成熟结构的破骨细胞进一步减少，过表达Notch则可以促进细胞骨架的生成。上述结果提示葛根素可抑制破骨细胞的分化，沉默Notch1信号通路能增强这种抑制作用，而激活Notch1信号通路则能明显缓解破骨细胞的分化抑制。
破骨细胞的骨吸收作用依赖于细胞膜表面的质子泵分泌的酸性磷酸酶、组织蛋白酶等[38-40]，抑制破骨细胞分泌酶的表达是阻止其发挥功能的重要环节。RT-PCR检测结果显示，破骨前体细胞经过诱导后，抗酒石酸酸性磷酸酶和组织蛋白酶K的基因表达水平升高；葛根素干预后，抗酒石酸酸性磷酸酶和组织蛋白酶K的基因表达水平较破骨细胞诱导组下调，沉默Notch信号通路可以进一步下调其表达水平，而激活Notch信号通路则可以上调其表达水平。RANKL与RANK的结合导致c-Fos激活，是破骨细胞分化的关键因素[41-42]，实验结果显示：RANKL诱导后c-Fos的表达水平上升，葛根素可以抑制c-Fos的表达，沉默Notch信号通路可以进一步下调其表达水平，而激活Notch信号通路则可以上调其表达水平。
综上所述，葛根素可以抑制Raw264.7细胞分化为破骨细胞，沉默Notch1可以增强葛根素的抑制效果，过表达Notch1则会缓解葛根素的抑制作用。Notch1信号通路在Raw264.7细胞分化为破骨细胞的过程中发挥作用，葛根素通过Notch1信号通路抑制Raw264.7细胞分化为破骨细胞。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

葛根素通过Notch1信号通路抑制Raw264.7细胞向破骨细胞的分化

Puerarin inhibits the differentiation of Raw264.7 cells into osteoclasts through the Notch signaling pathway

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