唑来膦酸调控NLRP3信号通路抑制脂多糖诱导的破骨细胞分化

doi:10.12307/2023.425

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (29): 4677-4683.doi: 10.12307/2023.425

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唑来膦酸调控NLRP3信号通路抑制脂多糖诱导的破骨细胞分化

刘官娟1，宋娜1，霍花1，罗珊珊1，程余婷1，熊玥1，洪伟2，廖健1

1贵州医科大学口腔医学院/附属口腔医院，贵州省贵阳市 550004；2贵州医科大学分子生物学重点实验室，贵州省贵阳市 550004

收稿日期:2022-05-19 接受日期:2022-07-07 出版日期:2023-10-18 发布日期:2022-12-02
通讯作者: 廖健，博士，教授，主任医师，博/硕士生导师，贵州医科大学口腔医学院修复学教研室，贵州医科大学附属口腔医院口腔修复种植科，贵州省贵阳市 550004
作者简介:刘官娟，女，1996年生，贵州省黔西市人，汉族，贵州医科大学在读硕士，主要从事口腔修复与种植学研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(82060207)，项目负责人：廖健

Zoledronic acid inhibits lipopolysaccharide-induced osteoclast differentiation by regulating NLRP3 signaling pathway

Liu Guanjuan1, Song Na1, Huo Hua1, Luo Shanshan1, Cheng Yuting1, Xiong Yue1, Hong Wei2, Liao Jian1

1School of Stomatology/Stomatological Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; 2Key Laboratory of Molecular Biology, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China

Received:2022-05-19 Accepted:2022-07-07 Online:2023-10-18 Published:2022-12-02
Contact: Liao Jian, MD, Professor, Chief physician, Doctoral/Master’s supervisor, School of Stomatology/Stomatological Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
About author:Liu Guanjuan, Master candidate, School of Stomotology/Stomotological Hospital of Guizhou Medical University, Guizhou Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 82060207 (to LJ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

脂多糖：是一种包含脂质和多糖的复合物，是革兰阴性菌细胞壁的特有成分，可诱导炎症反应。脂多糖可诱发免疫刺激的级联反应和机体的毒性病理生理活动，是导致慢性感染性骨疾病的主要介质，通过介导炎症因子来增强破骨细胞活性。
骨感染：是骨或骨周围组织被细菌微生物感染所致的危害性严重的骨破坏性疾病，发病率高、症状重、治疗困难，骨感染周围形成生物膜，而生物膜为细菌提供屏障装置，使得细菌难以被发现并清除，生物膜的存在使得骨感染难以治愈。

背景：唑来膦酸可抑制骨吸收，但其是否能抑制炎症性骨疾病及其相关机制尚不完全清楚。
目的：分析唑来膦酸对脂多糖诱导破骨细胞增殖、分化的影响。
方法：利用脂多糖将RAW264.7细胞诱导为破骨细胞，采用抗酒石酸酸性磷酸酶染色和F-actin染色鉴定诱导结果。将RAW264.7细胞分5组培养：空白对照组不进行任何干预，对照组加入脂多糖处理，其余3组在加入脂多糖的基础上分别加入0.1，1，5 μmol/L的唑来膦酸处理，培养6 h后，采用ELISA法检测上清液中肿瘤坏死因子α水平，Western Blot检测NLRP3、caspase-1、白细胞介素1β、cleaved-caspase-1及肿瘤坏死因子α的蛋白表达。培养第5天，抗酒石酸酸性磷酸酶染色观察破骨细胞形成情况，F-actin染色观察破骨细胞肌动蛋白环。
结果与结论：①抗酒石酸酸性磷酸酶染色和F-actin染色显示，脂多糖可诱导RAW264.7细胞分化为破骨细胞；②对照组肿瘤坏死因子α水平高于空白对照组(P < 0.05)，0.1，5 μmol/L唑来膦酸组肿瘤坏死因子α水平低于对照组(P < 0.05)；抗酒石酸酸性磷酸酶染色与F-actin染色显示，1，5 μmol/L唑来膦酸可抑制脂多糖诱导RAW264.7细胞分化为破骨细胞；③与对照组比较，0.1，1，5 μmol/L的唑来膦酸均可抑制NLRP3、caspase-1、白细胞介素1β及肿瘤坏死因子α的蛋白表达(P < 0.05)，1，5 μmol/L的唑来膦酸均可抑制cleaved-caspase-1的蛋白表达(P < 0.05)；④结果表明，唑来膦酸可抑制脂多糖诱导的破骨细胞分化，该作用可能是通过调控NLRP3信号通路实现的。
https://orcid.org/0000-0002-0556-170X(刘官娟)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

关键词: 唑来膦酸, 脂多糖, 破骨细胞, RAW264.7细胞, NLRP3信号通路, 抗酒石酸酸性磷酸酶, 炎性骨疾病, 骨感染

Abstract: BACKGROUND: Zoledronic acid can inhibit bone resorption, but whether it can inhibit inflammatory bone disease and its related mechanisms are completely unclear.
OBJECTIVE: To investigate the effect of zoledronic acid on the proliferation and differentiation of osteoclasts induced by lipopolysaccharide.
METHODS: RAW264.7 cells were treated with lipopolysaccharide for osteoclastic induction and dyed with tartrate-resistant acid phosphatase and F-actin. RAW264.7 cells were cultured in vitro and divided into blank control group (no intervention), control group (treated with lipopolysaccharide), and 0.1, 1, 5 μmol/L zoledronic acid groups (lipopolysaccharide+0.1, 1, 5 μmol/L zoledronic acid). After 6 hours of culture, the level of tumor necrosis factor α in the supernatant was detected by ELISA, and the protein expression levels of NLRP3, caspase-1, interleukin-1β, cleaved-caspase-1 and tumor necrosis factor α were detected by western blot assay. On the 5th day of culture, the formation of osteoclasts was observed by tartrate-resistant acid phosphatase staining, and the expression of actin rings in osteoclasts was observed by F-actin staining.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Lipopolysaccharide could induce RAW264.7 cells to differentiate into osteoclasts. (2) The level of tumor necrosis factor α was higher in the control group than the blank control group (P < 0.05) and lower in the 0.1 and 5 μmol/L zoledronic acid groups than the control group (P < 0.05). Results from tartrate-resistant acid phosphatase and F-actin staining indicated that 1 and 5 μmol/L zoledronic acid could inhibit lipopolysaccharide-induced differentiation of RAW264.7 cells into osteoclasts. (3) Compared with the control group, 0.1, 1, and 5 μmol/L zoledronic acid could inhibit the protein expression of NLRP3, caspase-1, interleukin-1β, and tumor necrosis factor α (P < 0.05), while 1 and 5 μmol/L zoledronic acid could inhibit the protein expression of cleaved-caspase-1 (P < 0.05). (4) To conclude, zoledronic acid can inhibit osteoclast formation induced by lipopolysaccharide, which acts possibly through regulating the NLRP3 signaling pathway.

Key words: zoledronic acid, lipopolysaccharide, osteoclast, RAW264.7 cell, NLRP3 signaling pathway, tartrate-resistant acid phosphatase, inflammatory bone disease, bone infection

中图分类号:

刘官娟, 宋娜, 霍花, 罗珊珊, 程余婷, 熊玥, 洪伟, 廖健. 唑来膦酸调控NLRP3信号通路抑制脂多糖诱导的破骨细胞分化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(29): 4677-4683.

Liu Guanjuan, Song Na, Huo Hua, Luo Shanshan, Cheng Yuting, Xiong Yue, Hong Wei, Liao Jian. Zoledronic acid inhibits lipopolysaccharide-induced osteoclast differentiation by regulating NLRP3 signaling pathway[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(29): 4677-4683.

图/表（结果） 9

2.1 RAW264.7细胞融合为破骨细胞形成过程 RAW264.7细胞呈圆形，透亮，体积较小，未见多核；脂多糖作用一段时间后，细胞增大，形状不规则，伸出伪足样凸起，有许多空泡样结构，呈油煎蛋样，见图1A、B。经抗酒石酸酸性磷酸酶染色后，与对照组相比，实验组在倒置相差显微镜下可见酒红色的细胞质且胞核内见大量胞核(≥3)堆积在一起，见图1C、D。经罗丹明标记的鬼笔环肽染色后，实验组在倒置荧光显微镜下可见清晰的环形肌动蛋白环结构，细胞内可见大量细胞核聚集在一起，见图2。

2.2 唑来膦酸对RAW264.7细胞活力的影响采用CCK8法检测唑来膦酸对细胞的毒性作用，结果显示：与0 μmol/L组相比，0.1-10 μmol/L的唑来膦酸在24，48，72 h对细胞活力无明显影响(P > 0.05)，30 μmol/L的唑来膦酸在48，72 h对细胞活力有影响(69.33%，66.72%，P < 0.001)，50 μmol/L唑来膦酸在72 h对细胞活力有显著影响(P < 0.000 1)，此时细胞活力低于50%，见图3。选取安全范围内较低浓度的唑来膦酸(0.1，1，5 μmol/L)作为后续实验浓度。

2.3 各组细胞上清液中肿瘤坏死因子α的水平与空白对照组比较，其他4组细胞上清液中肿瘤坏死因子α的分泌量增加(P < 0.000 1)；与对照组比较，0.1，5 μmol/L唑来膦酸组肿瘤坏死因子α的分泌量降低(P < 0.000 1)，见图4。

2.4 唑来膦酸抑制脂多糖诱导的破骨细胞生成各组细胞抗酒石酸酸性磷酸酶染色见图5A-E。抗酒石酸酸性磷酸酶染色量化分析结果见图5F、G，结果显示：1，5 μmol/L唑来膦酸组抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性破骨细胞数目及面积小于对照组(P < 0.000 1)。

2.5 唑来膦酸对破骨细胞肌动蛋白环的影响各组RAW264.7细胞F-actin染色图片见图6，结果显示：与对照组相比，0.1 μmol/L唑来膦酸对脂多糖诱导的破骨细胞肌动蛋白环结构并无明显影响，1，5 μmol/L唑来膦酸均导致破骨细胞肌动蛋白环结构无法正确形成，且细胞核数目也相应减少。

上述实验初步证实脂多糖能够诱导破骨细胞生成，且唑来膦酸能抑制脂多糖诱导的破骨细胞生成，进一步采用Western blot实验检测唑来膦酸对NLRP3信号通路相关蛋白及炎症相关蛋白肿瘤坏死因子α的影响，见图7，8。

实验结果显示，与空白对照组相比，对照组NLRP3、caspase-1、白细胞介素1β、cleaved-caspase-1及肿瘤坏死因子α的蛋白表达量明显增加(P < 0.001，P < 0.000 1)；与对照组相比，0.1，1，5 μmol/L唑来膦酸组NLRP3、caspase-1、白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α的蛋白表达量降低(P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001)，1，5 μmol/L唑来膦酸组cleaved-caspase-1蛋白表达降低(P < 0.000 1)。

参考文献

[1] TANAKA S, TANAKA Y, ISHIGURO N, et al. RANKL: A therapeutic target for bone destruction in rheumatoid arthritis. Mod Rheumatol. 2018; 28(1):9-16.
[2] 王艺睿,王会,戚孟春,等.钙调蛋白依赖性激酶Ⅱγ RNA干扰载体构建及对破骨细胞分化和骨吸收的影响[J].实用医学杂志, 2019,35(4):557-561.
[3] NAIR SP, MEGHJI S, WILSON M, et al. Bacterially induced bone destruction: mechanisms and misconceptions. Infect Immun. 1996; 64(7):2371-2380.
[4] 刘子歌,张晨,宋国瑞,等.白藜芦醇对LPS刺激下RAW264.7细胞向破骨细胞分化的影响[J].医学研究杂志,2020,49(9):27-31.
[5] IVANOV K, GARANINA E, RIZVANOV A, et al. Inflammasomes as Targets for Adjuvants. Pathogens. 2020;9(4):252.
[6] 张坦,王茹,丁树哲.糖脂代谢参与NLRP3炎症小体活化的研究进展[J].生命科学,2022,34(4):385-391.
[7] REN H, KONG Y, LIU Z, et al. Selective NLRP3 (Pyrin Domain-Containing Protein 3) Inflammasome Inhibitor Reduces Brain Injury After Intracerebral Hemorrhage. Stroke. 2018;49(1):184-192.
[8] VAN OPDENBOSCH N, LAMKANFI M. Caspases in Cell Death, Inflammation, and Disease. Immunity. 2019;50(6):1352-1364.
[9] PARK S, SHIN J, BAE J, et al. SIRT1 Alleviates LPS-Induced IL-1β Production by Suppressing NLRP3 Inflammasome Activation and ROS Production in Trophoblasts. Cells. 2020;9(3):728.
[10] YARILINA A, XU K, CHEN J, et al. TNF activates calcium-nuclear factor of activated T cells (NFAT)c1 signaling pathways in human macrophages. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011;108(4):1573-1578.
[11] DENG S, DAI G, CHEN S, et al. Dexamethasone induces osteoblast apoptosis through ROS-PI3K/AKT/GSK3β signaling pathway. Biomed Pharmacother. 2019;110:602-608.
[12] LIN CN, DING SJ, CHEN CC. Synergistic Photoantimicrobial Chemotherapy of Methylene Blue-Encapsulated Chitosan on Biofilm-Contaminated Titanium. Pharmaceuticals (Basel). 2021;14(4):728.
[13] 刘奇奇,刘敏,杨健,等.脂多糖刺激小鼠MLO-Y4骨细胞白细胞介素6及核因子κB受体活化因子配体的表达[J].中国组织工程研究,2022,26(30):3121-3126.
[14] KITAURA H, MARAHLEH A, OHORI F, et al. Osteocyte-Related Cytokines Regulate Osteoclast Formation and Bone Resorption. Int J Mol Sci. 2020;21(14):5169.
[15] ALQRANEI MS, CHELLAIAH MA. Osteoclastogenesis in periodontal diseases: Possible mediators and mechanisms. J Oral Biosci. 2020;62(2): 123-130.
[16] 曾立,徐永明,邢更彦.脂多糖对破骨细胞生成及骨吸收功能作用及其机制研究[J].中国修复重建外科杂志,2018,32(5):568-574.
[17] ISLAM S, HASSAN F, TUMURKHUU G, et al. Bacterial lipopolysaccharide induces osteoclast formation in RAW 264.7 macrophage cells. Biochem Biophys Res Commun. 2007;360(2):346-351.
[18] 高爱超,于海燕,李娜,等.牙龈卟啉单胞菌脂多糖(Pg-LPS)对破骨细胞EphA2基因表达的调控[J]. 口腔医学研究,2015,31(3):268-271+275.
[19] ONO T, NAKASHIMA T. Recent advances in osteoclast biology. Histochem Cell Biol. 2018;149(4):325-341.
[20] COLLIN-OSDOBY P, OSDOBY P. RANKL-mediated osteoclast formation from murine RAW 264.7 cells. Methods Mol Biol. 2012;816:187-202.
[21] CHEN JS, SAMBROOK PN. Antiresorptive therapies for osteoporosis: a clinical overview. Nat Rev Endocrinol. 2011;8(2):81-91.
[22] DRAKE MT, CLARKE BL, KHOSLA S. Bisphosphonates: mechanism of action and role in clinical practice. Mayo Clin Proc. 2008;83(9): 1032-1045.
[23] BOWDEN SA, MAHAN JD. Zoledronic acid in pediatric metabolic bone disorders. Transl Pediatr. 2017;6(4):256-268.
[24] DHILLON S. Zoledronic Acid (Reclast(®), Aclasta(®)): A Review in Osteoporosis. Drugs. 2016;76(17):1683-1697.
[25] 黄晓林,廖健,洪伟,等.破骨细胞形成过程中唑来膦酸的作用途径及机制[J].中国组织工程研究,2019,23(17):2716-2721.
[26] HUANG XL, HUANG LY, CHENG YT, et al. Zoledronic acid inhibits osteoclast differentiation and function through the regulation of NF-κB and JNK signalling pathways. Int J Mol Med. 2019;44(2):582-592.
[27] HAYMAN AR. Tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) and the osteoclast/immune cell dichotomy. Autoimmunity. 2008;41(3): 218-223.
[28] MINKIN C. Bone acid phosphatase: tartrate-resistant acid phosphatase as a marker of osteoclast function. Calcif Tissue Int. 1982;34(3): 285-290.
[29] TEVLIN R, MCARDLE A, CHAN CK, et al. Osteoclast derivation from mouse bone marrow. J Vis Exp. 2014;(93):e52056.
[30] NABAVI N, KHANDANI A, CAMIRAND A, et al. Effects of microgravity on osteoclast bone resorption and osteoblast cytoskeletal organization and adhesion. Bone. 2011;49(5):965-974.
[31] TEITELBAUM SL. The osteoclast and its unique cytoskeleton. Ann N Y Acad Sci. 2011;1240:14-17.
[32] MATSUBARA T, KINBARA M, MAEDA T, et al. Regulation of osteoclast differentiation and actin ring formation by the cytolinker protein plectin. Biochem Biophys Res Commun. 2017;489(4):472-476.
[33] KODAMA J, KAITO T. Osteoclast Multinucleation: Review of Current Literature. Int J Mol Sci. 2020;21(16):5685.
[34] CHO YA, JUE SS, BAE WJ, et al. PIN1 inhibition suppresses osteoclast differentiation and inflammatory responses. J Dent Res. 2015;94(2): 371-380.
[35] 任莉荣,王海,何晓清,等.金葡菌脂磷壁酸促进破骨细胞分化的分子机制[J].实用医学杂志,2016,32(20):3369-3372.
[36] ZHANG Y, YAN M, YU Q F, et al. Puerarin Prevents LPS-Induced Osteoclast Formation and Bone Loss via Inhibition of Akt Activation. Biol Pharm Bull. 2016;39(12):2028-2035.
[37] GHAYOR C, GJOKSI B, SIEGENTHALER B, et al. N-methyl pyrrolidone (NMP) inhibits lipopolysaccharide-induced inflammation by suppressing NF-κB signaling. Inflamm Res. 2015;64(7):527-536.
[38] HOTOKEZAKA H, SAKAI E, OHARA N, et al. Molecular analysis of RANKL-independent cell fusion of osteoclast-like cells induced by TNF-alpha, lipopolysaccharide, or peptidoglycan. J Cell Biochem. 2007;101(1): 122-134.
[39] ALQRANEI MS, SENBANJO LT, ALJOHANI H, et al. Lipopolysaccharide- TLR-4 Axis regulates Osteoclastogenesis independent of RANKL/RANK signaling. BMC Immunol. 2021;22(1):23.
[40] JIANG N, AN J, YANG K, et al. NLRP3 Inflammasome: A New Target for Prevention and Control of Osteoporosis? Front Endocrinol (Lausanne). 2021;12:752546.
[41] 陆佳伟,刘效谷,张文波.LncRNA及miRNA对NLRP3炎症小体信号的调控机制及其在相关疾病中的意义[J].实用医学杂志,2020, 36(22):3149-3152.
[42] MOOSSAVI M, PARSAMANESH N, BAHRAMI A, et al. Role of the NLRP3 inflammasome in cancer. Mol Cancer. 2018;17(1):158.
[43] CHEN Y, YANG Q, LV C, et al. NLRP3 regulates alveolar bone loss in ligature-induced periodontitis by promoting osteoclastic differentiation. Cell Prolif. 2021;54(2):e12973.
[44] DETZEN L, CHEAT B, BESBES A, et al. NLRP3 is involved in long bone edification and the maturation of osteogenic cells. J Cell Physiol. 2021;236(6):4455-4469.
[45] ZANG Y, SONG JH, OH SH, et al. Targeting NLRP3 Inflammasome Reduces Age-Related Experimental Alveolar Bone Loss. J Dent Res. 2020;99(11):1287-1295.
[46] RUSCITTI P, CIPRIANI P, CARUBBI F, et al. The role of IL-1β in the bone loss during rheumatic diseases. Mediators Inflamm. 2015;2015: 782382.
[47] KAWAHARA Y, KANEKO T, YOSHINAGA Y, et al. Effects of Sulfonylureas on Periodontopathic Bacteria-Induced Inflammation. J Dent Res. 2020;99(7):830-838.
[48] 党万太,谢文光,赵明才,等.痛风性关节炎患者NLRP3炎性体基因转录剪接体mRNA表达与临床检测指标的相关分析[J].第三军医大学学报,2014,36(16):1713-1719.
[49] 史纪元,姬乐,武世勋,等.淫羊藿苷通过抑制NLRP3炎性小体和Caspase-1通路减轻骨关节炎[J]. 世界中医药,2021,16(18):2706-2713.

引言

炎症性骨疾病是一种由于破骨细胞过度活化导致的代谢性疾病[1-2]，微生物产物及炎症相关因子在炎症性骨疾病的发生发展中发挥着重要作用。脂多糖是革兰阴性菌细胞壁的重要组成部分，能够诱发炎症反应。在革兰阴性菌引起的炎性骨疾病中，破骨细胞活性增加、炎症加重，扰乱骨稳态并导致骨溶解[3-4]。炎性小体是机体受刺激后形成的一种多蛋白复合物，通常包括凋亡相关斑点样蛋白、caspase蛋白酶(半胱氨酸蛋白酶)及一种NOD样受体家族蛋白[5]，caspase蛋白酶主要参与细胞死亡和炎症反应。模式识别受体是炎性小体的重要组成部分。NLRP3被激活后诱导炎症因子合成与分泌，NLRP3炎性小体参与多种疾病的发生[6]。机体受刺激后，NLR寡聚体化促进caspase-1活化，活化后的caspase-1(cleaved-caspase-1)通过剪切白细胞介素1β前体，使其成为成熟和活跃形式，促进cleaved-白细胞介素1β的释放[7-8]。脂多糖结合Toll样受体后可导致NLRP3炎性小体激活[9]。脂多糖刺激巨噬细胞后诱导其分泌炎症因子肿瘤坏死因子α，而肿瘤坏死因子α在慢性炎症性骨吸收过程中促进破骨细胞分化[10]。脂多糖引发的炎症性骨疾病如种植体周围炎、牙周炎等，常导致牙槽骨吸收，从而使种植失败[11-12]。研究表明，在炎症反应中，脂多糖与骨细胞中Toll样受体结合后能诱导白细胞介素6的表达[13]，也能诱导核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)的表达，从而促进破骨细胞生成[14-15]。在体外，脂多糖能够不依赖于RANKL促进细胞融合，诱导破骨细胞的形成[16-17]。牙龈卟啉单胞菌产生的内毒素脂多糖可促进RAW264.7细胞向破骨细胞分化[18]。破骨细胞的活化在骨重塑过程中发挥重要作用[19]，由于破骨细胞存活时间短且不易获得，在体外常用破骨前体细胞RAW264.7诱导为破骨细胞[20]。
唑来膦酸是第3代含氮双膦酸类药物[21-22]，与同类药物相比，唑来膦酸抑制破骨细胞骨吸收的能力更强[23]，因此被广泛用于原发性或继发性骨质疏松的患者[24]。目前，大多数研究致力于唑来膦酸对RANKL诱导的破骨细胞分化的影响，而在脂多糖诱导破骨细胞中的相关研究较少。唑来膦酸在体外可通过核因子κB信号通路抑制RANKL诱导的破骨细胞形成及骨吸收功能[25-26]，但能否抑制脂多糖诱导的破骨细胞及其相关作用机制尚不完全明确。因此，分析唑来膦酸对脂多糖诱导的炎性骨质破坏对研究炎症性骨疾病的临床治疗有重要意义。实验旨在研究唑来膦酸对脂多糖诱导破骨细胞生成的影响，并探讨其可能的作用机制。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学实验，组间总体比较采用方差分析(One Way ANOVA和Two Way ANOVA)，组间两两比较采用Dunnett-t和Bronferroni-t检验。
1.2 时间及地点实验于2021年7月到2022年3月在贵州医科大学分子生物学重点实验室完成。
1.3 材料小鼠单核巨噬细胞RAW264.7(ATCC，美国)；DMEM培养基、α-MEM、胎牛血清、青霉素-链霉素双抗(Gibco公司，美国)；脂多糖、唑来膦酸(Sigma)；蛋白提取试剂盒、罗丹明标记的鬼笔环肽、DAPI染色液、抗酒石酸酸性磷酸酶染色试剂盒(索莱宝，中国)；NLRP3、caspase-1、白细胞介素1β抗体、二抗(Abcam)；cleaved-caspase-1(CST)；β-actin(爱必信)；细胞毒性试剂盒(Dojindo公司，日本)。
1.4 实验方法
1.4.1 细胞培养迅速复苏RAW264.7细胞，接种于含体积分数10%胎牛血清、1%双抗的高糖培养基DMEM的细胞培养瓶内，置37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养。第2天观察细胞贴壁情况，隔天换液，待细胞密度到80%-90%时传代，冻存。选取处于对数生长期的细胞进行后续实验。
1.4.2 破骨细胞形成实验
抗酒石酸酸性磷酸酶染色：将RAW264.7细胞以孔1 500个/孔的密度接种于96孔板，分2组培养：对照组加入完全培养基(含体积分数10%胎牛血清、1%双抗的α-MEM培养基)，实验组加入含100 ng/mL脂多糖的完全培养基。隔天换液，培养至第5天时，进行抗酒石酸酸性磷酸酶染色，倒置相差显微镜下观察细胞形态和数目差异。
F-actin染色：将RAW264.7细胞以1×104/孔的密度接种于含爬片的24孔板，分2组培养：对照组加入完全培养基，实验组加入含100 ng/mL脂多糖的完全培养基。培养至第5天时，用预热的PBS洗2次，以40 g/L多聚甲醛在4 ℃固定10 min，PBS洗2次，每次10 min；以0.25%Triton X-100透化5 min，罗丹明标记的鬼笔环肽在室温染色30 min，PBS洗2次，每次5 min；DAPI避光染核30 s，PBS清洗，弃净PBS，用抗荧光淬灭封固剂封固保存，倒置荧光显微镜下观察图像并拍照记录。
1.4.3 CCK8实验检测细胞毒性将RAW264.7细胞接种于含DMEM培养基的96孔板过夜，细胞浓度为2×107 L-1，每孔200 µL，第2天更换含不同浓度唑来膦酸(0，0.1，1，5，10，30，50 μmol/L)的α-MEM培养基。药物作用24，48，72 h后，每孔加入10 μL CCK8试剂，在37 ℃条件下避光孵育3 h，在450 nm波长下测定吸光度值，根据吸光度值计算细胞活力，进而选取对细胞无毒性的唑来膦酸浓度进行后续实验。
1.4.4 ELISA法检测细胞上清液中肿瘤坏死因子α水平将 RAW264.7细胞接种于96孔板中，细胞浓度为1×109 L-1，待12 h细胞完全贴壁后分5组培养：空白对照组加入完全培养基，对照组加入含100 ng/mL脂多糖的完全培养基，其余3组分别加入含0.1，1，5 μmol/L唑来膦酸的完全培养基处理1 h，随后再加入含100 ng/mL脂多糖的完全培养基处理6 h。培养6 h后提取细胞上清液，按ELISA试剂盒测定细胞上清液中的肿瘤坏死因子α水平。
1.4.5 抗酒石酸酸性磷酸酶染色将 RAW264.7细胞接种于96孔板中过夜，细胞浓度为2×107 L-1，每孔100 µL，按1.4.4分组处理，隔天换液。培养第5天后，弃培养基，PBS清洗，TRAP固定液固定10 min，PBS洗2次；抗酒石酸酸性磷酸酶孵育液避光孵育3 h，PBS洗3次，显微镜下随机选取5个视野拍照，并计数阳性多核细胞(细胞核≥3个)。
1.4.6 F-actin染色将RAW264.7细胞接种于含爬片的24孔板，细胞密度为2 000个/孔，按1.4.4分组处理。培养第5天后，用罗丹明标记的鬼笔环肽染色，激光共聚焦显微镜下拍照并记录。
1.4.7 Western blot检测NLRP3信号通路蛋白表达将 RAW264.7细胞接种于6孔板，细胞浓度为3×109 L-1，每孔3 mL，培养12 h后，用无血清、无双抗的α-MEM培养基饥饿培养4 h，然后按1.4.4分组处理。6 h后，用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA定量蛋白浓度，加入上样缓冲液后煮沸变性，上样、电泳、转膜，脱脂牛奶封闭90 min，加入一抗(NLRP3、caspase-1、白细胞介素1β、cleaved-caspase-1、肿瘤坏死因子α，稀释比例均为1∶1 000)4 ℃孵育过夜；TBST洗3次，10 min/次；加入二抗(稀释比例1∶10 000)室温孵育90 min；TBST洗膜3次，10 min/次，曝光后用Image J软件分析条带的灰度值。
1.5 主要观察指标 ①脂多糖诱导RAW264.7细胞分化为破骨细胞情况，唑来膦酸对破骨细胞形态及肌动蛋白环的影响；②唑来膦酸对RAW264.7细胞活力的影响；③唑来膦对脂多糖诱导破骨细胞分泌炎症因子肿瘤坏死因子α水平的影响；④唑来膦酸对脂多糖诱导破骨细胞NLRP3、caspase-1、白细胞介素1β、cleaved-caspase-1、肿瘤坏死因子α蛋白表达的影响。
1.6 统计学分析采用GraphPad Prism 7.0统计学软件对数据进行统计分析，计量资料用x±s表示，若数据满足正态性及方差齐性，组间总体比较采用方差分析(One Way ANOVA和Two Way ANOVA)，组间两两比较采用Dunnett-t和Bronferroni-t检验；若数据不满足正态性及方差齐性，则采用秩和检验。检验水准：α=0.05，P < 0.05为差异有显著性意义。该文统计学已经贵州医科大学统计学专家审核。

讨论

3.1 唑来膦酸抑制脂多糖诱导的破骨细胞分化抗酒石酸酸性磷酸酶是破骨细胞的组织化学标记物[27]，在骨骼和免疫系统中发挥重要作用，抗酒石酸酸性磷酸酶染色是鉴定破骨细胞形成的重要指标[28]。脂多糖作用5 d后，可见细胞质中抗酒石酸酸性磷酸酶活性部位呈酒红色，且细胞核增多(胞核≥3)，而经CCK8筛选出安全浓度唑来膦酸(0.1，1，5 μmol/L)作用后，1，5 μmol/L唑来膦酸组抗酒石酸酸性磷酸酶阳性细胞数量及面积都减少，说明破骨细胞分化受到抑制。成熟的破骨细胞巨大且多核[29]，并会形成有褶皱边缘的肌动蛋白环结构[30-31]。破骨细胞肌动蛋白环是一种典型的肌动蛋白，这种环形结构对破骨细胞的存活及活性至关重要[32]，破骨细胞动态的多核形成过程不仅增加了细胞大小，而且通过重建细胞骨架导致功能改变，形成肌动蛋白环和褶皱边缘，从而实现骨吸收[33]。脂多糖作用后，破骨细胞环形结构大量增加，而经唑来膦酸(1，5 μmol/L)处理后，环形结构不完整，不能形成密封的褶皱边缘，说明唑来膦酸会干扰破骨细胞环形结构的形成，从而抑制破骨细胞的活性。
3.2 唑来膦酸抑制肿瘤坏死因子α的表达炎症反应和破骨细胞分化在骨溶解性疾病中起重要作用[34]，脂多糖除了可增加炎症外，还调节破骨细胞的分化和活性。刺激破骨前体细胞RAW264.7产生促炎细胞因子可间接促进破骨细胞的分化[35]。脂多糖引起炎症反应后，导致大量促炎递质如肿瘤坏死因子α的释放，而肿瘤坏死因子α参与破骨细胞的分化[36-37]，采用肿瘤坏死因子α抗体阻断治疗可阻断脂多糖诱导的破骨细胞生成[38]，肿瘤坏死因子α可能是抑制炎症性骨吸收的潜在靶点[39]。用脂多糖刺激RAW264.7细胞后，ELISA检测到细胞上清液中含大量肿瘤坏死因子α，而经唑来膦酸作用后细胞上清液中肿瘤坏死因子α明显下降，经Western blot检测到肿瘤坏死因子α蛋白表达量也下降。
3.3 唑来膦酸抑制NLRP3炎性相关蛋白的表达 NLRP3炎性体是一种细胞内多蛋白复合物，调节caspase-1依赖性促炎细胞因子白细胞介素1β和白细胞介素18的成熟和分泌，在细胞外环境中诱导炎症反应[40]。NLRP3炎性小体与癌症、炎症等疾病的进展密切相关[41-42]，NLRP3过度活化会引起破骨细胞分化增多[43-44]。牙槽骨的骨吸收水平与NLRP3炎性体调节的白细胞介素1β密切相关[45]，白细胞介素1β能触发骨吸收[46]，抑制NLRP3会是治疗牙周病的靶点之一[47]，并且NLRP3炎性体基因转录剪接体在痛风性关节炎中起重要作用[48]，通过干扰脂多糖诱导的NLRP3和caspase-1会缓解骨关节炎的发展[49]。1 μmol/L唑来膦酸并未抑制肿瘤坏死因子α的分泌，却抑制肿瘤坏死因子α蛋白的表达，可能是因为ELISA主要测上清液中分泌型蛋白且灵敏度较高，即使表达量微弱也能被检测出来，所以0.1 μmol/L唑来膦酸(较低浓度)也能抑制其表达，但唑来膦酸可能对这种肿瘤坏死因子α分泌型蛋白的抑制作用并不呈浓度依赖性，所以1 μmol/L唑来膦酸不抑制其表达。0.1 μmol/L唑来膦酸并未抑制破骨细胞的分化，也不影响破骨细胞肌动蛋白环的正确形成，但却抑制NLRP3炎性相关蛋白及炎症因子肿瘤坏死因子α的表达，可能是较低浓度唑来膦酸在短期内抑制破骨细胞炎性相关蛋白的表达，随着时间延长，较低浓度唑来膦酸作用效果并不明显。而0.1 μmol/L唑来膦酸不抑制cleaved-caspase-1的表达，却抑制caspase-1的表达，因为cleaved-caspase-1是caspase-1在体内的活性剪切体形式，剪切体形式是前体形式被剪切之后形成的片段，说明较低浓度唑来膦酸可能只对剪切前的caspase-1发挥抑制作用，对caspase-1的活性剪切体形式不产生影响，所以要抑制caspase-1活性剪切体形式，可能还需要更高浓度的唑来膦酸。
3.4 唑来膦酸抑制脂多糖诱导破骨细胞分化的可能机制综上所述，唑来膦酸可能通过抑制NLRP3信号通路上NLRP3炎性相关因子的表达，从而抑制脂多糖诱导的炎性破骨前体细胞RAW264.7形成，但后期仍需动物实验和反向实验证实，进一步探讨唑来膦酸在脂多糖诱导的不依赖RANKL的炎性破骨前体细胞RAW264.7分化中的潜在机制。研究唑来膦酸抑制脂多糖诱导的破骨前体细胞RAW264.7形成与活化，可以为唑来膦酸应用于炎症性骨疾病提供理论基础。此次实验只探讨唑来膦酸对单一细胞组分的影响，而体内骨稳态则需要破骨细胞和成骨细胞协调作用，因此，还需建立共培养体系更好地模拟体内骨微环境，进一步证实唑来膦酸对脂多糖诱导的炎性破骨前体细胞RAW264.7的相关作用机制。另外，为了达到治疗目的，并且尽可能少量地使用药物，有必要寻找最佳的药物浓度应用于临床治疗中。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

唑来膦酸调控NLRP3信号通路抑制脂多糖诱导的破骨细胞分化

Zoledronic acid inhibits lipopolysaccharide-induced osteoclast differentiation by regulating NLRP3 signaling pathway

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[1]	党祎, 杜成砚, 姚红林, 袁能华, 曹金, 熊山, 张顶梅, 王信. 激素型骨坏死与氧化应激[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(9): 1469-1476.
[2]	杨芷姗, 唐正龙. Hippo信号通路中的核心因子YAP/TAZ参与骨形成的作用与机制[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(8): 1264-1271.
[3]	唐亮, 李熙恒, 牛瑞娟, 李欣悦, 邹馨颖, 毛天骄, 李江. 柚皮苷通过调控RAW264.7细胞功能影响MC-3T3-E1细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(8): 1205-1210.
[4]	黄林科, 韦林华, 蒋捷, 刘倩, 陈蔚蔚. 雌激素与跑台运动干预卵巢切除模型小鼠骨量和关节软骨的变化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(8): 1166-1171.
[5]	张敏, 张晓明, 刘童斌. 柚皮苷在骨组织再生领域的应用潜力[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(5): 787-792.
[6]	沈梦然, 任岩松, 周宇, 岳德波, 马金辉, 王佰亮. 白细胞介素33介导的骨免疫[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(29): 4723-4728.
[7]	韦宗波, 苏允裕, 章晓云, 黄为, 许航, 刘荣发. 长链非编码RNA调控膝骨关节炎中软骨下骨稳态的作用与机制[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(29): 4736-4744.
[8]	崔红旺, 王良盛, 温鹏, 孟志斌. 破骨细胞TRPV5通道对体外降解生物珊瑚人工骨的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(21): 3337-3342.
[9]	曹金, 王安素, 黄妮姣, 伍富俊, 陈萍, 李成梅, 王信. 在骨组织再生过程中聚磷酸盐的作用与机制[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(21): 3375-3381.
[10]	孙芳园, 孟佳磊, 马宇慧, 耿欢, 张涛. 川芎嗪对脂多糖诱导大鼠心肌细胞炎症及氧化应激的作用[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(20): 3253-3258.
[11]	陈锋, 任国武, 章晓云, 陈跃平, 石儒生. 核因子κB受体活化因子信号转导机制与破骨细胞的活化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(2): 293-299.
[12]	武瑞骐, 崔伟, 杨启培, 周毅, 张璇. 激素性股骨头坏死的中医药治疗机制[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(17): 2763-2771.
[13]	黄浩然, 卫杨文祥, 章家皓, 莫亮, 刘予豪, 陈镇秋, 王海彬, 周驰. Piezo1介导的机械应力刺激在抗骨质疏松中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(17): 2716-2722.
[14]	闫立言, 韩萧男, 寇红伟, 尚国伟, 冷子宽, 刘宏建, 程田. 褪黑素防治骨质疏松症的作用与应用现状[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(14): 2222-2228.
[15]	王景, 熊山, 曹金, 冯林伟, 王信. 白细胞介素3在骨代谢中的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1260-1265.