尿石素A介导p38/MAPK通路抑制破骨细胞活性

doi:10.12307/2023.893

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (8): 1149-1154.doi: 10.12307/2023.893

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尿石素A介导p38/MAPK通路抑制破骨细胞活性

黄浩然1，凡一诺2，卫杨文祥1，江梦钰1，方汉军1，王海彬1，陈镇秋1，刘予豪1，周驰1

1广州中医药大学第一附属医院，广东省广州市 510405；2广州中医药大学第三附属医院，广东省广州市 510378

收稿日期:2022-10-13 接受日期:2022-11-25 出版日期:2024-03-18 发布日期:2023-07-18
通讯作者: 周驰，博士，副主任中医师，广州中医药大学第一附属医院，广东省广州市 510405 刘予豪，博士，中医师，广州中医药大学第一附属医院，广东省广州市 510405
作者简介:黄浩然，男，1994年生，广东省阳春市人，汉族，广州中医药大学在读硕士，医师，主要从事中医药防治骨与关节疾病研究。
基金资助:
广东省教育厅项目(2021KTSCX021)，项目负责人：周驰；广东省自然科学基金项目(2021A1515011484)，项目负责人：刘予豪；广东省中医药局项目(20221136)，项目负责人：刘予豪；广东省中医药局项目(20231162)，项目负责人：陈镇秋；广东省中医药局项目(20231122)，项目负责人：方汉军；广州中医药大学“双一流”与高水平大学学科协同创新团队项目(2021xk46)，项目负责人：陈镇秋

Urolithin A mediates p38/MAPK pathway to inhibit osteoclast activity

Huang Haoran1, Fan Yinuo2, Wei-Yang Wenxiang1, Jiang Mengyu1, Fang Hanjun1, Wang Haibin1, Chen Zhenqiu1, Liu Yuhao1, Zhou Chi1

1First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China; 2Third Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510378, Guangdong Province, China

Received:2022-10-13 Accepted:2022-11-25 Online:2024-03-18 Published:2023-07-18
Contact: Zhou Chi, MD, Associate chief physician, First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China Liu Yuhao, MD, Physician, First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China
About author:Huang Haoran, Master candidate, Physician, First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China
Supported by:
Guangdong Provincial Education Department Project, No. 2021KTSCX021 (to ZC); Guangdong Provincial Natural Science Foundation, No. 2021A1515011484 (to LYH); grants from Guangdong Provincial Administration of Traditional Chinese Medicine, Nos. 20221136 (to LYH), 20231162 (to CZQ), and 20231122 (to FHJ); Guangzhou University of Chinese Medicine "Double First-Class" and High-level University Discipline Collaborative Innovation Team Project, No. 2021xk46 (to CZQ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

尿石素A：存在于石榴和其他一些水果和坚果中的一类化合物鞣花酸和鞣花单宁的天然代谢产物，可改善线粒体和肌肉功能，具有抗氧化、抗炎、抗增殖及抗癌作用。
破骨细胞：起源于血系单核-巨噬细胞系统，是一种特殊的终末分化细胞，它可由其单核前体细胞通过多种方式融合形成巨大的多核细胞。破骨细胞是体内唯一具有骨吸收功能的细胞，在骨发育、生长、修复、重建中发挥重要的作用。
MAPK通路：是一类由脯氨酸介导的丝氨酸/苏氨酸活性的蛋白激酶，具有磷酸化高分子量多肽的功能，对细胞的增殖、分化、迁移及自噬和凋亡等过程进行调控。MAPK可通过激活后直接参与破骨前体细胞的分化成熟，也可通过自噬参与破骨细胞的分化。

背景：过度活跃的破骨细胞可破坏骨稳态，并在骨质疏松、脆性骨折、骨关节炎等相关性骨骼疾病的病理机制中起重要作用。研究证实，鞣花酸和鞣花单宁有抑制破骨细胞分化的潜能，尿石素A作为其天然代谢产物，具有抗氧化、抗炎、抗增殖及抗癌作用，但其对破骨细胞分化的影响及其潜在的分子机制尚不清楚。

目的：探讨尿石素A对核因子κB受体活化因子配体诱导破骨细胞分化的影响及作用机制。
方法：体外培养稳定生长的小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7)，使用细胞毒性MTS实验检测不同浓度尿石素A(0，0.1，0.5，1.5，2.5 μmol/L)对RAW264.7细胞的毒性，筛选出安全作用浓度。再使用不同浓度的尿石素A干预核因子κB受体活化因子配体诱导的RAW264.7细胞体外分化过程，进行抗酒石酸酸性磷酸酶染色和肌动蛋白环及细胞核染色，观察尿石素A对破骨细胞形成和功能的影响。最后通过Western Blot及RT-qPCR实验，观察尿石素A干预后丝裂原活化蛋白激酶信号通路中上下游基因和蛋白的表达情况。

结果与结论：①尿石素A呈浓度依赖性地抑制体外破骨细胞分化及肌动蛋白环形成，2.5 μmol/L的抑制作用最强；②尿石素A可抑制与破骨形成及骨吸收相关的Nfatc1、Ctsk、Mmp9、Atp6v0d2基因的表达及Nfatc1、Ctsk蛋白的合成；③尿石素A可通过抑制p38蛋白的磷酸化，抑制丝裂原活化蛋白激酶信号通路传导，从而抑制破骨细胞的活性。

https://orcid.org/0000-0002-6450-2486(黄浩然)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 尿石素A, 破骨细胞, MAPK, p38, RANKL

Abstract: BACKGROUND: Overactive osteoclasts disrupt bone homeostasis and play a bad role in the pathological mechanisms of related skeletal diseases, such as osteoporosis, fragility fractures, and osteoarthritis. Studies have confirmed that ellagic acid and ellagtannin have the potential to inhibit osteoclast differentiation. As their natural metabolites, urolithin A has antioxidant, anti-inflammatory, anti-proliferative and anti-cancer effects, but its effect on osteoclast differentiation and its underlying molecular mechanisms remain unclear.
OBJECTIVE: To explore the effect of urolithin A on osteoclast differentiation induced by receptor activator for nuclear factor-κB ligand and its mechanism.
METHODS: Mouse mononuclear macrophage leukemia cells (RAW264.7) that grew stably were cultured in vitro. Toxicity of urolithin A (0, 0.1, 0.5, 1.5, 2.5 μmol/L) to RAW264.7 cells were detected by cytotoxic MTS assay to screen out the safe concentration. Different concentrations of urolithin A were used again to intervene with receptor activator for nuclear factor-κB ligand-induced differentiation of RAW264.7 cells in vitro. Then, tartrate-resistant acid phosphatase staining and F-actin ring and nucleus staining were performed to observe its effect on the formation and function of osteoclasts. Finally, the expressions of urolithin A on upstream and downstream genes and proteins in the MAPK signaling pathway were observed by western blot and RT-qPCR assays.
RESULTS AND CONCLUSION: Urolithin A inhibited osteoclast differentiation and F-actin ring formation in a concentration-dependent manner and 2.5 μmol/L had the strongest inhibitory effect. Urolithin A inhibited the mRNA expression of Nfatc1, Ctsk, Mmp9 and Atp6v0d2 and the protein synthesis of Nfatc1 and Ctsk, related to osteoclast formation and bone resorption. Urolithin A inhibited the activity of osteoclasts by downregulating the phosphorylation of p38 protein to inhibit the mitogen-activated protein kinase signaling pathway.

Key words: urolithin A, osteoclast, MAPK, p38, RANKL

中图分类号:

黄浩然, 凡一诺, 卫杨文祥, 江梦钰, 方汉军, 王海彬, 陈镇秋, 刘予豪, 周驰. 尿石素A介导p38/MAPK通路抑制破骨细胞活性[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(8): 1149-1154.

Huang Haoran, Fan Yinuo, Wei-Yang Wenxiang, Jiang Mengyu, Fang Hanjun, Wang Haibin, Chen Zhenqiu, Liu Yuhao, Zhou Chi. Urolithin A mediates p38/MAPK pathway to inhibit osteoclast activity[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(8): 1149-1154.

图/表（结果） 5

2.1 尿石素A抑制RANKL诱导的RAW264.7细胞破骨分化为探明尿石素A对破骨细胞分化的影响，在体外使用0.1，0.5，1.5，2.5 μmol/L尿石素A分别干预RANKL诱导的RAW264.7细胞。结果显示，与阳性对照组相比，尿石素A浓度在0.5 μmol/L时，开始对破骨细胞的形成产生抑制作用，且抑制作用呈剂量依赖性，随浓度升高，抑制作用增强，在2.5 μmol/L时抑制作用最强(图1A，B)。细胞毒性MTS实验结果显示，2.5 μmol/L浓度及以下的尿石素A对RAW264.7细胞无毒性作用(图1C)。

2.2 尿石素A抑制RAW264.7破骨分化的表面肌动蛋白环形成使用倒置荧光显微镜观察RANKL诱导的RAW264.7细胞分化为成熟破骨细胞形成的肌动蛋白环，可见正常的破骨细胞成熟后有明显的肌动蛋白环形成。使用1.25，2.5 μmol/L尿石素A干预后，肌动蛋白环的面积明显变小，其中2.5 μmol/L抑制作用更为明显(图2A，B)。

2.3 尿石素A下调RAW264.7破骨分化关键基因的表达对RANKL诱导的破骨分化中起关键作用的基因(Nfatc1、Ctsk、Mmp9、Atp6v0d2)进行RT-qPCR分析，以深入了解尿石素A对破骨细胞生成的抑制作用。以Hprt mRNA的平均表达水平作为对照标准，结果显示，1.25 μmol/尿石素A可显著下调Ctsk、Mmp9的mRNA表达；当尿石素A浓度为2.5 μmol/L时，则抑制作用更为显著，同时显著下调Nfatc1、Atp6v0d2的mRNA表达见图3。

2.4 尿石素A抑制RAW264.7破骨分化相关蛋白表达采用抑制作用最强2.5 μmol/L浓度，研究尿石素A对RAW264.7破骨分化和功能的影响。在第0，1，3，5天不同时间梯度，用尿石素干预RANKL诱导的RAW264.7细胞分化过程。最终，Western Blot定量分析Nfatc1和Ctsk蛋白表达量。结果显示，从第3天开始，尿石素A可明显抑制Nfatc1蛋白的表达(图4A，B)；破骨形成前期(即第5天)，尿石素A明显抑制Ctsk蛋白的表达(图4C)。

2.5 尿石素A抑制RANKL诱导的MAPK信号通路激活采用抑制作用最强2.5 μmol/L浓度，研究尿石素A对RAW264.7破骨分化MAPK通路的影响。在0，5，10，20，30，60 min不同时间梯度，用尿石素干预RANKL诱导RAW264.7的过程。最终，采用Western Blot定量分析p-p38的蛋白表达量。结果显示，p-p38的蛋白表达量呈现出先升高后降低的趋势，并在20 min时到达峰值。与RANKL阳性对照组(0 μmol/L 尿石素 A)相比，尿石素A在10，20，30 min时对p38蛋白的磷酸化有明显的抑制作用(图5A，B)。

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引言

骨骼是一个持续不断重塑的动态器官，为保持骨量，需维持骨吸收与骨形成二者的稳态[1]。骨骼重塑贯穿成人骨骼的整个生命周期，是其最重要的生理功能[2]。骨稳态依赖于破骨细胞介导的骨吸收，以及成骨细胞介导的骨形成之间的和谐活动[3]。破骨细胞作为唯一拥有降解矿化骨功能的细胞，对于骨重塑和骨稳态至关重要[4]。目前研究认为，过度活跃的破骨细胞所介导的骨吸收是骨丢失的病理基础，其特征是皮质骨变薄、骨小梁数量减少和骨矿物质密度整体降低，形成骨质疏松症，从而导致骨微结构的整体恶化和骨折的高风险[5]。破骨前体细胞分泌的破骨细胞相关受体促进软骨细胞凋亡，影响骨关节炎进程[6]。因此，有效抑制过度活跃的破骨细胞的形成和功能，是治疗此类骨骼疾病的重要治疗手段。
破骨细胞起源于造血祖细胞的多核巨噬细胞系统，受巨噬细胞集落刺激因子和核因子κB受体活化因子配体(receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL)的共同调节[7]。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)与破骨细胞活化的调节以及炎症递质的表达有关，其快速磷酸化和激活主要受细胞因子RANKL的调节，并激活转录因子，如活化T细胞核因子c1(nuclear factor of activated T cells c1，Nfatc1)、肿瘤坏死因子受体相关因子6和骨保护素，从而调节破骨细胞分化的基因表达[8]。目前，双膦酸盐类药物被证实可抑制破骨细胞的活性，其疗效显著且被广泛认可[9]。然而，长期使用双膦酸盐类药物会引起下颌骨坏死、非典型转子下或股骨干骨折等不良反应[10]。因此，其安全性逐渐成为人们关注的问题，新的破骨细胞抑制药物的研发显得更加的迫切。
尿石素 A由肠道细菌从石榴、草莓、覆盆子和核桃等膳食产品中的天然多酚鞣花酸和鞣花单宁产生的一种代谢产物[11]，具有抗氧化、抗炎、抗增殖及抗癌的作用[12-13]。多项研究证实，鞣花酸和鞣花单宁有抑制破骨细胞分化的潜能[14-16]，作为其天然代谢产物，尿石素A对破骨细胞分化的影响及其潜在的分子机制尚不清楚。此次研究发现，尿石素 A可抑制由RANKL诱导的破骨分化及其肌动蛋白环的形成；尿石素 A可抑制与破骨细胞形成及骨吸收相关基因Nfatc1、Ctsk、Atp6v0d2、Mmp9的表达及Nfatc1、Ctsk蛋白的合成；另外，在深入的机制研究中发现，尿石素 A可通过减少P38的磷酸化，抑制MAPK信号通路传导，从而抑制破骨细胞的活性。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞实验，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。
1.2 时间及地点实验于2021年8月至2022年8月在广州中医药大学岭南医学研究中心完成。
1.3 材料小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7)(中科院细胞库，中国)；尿石素A(ChemFaces公司，中国)；α-MEM培养基、胎牛血清、磷酸盐缓冲液(1×PBS)(Gibco公司，美国)；重组小鼠TRANCE/RANKL/TNFSF11蛋白(R&D Systems公司，美国)；MTS测定试剂盒(Promega公司，澳大利亚)；罗丹明标记鬼笔环肽(US EVERBRIGHT公司，中国)；抗荧光淬灭封固液(含DAPI)(Beyotime公司，中国)；β-actin抗体、Ctsk抗体、Nfatc1抗体(Abcam公司，美国)；p-p38抗体、p38抗体(美国Santa Cruz Biotechnology公司，美国)；EvoM-MLV反转录试剂盒、SYBR® Green Pro Taq HS预混型qPCR试剂盒(含Rox)(Accurate Biology，中国)；Atp6v0d2、Ctsk、Mmp9、Nfatc1、Hprt基因引物(Sangon Biotech公司，中国)。
1.4 实验方法

1.4.1 细胞培养将复苏后的RAW264.7细胞铺于含体积分数8%胎牛血清α-MEM培养基的100 mm培养皿中，置于37 ℃、体积分数5%CO2培育箱中孵育，约2 h可观察到细胞贴壁。每2 d更换1次培养基，细胞融和度约为80%时进行传代，传至第5代后可进行细胞鉴定及后续实验。稳定生长的RAW264.7细胞在含体积分数8%胎牛血清、25 ng/mL RANKL的培养基中生长约5 d可分化成为破骨细胞。

1.4.2 细胞毒性MTS实验将稳定生长的RAW264.7细胞以每孔5×103的密度铺于96孔板中，置于37 ℃、体积分数5%CO2培育箱中孵育过夜。实验组每孔分别加入0.1，0.5，1.5，2.5 μmol/L的尿石素A[17-19]，对照组加入等体积的PBS，使用含体积分数8%胎牛血清的α-MEM培养基培育48 h，然后每孔加入20 μL的MTS试剂，在37 ℃中孵育2 h，最后使用全波长酶标仪检测490 nm波长吸光度，以检测MTS吸光度。
1.4.3 抗酒石酸酸性磷酸酶染色将稳定生长的RAW264.7细胞以每孔5×103的密度铺于96孔板中孵育过夜。药物组和阳性对照组每孔加入25 ng/mL RANKL诱导破骨分化；药物组分别加入0.1，0.5，1.5，2.5 μmol/L的尿石素A，阴性对照和阳性对照组加入等体积的PBS，使用含体积分数8%胎牛血清的α-MEM培养基培育。每2 d更换一次上述培养液，至第5天左右，阳性对照组破骨细胞分化成熟。各组细胞使用40 g/L多聚甲醛固定20 min，在每孔加入50 μL的抗酒石酸酸性磷酸酶染液在37 ℃中孵育45 min后，使用倒置荧光显微镜进行拍摄，最后使用Image J软件统计各组破骨细胞(细胞核≥3个)的数量。
1.4.4 肌动蛋白环及细胞核染色将稳定生长的RAW264.7细胞以每孔1×104的密度铺于48孔板中孵育过夜。药物组和阳性对照组每孔加入25 ng/mL RANKL诱导破骨分化；药物分别加入1.25，2.5 μmol/L的尿石素A[17-19]，阴性对照和阳性对照组加入等体积的PBS，使用含体积分数8%胎牛血清的α-MEM培养基培育。每2 d更换一次上述培养液，至第5天左右，阳性对照组破骨细胞分化成熟。各组细胞使用40 g/L多聚甲醛固定20 min，使用0.1%TritonX-100透膜10 min、3%BSA室温封闭15 min。随后使用罗丹明标记鬼笔环肽对肌动蛋白环在室温下避光染色1 h，PBS清洗3次。清洗干净后，使用抗荧光淬灭封固液(含DAPI)对细胞核染色10 min。使用倒置荧光显微镜对肌动蛋白环进行观察及拍摄。最后使用Image J软件统计肌动蛋白环大小及数量。

1.4.5 RT-qPCR实验将稳定生长的RAW264.7细胞以每孔5×104的密度铺于6孔板中，药物组和对照组每孔加入25 ng/mL RANKL诱导破骨分化；药物分别加入1.25，2.5 μmol/L的尿石素A，对照组加入等体积的PBS，使用含体积分数8%胎牛血清的α-MEM培养基培育。每2 d更换一次上述培养液，至第5天左右，阳性对照组破骨细胞分化成熟。经Trizol法提取总RNA后，使用EvoM-MLV反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，随后采用SYBR® Green Pro Taq HS预混型qPCR试剂盒，使用Applied Biosystems Quant Studio实时荧光定量PCR仪检测目标基因表达量，并采用∆∆Ct法进行定量分析。目的基因引物序列见表1。

1.4.6 Western Blot实验
(1)长时间梯度Western Blot实验：将稳定生长的RAW264.7细胞以每孔5×104的密度铺于6孔板中，细胞贴壁后，药物组和对照组分别在第0，1，3，5天每孔加入25 ng/mL的RANKL诱导细胞向破骨细胞分化，同时药物组和对照组分别加入2.5 μmol/L的尿石素A以及相应体积的PBS。每2 d更换一次上述培养液，培养至第5天破骨细胞分化成熟，使用RIPA裂解液在冰上裂解细胞，提取蛋白。使用SDS-PAGE凝胶进行电泳分离蛋白，然后转印至PVDF膜上，5%BSA封闭1 h后，在4 ℃摇床过夜孵育Ctsk、Nfatc1、β-actin(稀释比例1∶1 000)，随后用相应的二抗(稀释比例1∶4 000)孵育2 h。完成孵育后，使用Immobilon显影液及Bio-Rad全能型凝胶成像系统SOP进行显影。最后使用lmage J软件对目标条带进行定量分析。
(2)短时间梯度Western Blot实验：将稳定生长的RAW264.7细胞以每孔2×105的密度铺于6孔板中，使用含体积分数8%胎牛血清的α-MEM培养基培养至90%融和度。更换无胎牛血清培养基饥饿细胞2 h，随后药物组加入2.5 μmol/L的尿石素A，对照组加入相应体积的PBS。2 h后，分别在0，5，10，20，30，60 min向药物组和对应的对照组加入25 ng/mL的RANKL。后续蛋白提取、分离、封闭、转膜及显影步骤“长时间梯度Western Blot实验”，目标蛋白改为p-p38和p38(稀释比例1∶1 000)。
1.5 主要观察指标 ①尿石素A作用于RAW264.7细胞的安全浓度范围；②不同浓度尿石素A抑制破骨分化情况；③观察尿石素A作用下的破骨细胞形态、抗酒石酸酸性磷酸酶染色情况；④尿石素A抑制破骨细胞分化及功能相关基因和蛋白的表达情况；⑤尿石素A抑制破骨细胞MAPK信号通道的蛋白表达差异。
1.6 统计学分析使用SPSS Staistics 23 统计分析软件进行统计学分析。计量数据均采用x±s表示，两组间的比较采用t检验，多组间的比较采用方差分析。方差分析所使用的事后校验方式为LSD检验。使用Graphpad prism 8.0软件进行统计及绘图。P < 0.05被定义为差异有显著性意义。文章统计学方法已经广州中医药大学生物统计学专家审核。

讨论

骨骼具有自愈和再生能力，合成骨基质的成骨细胞和吸收骨基质的破骨细胞在骨稳态中起重要作用。骨重塑被定义为激活、吸收、逆转及骨形成4个连续阶段，破骨细胞在前两阶段发挥主导作用。目前研究认为，人类骨量在35岁左右达到峰值后逐年下降[20-21]，骨骼老化的特征是骨吸收过多，新骨形成不能平衡，表现为骨质疏松症，并易导致脆性骨折。另外，年龄的增长也意味着骨关节炎风险的升高[22-23]，骨吸收增强导致骨量减少和软骨下骨微结构的破坏，增加了关节软骨退化的风险，并随着软骨下骨力学和生化微环境的变化发生骨硬化，加剧软骨退变[24]。因此，抑制由破骨细胞主导的骨吸收成为防治骨质疏松症、脆性骨折及骨关节炎等骨骼疾病的重要手段。
植物提取物是药物开发的重要来源[25]。尿石素A作为酚鞣花酸和鞣花单宁的一种天然代谢产物，能显著调节Nrf2以增加抗氧化酶(超氧化物歧化酶和过氧化氢酶)并减少聚肌苷酸-聚胞苷酸[poly(I:C)]刺激的巨噬细胞的炎症反应[26]。
尿石素A可抑制脂多糖引发的核因子κB、转录激活因子1活化以及Akt、JNK磷酸化，从而导致促炎递质产生减少[27]。
尿石素A通过使细胞周期在G2/M期停滞、cyclin-B1、
cyclin-E2、p21、CDC25B和p-cdc2表达的上调以及Myt1的下调，抑制了子宫内膜癌细胞的增殖[28]。尿石素A降低了人类子宫内膜癌Ishikawa细胞的Rac1活性、PAK1磷酸化、肌动蛋白聚合和迁移，导致肿瘤细胞中机械细胞特性的动态变化[29]。可见尿石素A的抗氧化、抗炎、抗增殖及抗癌作用已得以证实，但其对破骨细胞分化的影响及其潜在的分子机制尚不清楚。此次研究通过体外细胞实验验证了尿石素A对破骨细胞的抑制作用及机制。
小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7是一种单核细胞(巨噬细胞)系，在RANKL的诱导下可分化成破骨细胞样细胞[30]。抗酒石酸酸性磷酸酶作为破骨细胞成熟的标记物，被定义为检测破骨细胞生成的标准方法[31]。成熟的破骨细胞极化需经形态变化，形成密集的带状肌动蛋白结构[32]。此次研究使用梯度浓度的尿石素A干预破骨分化，通过使用抗酒石酸酸性磷酸酶染色和肌动蛋白环染色观察破骨细胞数目和形态，发现尿石素A呈剂量依赖性抑制RAW264.7的破骨分化。
现有研究认为，RANK/RANKL信号通路是破骨细胞形成和吸收的关键调控途径[33]。Nfatc1是RANKL诱导后反应最强烈的转录因子，可调节多种破骨细胞特异性基因，如Ctsk、Atp6v0d2和Mmp9等[34-35]。Ctsk是Nfatc1下游基因的关键成员，在骨吸收中起关键作用[36]。在成熟破骨细胞中，
Atp6v0d2作为V-ATP酶的成分，在破骨细胞中具有双重调节功能，既可调节破骨细胞成熟，也可以调节细胞外酸化[37]。在严苛的表观遗传调控下，Mmp9通过裂解H3的N末端尾部，在破骨细胞基因的主动转录中发挥着至关重要的作用[38]。
此次研究通过Western Blot和RT-qPCR实验证实，尿石素A可显著下调RAW264.7细胞Nfatc1、Ctsk、Mmp9、
Atp6v0d2的mRNA表达，同时抑制Nfatc1和Ctsk蛋白的合成。并在进一步研究中发现，尿石素A可以下调MAPK通路p38蛋白的磷酸化，即通过抑制破骨细胞中MAPK p38蛋白的磷酸化，从而抑制破骨细胞形成和成熟[39]。
先前WEI等[40]研究发现，尿石素A可通过p38/MAPK通路和Nrf2通路减轻炎症，从而抑制RANKL诱导的破骨形成。此次研究同样支持尿石素A可通过介导p38/MAPK通路抑制破骨细胞活性。另外，使用MTS实验检测了尿石素A干预RAW264.7细胞的安全浓度，并使用抗酒石酸酸性磷酸酶染色和肌动蛋白环及细胞核染色进一步鉴定了尿石素A抑制RAW264.7细胞破骨分化作用。同时，补充了尿石素A作用于RAW264.7细胞后的Nfatc1、Ctsk、Mmp9、Atp6v0d2基因表达水平变化以及短时间梯段p38蛋白磷酸化水平的变化。
综上所述，尿石素A可通过抑制MAPK信号通路的p38蛋白磷酸化抑制破骨细胞分化。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

尿石素A介导p38/MAPK通路抑制破骨细胞活性

Urolithin A mediates p38/MAPK pathway to inhibit osteoclast activity

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