葛根素对RAW264.7细胞破骨分化的影响

doi:10.12307/2023.829

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (32): 5114-5119.doi: 10.12307/2023.829

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葛根素对RAW264.7细胞破骨分化的影响

刘春丽，闫雨娟，莫礼文，吴志杰，张黎

海南医学院口腔医学院，海南省海口市 571101

收稿日期:2022-10-25 接受日期:2022-12-28 出版日期:2023-11-18 发布日期:2023-03-23
通讯作者: 张黎，副教授，海南医学院口腔医学院，海南省海口市 571101
作者简介:刘春丽，女，1989年生，海南省海口市人，汉族，主治医师，主要从事牙周病学研究。
基金资助:
海南省财政科技计划资助项目—海南省2020年重点研发计划社会发展专项(ZDYF2020166)，项目负责人：张黎

Effects of puerarin on osteoclast differentiation of RAW264.7 cells

Liu Chunli, Yan Yujuan, Mo Liwen, Wu Zhijie, Zhang Li

School of Stomatology, Hainan Medical University, Haikou 571101, Hainan province, China

Received:2022-10-25 Accepted:2022-12-28 Online:2023-11-18 Published:2023-03-23
Contact: Zhang Li, Associate professor, School of Stomatology, Hainan Medical University, Haikou 571101, Hainan province, China
About author:Liu Chunli, Attending physician, School of Stomatology, Hainan Medical University, Haikou 571101, Hainan province, China
Supported by:
Hainan Provincial Finance Fund for Science and Technology Program - 2020 Hainan Province Key R&D Program for Social Development, No. ZDYF2020166 (to ZL)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
破骨细胞分化：多核破骨细胞由单核巨噬细胞融合产生，与成骨细胞相互作用，维持体内骨骼稳态。采用核因子κB受体激动剂配体RANKL和巨噬细胞集落刺激因子联合培养巨噬细胞可以于体外诱导破骨细胞的形成。
葛根素：是临床常用中药葛根的主要活性成分，作为一种异黄酮衍生物，已被证明具有抗炎、抗氧化、扩张血管、抗肿瘤等作用。近年来，葛根素在防治骨质流失、促进骨组织修复方面的作用也逐渐被发现。

背景：葛根素是葛根中含有的一种黄酮类衍生物，其可以预防骨质疏松、促进新骨生成，有望成为治疗骨质破坏相关疾病的潜在药物。
目的：观察葛根素对RAW264.7细胞破骨分化能力的影响，探究Notch信号通路在其中的调控作用。
方法：将RAW264.7细胞分5组干预培养：对照组加入DMEM高糖培养基；破骨诱导组加入破骨诱导培养基(含巨噬细胞集落刺激因子与核因子κB受体活化因子配体的DMEM高糖培养基)；低、中、高浓度葛根素组分别加入含10，25，50 µmol/L葛根素的骨诱导培养基。培养7 d后，采用抗酒石酸酸性磷酸酶染色及F-actin染色评估破骨细胞形成情况，RT-PCR检测破骨细胞形成相关基因的表达，Western blot及RT-PCR检测Notch信号通路相关指标表达。
结果与结论：①抗酒石酸酸性磷酸酶染色显示，与对照组比较，破骨诱导组破骨细胞形成能力升高(P < 0.01)；与破骨诱导组比较，低、中、高剂量葛根素组破骨细胞形成能力降低(P < 0.05，P < 0.01)，且呈浓度依赖性；②F-actin染色显示，与对照组比较，破骨诱导组出现边界清晰的F-actin环；与破骨诱导组比较，各浓度葛根素组细胞F-actin环变小，且呈浓度依赖性；③RT-PCR检测显示，与对照组比较，破骨诱导组抗酒石酸酸性磷酸酶、组织蛋白酶K、C-fos mRNA表达升高(P < 0.01)；与破骨诱导组比较，各浓度葛根素组酒石酸酸性磷酸酶、组织蛋白酶K、C-fos mRNA表达降低(P < 0.01)，且呈浓度依赖性；④Western blot及RT-PCR检测显示，与对照组比较，破骨诱导组Notch1、Notch2、Hes1、Jagged1、Jagged2的表达升高(P < 0.01)；与破骨诱导组比较，各浓度葛根素组Notch1、Notch2、Hes1、Jagged1、Jagged2的表达降低(P < 0.01)，且呈浓度依赖性；⑤结果表明，葛根素通过抑制Notch信号通路来抑制RAW264.7细胞的破骨分化能力。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 葛根素, RAW264.7细胞, 破骨细胞, 诱导分化, 骨稳态, Notch信号通路

Abstract: BACKGROUND: Puerarin is a flavonoid derivative from Pueraria lobata. Studies have found that puerarin can prevent osteoporosis and promote new bone formation, which is expected to become a potential drug for treating diseases related to bone destruction.
OBJECTIVE: To observe the effect of puerarin on osteoclast differentiation of RAW264.7 cells and to explore the regulatory effect of Notch signaling pathway.
METHODS: RAW264.7 cells were divided into five groups: control group treated with Dulbecco’s modified Eagle medium high sugar medium; osteoclast induction group treated with osteoclast induction medium (Dulbecco’s modified Eagle medium high sugar medium containing macrophage colony-stimulating factor and receptor activator of nuclear factor-κB ligand); low-, medium- and high-concentration puerarin groups treated with osteoclast induction medium containing 10, 25 and 50 µmol/L puerarin respectively. After 7 days of culture, tartrate-resistant acid phosphatase staining and F-actin staining were used to observe the role of puerarin in osteoclast formation. RT-PCR was used to detect the expression of genes related to osteoclast formation. Western blot and RT-PCR were used to detect the expression of Notch signaling pathway-related indicators.
RESULTS AND CONCLUSION: Tartrate-resistant acid phosphatase staining results indicated that osteoclast formation ability was enhanced in the osteoclast induction group compared with the control group (P < 0.01), while compared with the osteoclast induction group, low-, middle-, and high-concentration puerarin intervention inhibited osteoclast formation in a concentration-dependent manner (P < 0.05, P < 0.01). F-actin staining results revealed that clear ring structure could be observed in the osteoclast induction group; compared with the osteoclast induction group, puerarin intervention could inhibit the formation of F-actin ring in a concentration-dependent manner. RT-PCR results showed that compared with the control group, the expression of tartrate-resistant acid phosphatase, cathepsin K and C-fos mRNA was increased in the osteoclast induction group (P < 0.01); compared with the osteoclast induction group, puerarin intervention decrease the expression of tartrate-resistant acid phosphatase, cathepsin K and C-fos mRNA in a concentration-dependent manner (P < 0.01). Western blot and RT-PCR results showed that the expression of Notch1, Notch2, Hes1, Jagged1 and Jagged2 was increased in the osteoclast induction group compared with the control group (P < 0.01); compared with the osteoclast induction group, puerarin intervention reduced the expression of Notch1, Notch2, Hes1, Jagged1, and Jagged2 in a concentration-dependent manner (P < 0.01). To conclude, puerarin inhibits the osteoclast differentiation ability of RAW264.7 cells by inhibiting the Notch signaling pathway.

Key words: puerarin, RAW264.7 cell, osteoclast, induced differentiation, bone homeostasis, Notch signaling pathway

中图分类号:

刘春丽, 闫雨娟, 莫礼文, 吴志杰, 张黎. 葛根素对RAW264.7细胞破骨分化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(32): 5114-5119.

Liu Chunli, Yan Yujuan, Mo Liwen, Wu Zhijie, Zhang Li. Effects of puerarin on osteoclast differentiation of RAW264.7 cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(32): 5114-5119.

图/表（结果） 8

2.1 葛根素安全浓度筛选显微镜下观察葛根素对RAW264.7细胞增殖活性的影响，活性较好的RAW264.7细胞呈现圆形或椭圆形，形态饱满，细胞融合度高，细胞活性变差后，形态变为梭形，继而出现细胞皱缩和碎片化，采用不同浓度葛根素干预后，RAW264.7细胞形态如图1所示。

CCK8检测结果显示，1，10，50 μmol/L葛根素干预对RAW264.7 细胞的活性无显著影响，而采用100，200，500 μmol/L葛根素干预后，细胞活性降低为(91.67±0.28)%，(62.58±0.39)%，(33.85±0.35)%，与对照组细胞活性比较差异有显著性意义(P < 0.01)，见图2。可见，50 μmol/L及以下浓度葛根素干预对细胞活性无影响，后续实验剂量组设置50 μmol/L为最高给药浓度。

2.2 葛根素抑制破骨细胞形成抗酒石酸酸性磷酸酶染色结果可见，相比于对照组，破骨诱导组破骨生成能力升高(P < 0.01)；相比于破骨诱导组，10，25，50 μmol/L浓度的葛根素均显著抑制破骨生成(P < 0.05，P < 0.01)，且呈浓度依赖性，见图3，4。

2.3 葛根素抑制破骨细胞骨架形成 F-actin环反映破骨细胞的骨架。F-actin染色实验结果显示，相比于对照组，破骨诱导组出现边界清晰的F-actin环；相比于破骨诱导组，各浓度葛根素处理后细胞F-actin环变小，且呈浓度依赖性，见图5。

2.4 葛根素抑制破骨分化相关基因表达破骨细胞形成相关基因的表达代表了RAW264.7细胞向破骨细胞分化的能力，采用RT-PCR检测抗酒石酸酸性磷酸酶、组织蛋白酶K及C-fos等基因的表达情况，结果显示：相比于对照组，破骨诱导组抗酒石酸酸性磷酸酶、组织蛋白酶K、C-fos mRNA表达显著增加(P < 0.01)；相比于破骨诱导组，各浓度葛根素组抗酒石酸酸性磷酸酶、组织蛋白酶K、C-fos mRNA表达显著降低(P < 0.01)，且呈浓度依赖性，见图6。

2.5 葛根素通过抑制Notch信号通路抑制破骨细胞形成 Notch信号通路的过度活跃可以促进RANKL入核，进而促进RAW264.7细胞向破骨细胞分化。实验分别采用Western blot和RT-PCR法检测葛根素干预后RAW264.7细胞破骨诱导分化后Notch信号通路蛋白及基因的表达情况。
Western blot检测结果显示，破骨诱导可以激活Notch信号通路，与对照组相比，破骨诱导组Notch1、Notch2、Hes1、Jaggde1、Jaggde2蛋白表达量均显著上调(P < 0.01)；与破骨诱导组相比，各浓度葛根素组Notch1、Notch2、Hes1、Jaggde1、Jaggde2蛋白表达量显著降低(P < 0.01)，且呈浓度依赖性，见图7。RT-PCR检测结果趋势与Western blot检测结果一致，均显示破骨诱导可以上调Notch信号通路相关蛋白表达，葛根素可以抑制Notch信号通路，见图8。

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引言

破骨细胞是一类具有溶骨能力的细胞，是骨骼重建的重要工具[1]。人体骨骼通过骨重建过程完成骨代谢更新，具有骨吸收能力的破骨细胞与具有骨形成能力的成骨细胞的数量和功能稳态，是骨代谢平衡的基础，如果骨稳态被打破会导致骨质异常，进而引发一系列疾病[2-3]。研究表明，破骨细胞的过度增殖活化会伴随骨吸收作用的增强，导致或加剧一系列以骨质破坏为表征的疾病，例如骨质疏松症[4-5]、骨关节炎[6-7]、牙周炎等[8]。因此，抑制破骨细胞的形成可以作为改善骨质破坏的一种重要手段。
Notch信号通路可以调控细胞分化和功能激活[9]。Notch受体是一类单通道Ⅰ型跨膜蛋白，当前已经发现4种Notch受体和5种Notch配体[10]。当Notch受体和配体相互结合时会激活信号通路，从而完成相邻细胞间的信息交换[11]。在骨重建过程中，Notch信号通路激活可以诱导核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)表达，从而促进破骨细胞的分化[12]，下调HES1表达水平可以减弱破骨细胞的分化能力[13]。有学者通过构建Notch1条件性基因敲除鼠证实，Notch1基因缺失会减弱骨组织破骨细胞生成，而在成骨细胞谱系中，Notch1的信号激活抑制成骨细胞分化并增加骨保护素水平，导致破骨细胞生成的显著抑制[14]。可见，Notch信号通路是骨骼稳态调控的一种重要途径。
葛根素是临床常用中药葛根的主要活性成分，作为一种异黄酮衍生物，其已被证明具有抗炎、抗氧化、扩血管、抗肿瘤等作用[15]。近年来，随着研究的深入，葛根素在促进成骨细胞生成、抑制破骨细胞分化、维持骨代谢平衡方面的作用也逐渐被发现。有研究报道，溶解在胶原基质中的葛根素可以增加骨缺损位置的新骨生成，而葛根素灌胃可以延缓小鼠去卵巢导致的骨量损失，提示葛根素在破骨吸收和新骨形成过程中发挥了作用[16-17]。周帅等[18]采用葛根素治疗肺动脉高压小鼠时发现，给予葛根素干预可显著降低Notch信号通路蛋白的表达水平，提示葛根素在治疗肺动脉高压过程中抑制了Notch信号通路的激活。此次实验通过RANKL+巨噬细胞集落刺激因子诱导法对RAW264.7细胞进行破骨诱导，观察葛根素对RAW264.7细胞破骨分化能力的影响，探究其潜在的作用机制，为葛根素的临床应用寻找新的理论证明。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞干预实验，通过葛根素体外干预RANKL+巨噬细胞集落刺激因子诱导培养的RAW264.7细胞，验证葛根素对RAW264.7细胞破骨分化能力的影响及Notch信号通路在其中发挥的作用。组间比较进行t检验及单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2022年1-9月在海南医学院科学实验中心进行。
1.3 材料小鼠单核巨噬细胞RAW264.7(Hibio，中国)；葛根素(纯度99.2%，Mce，美国)；DMEM培养基、胎牛血清、0.25%胰酶(Gibco，美国)；破骨细胞诱导培养基、TRAP染色试剂盒(CTCC，中国)；SYBP Green PCR试剂盒(Thermo，美国)；CCK8检测试剂盒、F-actin荧光探针、Hoechst33258荧光探针(Beyotime，中国)；Notch1、Notch2、Hes1、Jagged1、Jagged2蛋白抗体(abcam，英国)；Lipofectamine™ 3000(invitrogen，美国)；显微镜(OLYMPUS，IX71)。
1.4 实验方法
1.4.1 CCK8法筛选葛根素的安全干预浓度复苏RAW264.7细胞，加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，观察细胞融合度至90%以上时收集细胞，调整细胞浓度为1×107 L-1，将细胞以100 μL/孔接种于96孔板中，继续培养24 h。弃去原培养基，按照0，1，10，50，100，200，500 μmol/L浓度梯度加入含葛根素药液培养基100 μL，以0 μmol/L组为对照，培养24 h
后进行CCK8检测。每孔加入20 μL CCK8试剂，避光孵育3 h后，使用酶标仪于450 nm波长下检测各组细胞吸光度值，筛选出对RAW264.7细胞活性不产生影响的最高葛根素浓度。细胞存活率(%)=含药干预组(A450 nm-A650 nm)/对照组(A450 nm-A650 nm)×100%，对照组细胞存活率记为100%。
1.4.2 RAW264.7细胞破骨诱导及葛根素干预将RAW264.7细胞以1×105/well的密度接种于48孔细胞培养板中，设置对照组、破骨诱导组及低、中、高浓度及葛根素组。对照组加入DMEM高糖培养基250 μL，破骨诱导组加入破骨诱导培养基(含巨噬细胞集落刺激因子20 ng/mL和RANKL 50 ng/mL的DMEM高糖培养基)250 μL，葛根素干预组加入含不同浓度葛根素的破骨诱导培养基250 μL。将细胞置于CO2培养箱中，连续培养7 d，每隔两三天更换对应培养基。
1.4.3 抗酒石酸酸性磷酸酶染色观察破骨细胞形成按1.4.2分组培养细胞7 d，弃去原培养基，加入40 g/L多聚甲醛于室温下固定15-20 min，使用PBS漂洗两三次，加入抗酒石酸酸性磷酸酶染色工作液室温染色，10 min后弃去染色液，PBS漂洗干净，于显微镜下观察，随机选取5个视野拍照，统计阳性多核细胞数量。
1.4.4 F-actin染色观察破骨细胞骨架形成按1.4.2分组培养细胞7 d，弃去原培养基，加入40 g/L多聚甲醛于室温下固定15-20 min，使用PBS漂洗两三次，加入0.1% TritonX-100破膜20 min，PBS漂洗两三次，加入F-actin探针37 ℃孵育1 h，加入Hoechst 33258室温孵育10 min，PBS漂洗后观察。

1.4.5 RT-PCR检测破骨形成及Notch信号通路相关基因表达按1.4.2分组培养细胞7 d，弃取原培养基，收集细胞于1.5 mL离心管中，提取细胞总RNA，采用cDNA合成试剂盒合成cDNA，配制RT-PCR反应体系，扩增条件：94 ℃ 10 min；94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40个循环。以GAPDH为内参，检测破骨细胞形成相关基因抗酒石酸酸性磷酸酶、组织蛋白酶K、C-fos及Notch信号通路相关基因Notch1、Notch2、Hes1、Jaggde1、Jaggde2的表达。引物序列见表1。

1.4.6 Western blot检测Notch信号通路相关蛋白表达按1.4.2分组培养细胞7 d，弃去原培养基，收集细胞，加入预冷的已加PMSF的RIPA裂解液，裂解30 min后12 000×g离心10 min，取上清进行BCA蛋白定量，调整蛋白浓度制备上样用蛋白样本；加样进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(参数：浓缩胶恒定电压 80 V，30 min；分离胶恒定电压 120 V，60 min)，采用湿法转膜，封闭2 h；加入一抗Notch1(稀释比例1∶1 000)、Notch2(稀释比例1∶1 000)、Hes1(稀释比例1∶500)、Jaggde1(稀释比例1∶1 000)、Jaggde2(稀释比例1∶500)过夜，一抗孵育完成后，TBST缓冲液缓慢洗涤PDVF膜3次，每次10 min；将PVDF膜放入以1∶5 000稀释的HRP标记的兔二抗或者鼠二抗溶液中，37 ℃缓慢振荡孵育1 h；TBST缓冲液缓慢洗涤PDVF膜3次，每次5 min；在膜上加入适量的ECL发光液，利用一体式化学发光仪拍摄照片，内参选择GAPDH。
1.5 主要观察指标 ①CCK8法检测葛根素干预RAW264.7细胞的安全浓度范围；②抗酒石酸酸性磷酸酶染色观察葛根素对破骨细胞形成能力的影响；③F-actin染色观察葛根素对破骨细胞骨架形成能力的影响；④RT-PCR检测破骨分化基因抗酒石酸酸性磷酸酶、组织蛋白酶K、C-fos及Notch信号通路相关基因Notch1、Notch2、Hes1、Jaggde1、Jaggde2的表达；⑤Western blot检测Notch信号通路相关蛋白Notch1、Notch2、Hes1、Jaggde1、Jaggde2的表达。
1.6 统计学分析所有实验数据均采用SPSS 20.0软件进行t检验及单因素方差分析，若P < 0.05则认为差异有显著性意义，实验数据用x±s表示。该文统计学方法已经海南医学院统计学教研室专家审核。

讨论

破骨细胞作为体内具有骨吸收功能的细胞，与成骨细胞共同作用维持骨重建过程中的骨代谢稳态，破骨细胞的数量和活性异常与众多以骨量损失和骨质结果破坏为特征的疾病相关[19-20]。在牙周炎、骨质疏松症及骨关节炎等疾病中均发现了破骨细胞的异常活跃[21-22]，而抑制破骨细胞的过度活化是治疗骨代谢异常相关疾病的重要手段。葛根素是临床常用中药葛根的主要活性成分，在抗炎、抗肿瘤、治疗心血管疾病等方面都有广泛使用。近期有研究报道，葛根素在治疗大鼠骨质疏松、预防牙周炎、减轻骨关节炎等方面具有一定作用，但其具体的作用机制尚不清楚[23-24]。前期研究已经发现，Notch信号通路的激活会促进破骨细胞的分化形成[25]，此次实验旨在评估葛根素对破骨细胞分化能力的影响，探究Notch信号通路在其中发挥的重要作用，结果表明葛根素干预过程中Notch信号通路被抑制，破骨细胞分化能力减弱。
RAW264.7细胞是目前公认的破骨细胞前体细胞，具有与破骨细胞相似的基因谱[26-27]。巨噬细胞集落刺激因子和RANKL是破骨细胞分化和存活不可或缺的细胞因子[13，28]。巨噬细胞集落刺激因子和RANKL由成骨细胞和骨细胞分泌，在培养基中加入RANKL可以诱导巨噬细胞破骨分化，而巨噬细胞集落刺激因子是破骨细胞存活的必要因子。此次实验通过RANKL+巨噬细胞集落刺激因子诱导体系体外诱导RAW264.7细胞分化为破骨细胞，可见明显的多核破骨细胞形成。
目前关于葛根素的干预巨噬细胞的浓度报道存在较大差异[28-30]，为了证实葛根素在破骨诱导中的发挥的作用，实验首先采用CCK8法筛选出葛根素干预RAW264.7细胞的安全浓度范围为0-50 μmol/L，在安全浓度范围内选择10，25，50 μmol/L浓度葛根素干预破骨诱导中的RAW264.7细胞。抗酒石酸酸性磷酸酶是破骨细胞的特异性标志物[31]，是鉴定破骨细胞形成的经典方法。抗酒石酸酸性磷酸酶染色结果显示，葛根素干预后，抗酒石酸酸性磷酸酶阳性细胞的数量显著减少，随着干预浓度的升高，出现了众多分化受到抑制的破骨细胞，该类细胞的体积小，胞内结构紧密，多伪足。肌动蛋白是细胞骨架的主要成分，随着破骨细胞的分化形成，其胞体变得巨大，同时也会产生相应的肌动蛋白环状结构[32]。F-actin染色结果显示，葛根素处理后的破骨细胞环状结构变小、数量变少，证明会葛根素抑制破骨细胞的骨架形成。以上结果提示，葛根素有减弱RAW264.7分化为破骨细胞的能力，这对临床治疗骨质破坏及骨量损失相关疾病有重要意义。
成熟的破骨细胞膜上存在具有泌酸能力的空泡质子泵，可以分泌酸性磷酸酶、组织蛋白酶(组织蛋白酶K)等活性成分，进而通过一系列酶的作用发挥溶骨能力[33-34]。抗酒石酸酸性磷酸酶染色显示，高浓度葛根素干预RAW264.7细胞后产生了大量未成熟的破骨细胞，由此猜想葛根素对破骨细胞的成熟过程产生了影响。此次实验通过RT-PCR检测了破骨细胞标志性活性酶抗酒石酸酸性磷酸酶和组织蛋白酶K的基因表达水平，结果显示，RAW264.7细胞经过RANKL诱导后，抗酒石酸酸性磷酸酶和组织蛋白酶K的mRNA表达水平较对照组显著升高，而经过葛根素干预后的同步诱导RAW264.7细胞的抗酒石酸酸性磷酸酶和组织蛋白酶K基因表达水平较破骨诱导诱导组降低，在安全浓度范围内存在剂量依赖效应。该实验结果说明，葛根素对破骨细胞的成熟和活性产生了影响。实验进一步研究了与破骨细胞分化成熟相关的原癌基因(C-fos)的表达水平，RANKL在诱导破骨细胞前体细胞分化为破骨细胞的过程中会与RANK结合，导致转录因子C-fos表达激活，进而促进破骨细胞的分化和成熟[35]。PCR检测结果显示，葛根素可以抑制C-fos的表达，进而抑制破骨细胞的分化成熟。
Notch信号通路是细胞增殖、分化及凋亡调节的重要通路[36]。在破骨诱导过程中，RANKL等诱导因子可以上调Notch1蛋白表达，通过激活Notch信号通路促进破骨细胞的形成[37-38]。有学者通过体外激活Notch信号通路发现，Notch1蛋白参与了破骨细胞的分化过程[39]；同样有研究表明，阻断Notch信号通路后，骨髓细胞破骨分化相关因子巨噬细胞集落刺激因子的表达会受到影响[40]，说明Notch信号通路参与破骨细胞形成。此次实验分别采用RT-PCR法和Wsetern blot法检测了Notch信号通路相关基因和蛋白的表达水平，结果发现，RAW264.7细胞采用RANKL诱导分化为破骨细胞的过程中，Notch1、Notch2、Hes1、Jaggde1、Jaggde2的表达水平较对照组大幅升高，而经过葛根素干预后，同步诱导RAW264.7细胞的Notch1、Notch2、Hes1、Jaggde1、Jaggde2基因和蛋白表达水平较破骨诱导组降低，在安全浓度范围内存在剂量依赖效应。该研究结果提示，葛根素干预会抑制Notch信号通路，且随着葛根素干预浓度的提高，Notch信号通路抑制效果越发明显，成功证明了Notch信号通路在葛根素调控破骨细胞分化中具有重要意义。
综上所述，Notch信号通路在RAW264.7细胞分化为破骨细胞的过程中起激动作用，葛根素可以抑制破骨细胞的分化和成熟，该抑制作用是通过阻断Notch信号通路的激活实现的。抑制破骨细胞的形成是治疗以牙周炎、骨质疏松和骨关节炎为代表的一系列骨质破坏相关疾病的重要手段，葛根素作为一种毒副作用小的中药有望在相关疾病的治疗中发挥作用。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

葛根素对RAW264.7细胞破骨分化的影响

Effects of puerarin on osteoclast differentiation of RAW264.7 cells

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