破骨细胞分化过程中丙酮酸的作用

doi:10.12307/2023.584

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (31): 5015-5021.doi: 10.12307/2023.584

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破骨细胞分化过程中丙酮酸的作用

刘官娟1，夏千禧1，宋娜1，霍花1，洪伟2，廖健1

1贵州医科大学口腔医学院/附属口腔医院，贵州省贵阳市 550004；2贵州医科大学分子生物学重点实验室，贵州省贵阳市 550004

收稿日期:2022-08-24 接受日期:2022-10-12 出版日期:2023-11-08 发布日期:2023-01-31
通讯作者: 廖健，博士，教授，主任医师，博士/硕士生导师，贵州医科大学口腔医学院口腔修复学教研室，贵州医科大学附属口腔医院口腔修复种植科，贵州省贵阳市 550004
作者简介:刘官娟，女，贵州省黔西市人，汉族，贵州医科大学在读硕士，主要从事口腔修复与种植学研究。夏千禧，女，贵州省铜仁市人，侗族，贵州医科大学在读学士。
基金资助:
国家自然科学基金(82060207)，项目负责人：廖健；贵州省卫生健康委科学技术基金(gzwkj2022-165)，项目负责人：廖健；大学生创新创业训练项目(202110660022)，项目负责人：夏千禧，指导老师：廖健

Role of pyruvic acid in osteoclast differentiation

Liu Guanjuan1, Xia Qianxi1, Song Na1, Huo Hua1, Hong Wei2, Liao Jian1

1School of Stomatology/Stomatological Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; 2Key Laboratory of Molecular Biology, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China

Received:2022-08-24 Accepted:2022-10-12 Online:2023-11-08 Published:2023-01-31
Contact: Liao Jian, MD, Professor, Chief physician, Doctoral/Master’s supervisor, School of Stomatology/Stomatological Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
About author:Liu Guanjuan, Master candidate, School of Stomotology/Stomotological Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China Xia Qianxi, School of Stomatology/Stomatological Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 82060207 (to LJ); Science and Technology Foundation of Guizhou Provincial Health Commission, No. gzwkj2022-165 (to LJ); College Student Innovation and Entrepreneurship Training Project, No. 202110660022 (to XQX and LJ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

骨代谢：骨骼是人体内最大的器官系统之一，是内分泌器官。骨骼作为矿物盐的重要储存库，维持机体磷酸盐和钙离子的代谢平衡，骨细胞在不停地进行细胞代谢，吸收骨基质的破骨细胞和合成骨基质的成骨细胞在骨代谢中起重要作用，其他细胞因子和激素等也参与到骨代谢过程中。
骨稳态：骨稳态平衡主要由骨细胞、成骨细胞和破骨细胞共同调节，成骨细胞和破骨细胞的增殖、分化和凋亡最终决定骨形成和骨吸收，共同构建骨稳态平衡。当破骨细胞过度活跃时，骨平衡被打破，骨破坏性疾病也随之发生，因此，维持骨稳态是预防骨疾病的有效措施之一。

背景：糖酵解在破骨细胞分化过程中起关键作用，成熟破骨细胞骨吸收主要依赖于糖酵解。丙酮酸作为糖酵解的终末产物，在三大营养物质的代谢中起重要的枢纽作用。
目的：探讨丙酮酸对破骨细胞分化的影响。
方法：采用CCK-8法检测不同浓度(0.1，1，10，20，30，50 mmol/L)丙酮酸对RAW264.7细胞活性的影响，筛选出安全浓度丙酮酸。将RAW264.7细胞分组干预：空白对照组加入完全培养基(含体积分数10%胎牛血清、1%双抗的α-MEM培养基)，对照组加入含核因子κB受体活化因子配体的完全培养基，实验组加入核因子κB受体活化因子配体与不同浓度丙酮酸的完全培养基，分别进行抗酒石酸酸性磷酸酶染色、细胞骨架纤维性肌动蛋白染色、RT-qPCR检测、Western blot检测与骨吸收陷窝实验。
结果与结论：①CCK-8检测显示，丙酮酸对RAW264.7细胞的最大半数抑制浓度为8.923 mmol/L，后续实验选择0.1，1，5 mmol/L为安全浓度；②抗酒石酸酸性磷酸酶染色显示，1 mmol/L丙酮酸促进RAW264.7细胞向破骨细胞分化；③细胞骨架纤维性肌动蛋白染色显示，
1 mmol/L丙酮酸促进破骨细胞肌动蛋白环的形成，5 mmol/L丙酮酸不影响破骨细胞分化也不干扰破骨细胞肌动蛋白环的形成；④RT-qPCR检测显示，安全浓度范围内的丙酮酸对破骨分化相关基因核转录因子活化T细胞核因子C1、抗酒石酸酸性磷酸酶的mRNA相对表达量无明显影响；⑤Western blot检测显示，0.1，1 mmol/L丙酮酸对破骨分化相关蛋白核转录因子活化T细胞核因子C1的表达量无明显影响，

5 mmol/L丙酮酸抑制核转录因子活化T细胞核因子C1蛋白的表达，0.1，1，5 mmol/L丙酮酸促进破骨分化相关蛋白c-fos的表达；⑥1 mmol/L丙酮酸促进破骨细胞骨吸收陷窝的形成；⑦结果表明，1 mmol/L丙酮酸在体外对核因子κB受体活化因子配体诱导的RWA264.7细胞向破骨细胞分化具有促进作用。

https://orcid.org/0000-0002-0556-170X(刘官娟)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

关键词: 破骨细胞, 糖酵解, 丙酮酸, 骨代谢, 骨稳态

Abstract: BACKGROUND: Glycolysis is essential for osteoclast differentiation and bone resorption of mature osteoclasts is mainly dependent on glycolysis. Pyruvic acid, as the end product of glycolysis, plays an important role in the metabolism of the three nutrients.
OBJECTIVE: To observe the effect of pyruvic acid on osteoclast differentiation.
METHODS: The toxicity of different concentrations of pyruvic acid (0.1, 1, 10, 20, 30, 50 mmol/L) to RAW264.7 cells was detected by cell counting kit-8 assay, and the safe concentration of pyruvic acid was selected. RAW264.7 cells were grouped into interventions: blank control group was cultured with a complete medium (α-MEM medium containing volume fraction 10% fetal bovine serum and 1% double antibodies); control group was cultured with a complete medium containing nuclear factor κB receptor activating factor ligand, and experimental group was cultured with a complete medium with nuclear factor κB receptor activating factor ligand and different concentrations of pyruvic acid, followed by tartrate-resistant acid phosphatase staining, cytoskeletal F-actin staining, RT-qPCR assay, western blot assay and bone resorption lacuna assay.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The maximum half inhibitory concentration of pyruvic acid on RAW264.7 cells was 8.923 mmol/L, and 0.1, 1, 5 mmol/L were selected as the safe concentrations for subsequent experiments. (2) Tartrate-resistant acid phosphatase staining revealed that 1 mmol/L pyruvic acid promoted the differentiation of RAW264.7 cells into osteoclasts. (3) F-actin staining showed that 1 mmol/L pyruvic acid promoted the formation of osteoclast F-actin ring, while 5 mmol/L pyruvic acid did not interfere with the formation of osteoclast F-actin ring. (4) RT-qPCR assay indicated that pyruvic acid within the safe concentration range had no significant effect on the relative mRNA expression of osteoclast differentiation related genes nuclear factor of activator T-cells and tartrate-resistant acid phosphatase. (5) Western blot assay showed that 0.1 and 1 mmol/L pyruvic acid within the safe concentration range had no significant effect on the protein expression of nuclear factor of activator T-cells, while 5 mmol/L pyruvic acid inhibited the protein expression of nuclear factor of activator T-cells, and 0.1, 1, and 5 mmol/L pyruvic acid promoted the expression of osteoclast differentiation related protein c-Fos. (6) 1 mmol/L pyruvic acid promoted the formation of bone resorption lacunae in osteoclasts. (7) To conclude, 1 mmol/L pyruvic acid can promote the differentiation of receptor activator for nuclear factor-κB induced RAW264.7 cells into osteoclasts in vitro.

Key words: osteoclast, glycolysis, pyruvic acid, bone metabolism, bone homeostasis

中图分类号:

刘官娟, 夏千禧, 宋娜, 霍花, 洪伟, 廖健. 破骨细胞分化过程中丙酮酸的作用[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(31): 5015-5021.

Liu Guanjuan, Xia Qianxi, Song Na, Huo Hua, Hong Wei, Liao Jian. Role of pyruvic acid in osteoclast differentiation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(31): 5015-5021.

图/表（结果） 6

2.1 不同浓度丙酮酸对RAW264.7细胞生存率的影响图1A为CCK-8检测RAW264.7细胞与不同浓度丙酮酸共同培养48 h后的吸光度值，图1B为丙酮酸与RAW264.7细胞作用48 h后的半抑制浓度IC50值，IC50=8.923 mmol/L。

2.2 不同浓度丙酮酸对破骨细胞生成的影响图2为各组RAW264.7细胞经抗酒石酸酸性磷酸酶染色后的镜下观察图片及破骨细胞统计结果，与对照组相比，1 mmol/L丙酮酸组破骨细胞(核≥3个)的数目增多，且破骨细胞面积增大(P < 0.05)；与对照组相比，5 mmol/L丙酮酸组破骨细胞面积减少(P < 0.05)，破骨细胞数目无明显变化(P > 0.05)。

2.3 不同浓度丙酮酸对破骨细胞肌动蛋白环的影响图3为激光共聚焦显微镜观察到的各组破骨细胞肌动蛋白环形态与破骨细胞肌动蛋白环数目统计分析，除空白对照组外，其余各组均观察到环形的肌动蛋白环结构，对照组和5 mmol/L丙酮酸组激动蛋白环形结构大小接近，数目无显著差异，1 mmol/L丙酮酸组环形结构更大，数目更多；与对照组相比，1 mmol/L丙酮酸组肌动蛋白环数目增多(P < 0.05)，5 mmol/L丙酮酸组破骨细胞肌动蛋白环数目无明显变化(P > 0.05)。

2.4 不同浓度丙酮酸对破骨细胞分化相关基因表达的影响上述实验结果显示1 mmol/L丙酮酸可能促进破骨细胞分化，为进一步探讨更低浓度丙酮酸对破骨分化基因表达的影响，通过实时PCR检测破骨细胞分化相关基因的表达。结果显示，与对照组相比，0.1，1，5 mmol/L丙酮酸组NFATC1及抗酒石酸酸性磷酸酶的mRNA相对表达量无明显变化(P > 0.05)，见图4。

2.5 不同浓度丙酮酸对破骨细胞分化相关蛋白表达的影响图5为破骨细胞分化相关蛋白NFATC1和c-fos的相对表达情况，与对照组相比，0.1，1 mmol/L丙酮酸组NFATC1蛋白表达无明显变化(P > 0.05)，5 mmol/L丙酮酸组NFATC1蛋白表达量减少(P < 0.05)， 0.1，1，5 mmol/L丙酮酸组c-fos蛋白表达升高(P < 0.05)。

2.6 丙酮酸对破骨细胞骨吸收功能的影响 Western blot和RT-qPCR检测结果显示，1 mmol/L丙酮酸能提高破骨细胞分化相关蛋白c-fos的相对表达量，故而进一步探讨1 mmol/L丙酮酸对破骨细胞骨吸收功能的影响。与对照组相比，1 mmol/L丙酮酸组骨吸收陷窝数目和面积都增加(P < 0.05)，见图6。

参考文献

[1] SUZUKI A, MINAMIDE M, IWAYA C, et al. Role of Metabolism
in Bone Development and Homeostasis. Int J Mol Sci. 2020;21(23): 8992.
[2] UDAGAWA N, KOIDE M, NAKAMURA M, et al. Osteoclast differentiation by RANKL and OPG signaling pathways. J Bone Miner Metab. 2021; 39(1):19-26.
[3] IKEDA K, TAKESHITA S. The role of osteoclast differentiation and function in skeletal homeostasis. J Biochem. 2016;159(1):1-8.
[4] LEMMA S, SBOARINA M, PORPORATO P E, et al. Energy metabolism in osteoclast formation and activity. Int J Biochem Cell Biol. 2016;79:168-180.
[5] KANAZAWA I. Interaction between bone and glucose metabolism [Review]. Endocr J. 2017;64(11):1043-1053.
[6] PARK-MIN KH. Metabolic reprogramming in osteoclasts. Semin Immunopathol. 2019;41(5):565-572.
[7] KARNER CM, LONG F. Glucose metabolism in bone. Bone. 2018;115: 2-7.
[8] LI B, LEE WC, SONG C, et al. Both aerobic glycolysis and mitochondrial respiration are required for osteoclast differentiation. Faseb J. 2020; 34(8):11058-11067.
[9] 丛林,朱静华.丙酮酸盐的功效和使用[J].田径,2022(2):84.
[10] 李敏,马凌云,陈超阳,等.丙酮酸钠药理学作用的研究现状[J].中国临床药理学杂志,2021,37(3):341-344.
[11] LUO Z, ZENG W, DU G, et al. Enhancement of pyruvic acid production in Candida glabrata by engineering hypoxia-inducible factor 1. Bioresour Technol. 2020;295:122248.
[12] KAO KK, FINK MP. The biochemical basis for the anti-inflammatory and cytoprotective actions of ethyl pyruvate and related compounds. Biochem Pharmacol. 2010;80(2):151-159.
[13] FUKUSHIMA M, LEE SM, MORO N, et al. Metabolic and histologic effects of sodium pyruvate treatment in the rat after cortical contusion injury. J Neurotrauma. 2009;26(7):1095-1110.
[14] INDO Y, TAKESHITA S, ISHII KA, et al. Metabolic regulation of osteoclast differentiation and function. J Bone Miner Res. 2013;28(11): 2392-2399.
[15] 王银博,孙维佳,李玉恒,等.破骨细胞能量代谢的研究进展[J].中国骨质疏松杂志,2022,28(1):139-142.
[16] MOTYL KJ, GUNTUR AR, CARVALHO AL, et al. Energy Metabolism of Bone. Toxicol Pathol. 2017;45(7):887-893.
[17] 张晓丽.谷氨酸与丙酮酸对星形胶质细胞耐受氧化应激的影响[D].福州:福建医科大学,2021.
[18] ZENG X, ZHANG Y, WANG S, et al. Artesunate suppresses RANKL-induced osteoclastogenesis through inhibition of PLCγ1-Ca(2+)-NFATc1 signaling pathway and prevents ovariectomy-induced bone loss. Biochem Pharmacol. 2017;124: 57-68.
[19] ASAGIRI M, SATO K, USAMI T, et al. Autoamplification of NFATc1 expression determines its essential role in bone homeostasis. J Exp Med. 2005;202(9):1261-1269.
[20] CHEN Z, DING M, CHO E, et al. 2-NPPA Mitigates Osteoclastogenesis via Reducing TRAF6-Mediated c-fos Expression. Front Pharmacol. 2020;11:599081.
[21] BAEK JM, KIM JY, LEE CH, et al. Methyl Gallate Inhibits Osteoclast Formation and Function by Suppressing Akt and Btk-PLCγ2-Ca(2+) Signaling and Prevents Lipopolysaccharide-Induced Bone Loss. Int J Mol Sci. 2017;18(3): 581.
[22] ASAGIRI M, TAKAYANAGI H. The molecular understanding of osteoclast differentiation. Bone. 2007;40(2):251264.
[23] 王瀚,曹新生,张舒.破骨细胞体外培养技术[J].中国骨质疏松杂志,2014,20(11):1284-1289.
[24] AHN H, LEE K, KIM JM, et al. Accelerated Lactate Dehydrogenase Activity Potentiates Osteoclastogenesis via NFATc1 Signaling. PLoS One. 2016;11(4):e0153886.
[25] TIEDEMANN K, LE NIHOUANNEN D, FONG JE, et al. Regulation of Osteoclast Growth and Fusion by mTOR/raptor and mTOR/rictor/Akt. Front Cell Dev Biol. 2017;5(18):54.
[26] KOH-BANERJEE PK, FERREIRA MP, GREENWOOD M, et al. Effects of calcium pyruvate supplementation during training on body composition, exercise capacity, and metabolic responses to exercise. Nutrition. 2005;21(3):312-319.
[27] HU S, MA L, LUO HM, et al. Pyruvate is superior to reverse visceral hypoperfusion in peritoneal resuscitation from hemorrhagic shock in rats. Shock. 2014;41(4):355-361.
[28] HIDVéGI M. Inhaled Nebulized Sodium Pyruvate Use in COVID-19 Patients. Isr Med Assoc J. 2020;22(5):278.
[29] 刘翔宇,柴家科,刘甜,等.口服丙酮酸钙盐糖液对重度烧伤大鼠伤后早期氧合脏器功能及生存率的影响[J].解放军医学院学报, 2021,42(8):836-842+856.
[30] LI Y, CHEN J, LUN SY. Biotechnological production of pyruvic acid. Appl Microbiol Biotechnol. 2001;57(4):451-459.
[31] LUO B, ZHOU X, TANG Q, et al. Circadian rhythms affect bone reconstruction by regulating bone energy metabolism. J Transl Med. 2021;19(1):410.
[32] ZHANG HY, TAN XX, KANG K, et al. Simultaneous determination of lactic acid and pyruvic acid in tissue and cell culture media by gas chromatography after in situ derivatization-ultrasound-assisted emulsification microextraction. Anal Bioanal Chem. 2019;411(3):787-795.
[33] KIM JM, JEONG D, KANG HK, et al. Osteoclast precursors display dynamic metabolic shifts toward accelerated glucose metabolism at an early stage of RANKL-stimulated osteoclast differentiation. Cell Physiol Biochem. 2007;20(6):935-946.
[34] 林璐,顾玉婷,陆尔奕.糖酵解与骨代谢关系的研究进展[J].口腔材料器械杂志,2020,29(3):168-172+180.
[35] FONG JE, LE NIHOUANNEN D, TIEDEMANN K, et al. Moderate excess of pyruvate augments osteoclastogenesis. Biol Open. 2013;2(4):387-395.
[36] SONG C, YANG X, LEI Y, et al. Evaluation of efficacy on RANKL induced osteoclast from RAW264.7 cells. J Cell Physiol. 2019;234(7): 11969-11975.
[37] TAKAYANAGI H. RANKL as the master regulator of osteoclast differentiation. J Bone Miner Metab. 2021;39(1):13-18.
[38] KODAMA J, KAITO T. Osteoclast Multinucleation: Review of Current Literature. Int J Mol Sci. 2020;21(16):5685.
[39] TAKAYANAGI H, KIM S, KOGA T, et al. Induction and activation of the transcription factor NFATc1 (NFAT2) integrate RANKL signaling in terminal differentiation of osteoclasts. Dev Cell. 2002;3(6):889-901.
[40] SHI Y. The investigation of energy metabolism in osteoblasts and osteoclasts. Hua Xi Kou Qiang Yi Xue Za Zhi. 2021;39(5):501-509.
[41] JIN Z, KHO J, DAWSON B, et al. Nitric oxide modulates bone anabolism through regulation of osteoblast glycolysis and differentiation. J Clin Invest. 2021;131(5):e138935.
[42] WANG Y, VAN ASSEN A HG, REIS CR, et al. Novel RANKL DE-loop mutants antagonize RANK-mediated osteoclastogenesis. Febs J. 2017; 284(15):2501-2512.
[43] XIXI Z, QIAN P, WANG B. Electrolyzing lactic acid in situ in fermentation broth to produce pyruvic acid in electrolysis cell. Appl Microbiol Biotechnol. 2019;103(10):4045-4052.
[44] GRAY LR, TOMPKINS SC,TAYLOR EB. Regulation of pyruvate metabolism and human disease. Cell Mol Life Sci. 2014;71(14):2577-2604.
[45] ŽIŽKOVá R, HEDVIČáKOVá V, BLAHNOVá VH, et al. The Effect of Osteoblast Isolation Methods from Adult Rats on Osteoclastogenesis in Co-Cultures. Int J Mol Sci. 2022;23(14):7875.

引言

骨稳态需要骨基质的沉积和再吸收的不断转换来维持[1-2]，当骨形成的成骨细胞和骨吸收的破骨细胞之间达到动态平衡时，骨代谢达到平衡。破骨细胞作为具有骨吸收功能的细胞，是由破骨前体细胞相互融合产生的多核巨细胞[2-3]。在破骨前体细胞融合为破骨细胞的过程中，线粒体数量增加，为破骨细胞分化提供能量支持。破骨细胞发挥功能需要大量能量，因此，研究破骨细胞分化过程中的能量代谢有助于对骨代谢性疾病的研究[4]。骨代谢和葡萄糖代谢密切相关[5-6]，葡萄糖代谢在破骨细胞分化过程中发挥重要作用[7-8]。丙酮酸作为糖酵解的终末产物，在三大营养物质的代谢中起重要的枢纽作用[9-10]。丙酮酸不仅是糖代谢的中间产物，参与各种产物的生物合成[11]，还能清除自由基[12]，其抗氧化作用能保护细胞[13]。丙酮酸参与细胞内生存与增殖，若缺乏外源性丙酮酸，细胞会面临氧化应激和能量供给不足的双重风险。糖酵解在破骨细胞分化过程中起关键作用[14-15]，成熟破骨细胞骨吸收主要依赖于糖酵解[16]。外源性丙酮酸绕过糖酵解进入三羧酸循环产生ATP，保护星形胶质细胞免受氧化应激损伤[17]。
核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand，RANKL)在破骨细胞融合过程中起主要作用[18]。c-Fos作为激活蛋白1的转录因子之一，在破骨细胞分化早期发挥关键作用[19]， c-Fos能诱导核转录因子活化T细胞核因子c1(nuclear factor of activator T-cells， NFATc1)的表达，而NFATC1是破骨细胞分化晚期所需的主要转录因子[20]。
RANKL与受体结合后激活下游的核因子κB信号通路，NFATc1最终也被激活，破骨分化相关基因表达增加，促进破骨细胞形成[21]。抗酒石酸酸性磷酸酶和NFATC1是破骨细胞主要标志性基因[22]，抗酒石酸酸性磷酸酶主要存在于破骨细胞中，其反映破骨细胞的活性以及骨吸收能力[23]。在RANKL诱导的破骨细胞分化过程中，乳酸脱氢酶刺激糖酵解和线粒体呼吸代谢，促进成熟破骨细胞形成[24]，而乳酸脱氢酶是催化乳酸和丙酮酸之间氧化还原的重要酶类。研究表明，1 mmol/L丙酮酸能增加破骨细胞的数目和面积[25]。丙酮酸被广泛应用于科学研究，具有较高的安全性[26]。丙酮酸盐在缺氧条件下能增强糖酵解过程中相关酶的活性，从而改善细胞代谢[27]。近年来，新冠病毒侵袭呼吸系统进而导致呼吸系统受损，由于丙酮酸具有抗炎等优势，还有学者建议将丙酮酸盐口服液用于新冠病毒的治疗中[28]。丙酮酸钙盐还能保护脏器功能，提高机体的抗氧化功能[29]，采用生物技术方法生产丙酮酸，还具有成本低等优点[30]。目前，对破骨细胞的研究主要通过诱导的方法来建立体外细胞培养模型，培养方法也在不断改进。由于丙酮酸独特的抗炎、抗氧化、改善能量代谢等功能，使其具有优秀的治疗潜力，研究丙酮酸在破骨细胞分化过程中的作用，有利于加快对破骨细胞的认识，也能为丙酮酸的后续研究及临床治疗提供参考意义。中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞学实验，组间总体比较采用方差分析(One Way ANOVA和Two Way ANOVA)，组间两两比较采用
Dunnett-t和Bronferroni-t检验。
1.2 时间及地点实验于2021年10月至2022年7月在贵州医科大学分子生物学重点实验室完成。
1.3 材料 RAW264.7细胞(ATCC，美国)；胎牛血清、α-MEM及DMEM培养基(Sigma公司)；丙酮酸(阿拉丁)；细胞活性检查试剂盒(Dojindo，日本)；细胞因子RANKL(Peprotech，美国)；抗酒石酸酸性磷酸酶染色液、罗丹明标记的鬼笔环肽(索莱宝，中国)；抗体NFATC1、c-fos、GAPDH、HRP(Abcam，美国)；RNA提取试剂盒(Omega Bio-TeK，美国)；RNA反转录试剂盒(TaKaRa，日本)；小牛骨片(上海千曦生物有限公司，中国)。
1.4 实验方法
1.4.1 细胞培养将RAW264.7细胞从液氮取出后迅速复苏，加入含体积分数10%胎牛血清、1%双抗的高糖DMEM培养基，置于37 ℃、5%湿度、体积分数5%CO2培养箱中培养，隔天换液。倒置相差显微镜下观察细胞形态，当密度生长到80%左右时进行传代培养。
1.4.2 CCK-8筛选丙酮酸安全浓度将纯度为98%的丙酮酸用灭菌三蒸水稀释成浓度为100 mmol/L的储存液，避光放置在-4 ℃冰箱储存备用。将对数生长期的RAW264.7细胞以5 000个/孔的密度接种于96孔上，培养12 h后弃旧培养基，PBS洗2次，分组干预：空白组不含细胞，只含完全培养基(体积分数10%胎牛血清、1%双抗、α-MEM培养基)；对照组加入完全培养基，实验组分别加入含不同浓度(0.1，1，10，20，30，50 mmol/L)丙酮酸的完全培养基。培养48 h后，每孔加CCK-8试剂10 μL，37 ℃避光孵育2 h，酶标仪检测各组吸光度值，计算细胞活力，选择安全范围浓度的丙酮酸进行后续实验。
1.4.3 抗酒石酸酸性磷酸酶染色将RAW264.7细胞按1.5×106 L-1的细胞浓度接种于96孔板内，每孔加100 μL，分组干预：空白对照组加入完全培养基，对照组加入含100 ng/mL RANKL的完全培养基，实验组先后加入含100 ng/mL RANKL与不同浓度(1，5 mmol/L)丙酮酸的完全培养基。培养5 d后，经抗酒石酸酸性磷酸酶染色液染色鉴定，与空白对照组相比，对照组、丙酮酸组细胞体积变大，且可见3个及以上的细胞核。
1.4.4 细胞骨架纤维性肌动蛋白染色在24孔板内提前置入无菌细胞爬片，将RAW264.7细胞以10 000个/孔的密度接种于细胞爬片上，细胞过夜后更换培养基，按1.4.3 分组干预。培养5 d后，镜下观察细胞形态，待大部分细胞变为破骨细胞时停止培养，并用罗丹明标记的鬼笔环肽室温染色30 min，DAPI复染，激光共聚焦显微镜下取红蓝通道观察并拍照。
1.4.5 RT-qPCR检测破骨细胞分化相关基因表达上述实验结果提示，1 mmol/L丙酮酸促进破骨细胞分化，而5 mmol/L丙酮酸对破骨细胞分化无明显影响，为探究更低浓度丙酮酸对破骨细胞分化相关基因是否有促进作用，将RAW264.7细胞按1×106/孔接种于6孔板上，分组干预：空白对照组加入完全培养基，对照组加入含100 ng/mL RANKL的完全培养基，实验组先后加入含100 ng/mL RANKL与不同浓度(0.1，1，5 mmol/L)丙酮酸的完全培养基。

培养48 h后，使用omega试剂盒按说明书提取细胞RNA，测定每个样品浓度，按TaKaRa反转录试剂盒将RAN反转录为cDNA，采用Real Time PCR检测破骨向分化基因NFATC1、抗酒石酸酸性磷酸酶的mRNA相对表达情况。PCR反应条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s；60 ℃退火30 s，重复40个循环。以GAPDH为内参，根据所得Ct值，计算各基因mRNA的相对表达量。PCR引物序列见表1。

1.4.6 Western blot检测破骨细胞分化相关蛋白表达将RAW264.7细胞按1×108 L-1的细胞浓度接种于6孔板，按1.4.5分组干预。培养48 h后，用含1%PMSF的RIPA裂解液裂解细胞，提取细胞总蛋白，取上清，根据BCA蛋白定量试剂盒测定各组蛋白浓度后，根据浓度计算上样量，30 mA恒流电泳2.5 h，200 mA恒流转膜，5%脱脂牛奶封闭2 h，加入一抗NFATC1、c-fos(稀释比为1∶1 000)4 ℃孵育过夜，加入二抗HRP(稀释比为1∶10 000)室温孵育2 h，TBST洗膜3次，用ECL发光显影液显示蛋白条带，Image J分析灰度值。
1.4.7 骨吸收陷窝实验根据Western blot及RT-qPCR检测结果，选择1 mmol/L丙酮酸进行骨吸收陷窝实验。将RAW264.7细胞按1 500个/孔的密度接种于含骨片的96孔板，骨片提前紫外双面照射杀菌。细胞培养过夜后更换完全培养基，空白对照组加入完全培养基，对照组加入含100 ng/mL RANKL的完全培养基，实验组先后加入含100 ng/mL RANKL与1 mmol/L丙酮酸的完全培养基，隔天换液。培养7d后弃培养基，PBS清洗，干燥后于扫描电镜下拍照观察。
1.5 主要观察指标丙酮酸对RAW264.7细胞相破骨细胞分化的影响。
1.6 统计学分析用GraphPad Prism 7.0统计学软件进行统计学分析，计量资料用x±s表示，如果数据满足正态分布及方差齐性，组间总体比较采用方差分析(One Way ANOVA和Two Way ANOVA)，组间两两比较采用Dunnett-t和Bronferroni-t检验；如果数据不满足正态分布及方差齐性，采用秩和检验。检验水准：α=0.05，P < 0.05为差异有显著性意义。该文统计学已经贵州医科大学统计学专家审核。

讨论

能量代谢对骨发育和骨再生有重要意义[31]，丙酮酸是三羧酸循环中的重要代谢物，可反映细胞质氧化还原状态和线粒体呼吸链功能[32]。丙酮酸促进破骨细胞分化主要通过与葡萄糖协同促进细胞氧化供能[33-34]，还能增强线粒体氧化磷酸化[35]。此次实验中，丙酮酸对RAW264.7细胞的最大半数抑制浓度为8.823 mmol/L，所以选用丙酮酸浓度(0.1，1，5 mmol/L)为安全浓度，不影响RAW264.7细胞活性。
抗酒石酸酸性磷酸酶染色是鉴定破骨细胞分化的重要染色方法。此次实验中用于破骨细胞分化的RAW264.7细胞系已被广泛用于骨稳态的研究[36]，常用RANKL诱导破骨细胞，RANKL在破骨细胞分化过程中发挥重要作用[37]，诱导后的破骨细胞体积较大、多核(n≥3)，RANKL诱导后可在光镜下看到多核且外观呈煎蛋样的细胞，而多核不仅增加细胞大小，还是破骨细胞成熟的标志[38]。经抗酒石酸酸性磷酸酶染色后可观察到多核且抗酒石酸酸性磷酸酶阳性的细胞，说明成功将RAW264.7细胞诱导为破骨细胞。1 mmol/L丙酮酸作用后，抗酒石酸酸性磷酸酶阳性细胞数目增加，而5 mmol/L丙酮酸并不增加抗酒石酸酸性磷酸酶阳性数目的表达，说明1 mmol/L丙酮酸可促进破骨细胞的分化。
褶皱缘和封闭区是破骨细胞主要的结构特征，封闭区也称亮区，可包绕骨质并形成围墙，破骨细胞在此区域内释放酸性物质并形成酸性环境，从而促进破骨细胞吸收骨质。与糖酵解相关的酶定位在破骨细胞肌动蛋白环附近，而糖酵解支持骨基质降解的相关活动[4]。骨架蛋白环是破骨细胞发挥功能的重要结构，1 mmol/L丙酮酸促进破骨细胞骨架蛋白环的数目，5 mmol/L丙酮酸并未促进此结构的形成，说明
1 mmol/L丙酮酸可能通过促进破骨细胞骨架蛋白环的形成来促进破骨细胞的分化。
NFATC1和抗酒石酸酸性磷酸酶是调控破骨细胞晚期分化的重要基因，NFATC1是调节和驱动破骨细胞分化的转录因子之一[39]，丙酮酸对NFATC1和抗酒石酸酸性磷酸酶mRNA的相对表达量无明显影响，却增加c-fos的蛋白表达量，而c-fos是破骨细胞分化早期的主要标志物，而说明丙酮酸可能在早期通过促进c-fos的表达从而促进破骨分化。5 mmol/L丙酮酸促进c-fos蛋白的表达，但抗酒石酸酸性磷酸酶实验提示5 mmol/L丙酮酸并不促进破骨细胞分化，这可能是因为从蛋白到表型还需要一系列过程，而此次实验中5 mmol/L丙酮酸并不是促进破骨细胞分化的最佳浓度，在早期可能会促进c-fos蛋白的表达，对最终的破骨分化并无促进作用。
骨吸收陷窝结构是破骨细胞发挥骨吸收功能的独特标志，观察骨吸收陷窝是验证成熟破骨细胞形成的重要方法，陷窝形成的数目多少及面积大小可评价骨吸收功能的强弱。在经RANKL诱导后，通过扫描电镜可观察到大小不一的骨吸收陷窝，而经1 mmol/L丙酮酸作用后，骨吸收陷窝的数目及面积都明显增加，说明1 mmol/L丙酮酸可能通过增加破骨细胞分化从而提高破骨细胞的骨吸收能力。
结论：破骨细胞分化需要糖酵解和线粒体呼吸的参与[8，40]，糖酵解途径可能是调节骨合成代谢的新靶点[41]。丙酮酸对RANKL诱导的NFATC1和抗酒石酸酸性磷酸酶mRNA的相对表达量无明显影响，却促进c-Fos蛋白的表达，而c-fos是破骨细胞分化早期所需的关键转录因子，说明丙酮酸对破骨细胞分化的促进作用可能是在早期通过促进c-Fos的表达来实现的。骨是一种动态组织，健康骨结构来源于破骨细胞和成骨细胞之间的良好平衡[42]。在破骨细胞分化早期，细胞融合需要大量能量，而丙酮酸在此过程中为破骨前体细胞增加能量来源，从而促进破骨细胞分化。随着生产技术的不断提高，丙酮酸的成本也越来越低，越来越多的学者将其用于生物学研究中[43]。丙酮酸作为代谢方面至关重要的分子，了解和利用丙酮酸可能会产生促进人类健康的新疗法[44]。此次实验只探讨了丙酮酸对破骨细胞分化的促进作用可能是通过增加早期蛋白c-fos的表达来实现的，没有对其可能的机制进行探讨，未来还需要更深入研究来探讨丙酮酸在破骨前体细胞向破骨细胞分化过程中的作用，从而为破骨细胞的培养提供新的思路。另外，随着成骨细胞和破骨细胞共培养技术的不断发展，两者共培养更能模拟体内骨组织状态[45]，因此，将丙酮酸用于成骨细胞和破骨细胞共培养也有助于骨科领域的研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

破骨细胞分化过程中丙酮酸的作用

Role of pyruvic acid in osteoclast differentiation

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[1]	党祎, 杜成砚, 姚红林, 袁能华, 曹金, 熊山, 张顶梅, 王信. 激素型骨坏死与氧化应激[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(9): 1469-1476.
[2]	孙佳佳, 朱海迪, 卢赟, 张凯. 髋部骨折合并2型糖尿病和非2型糖尿病患者骨代谢标志物的比较[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(8): 1156-1160.
[3]	黄林科, 韦林华, 蒋捷, 刘倩, 陈蔚蔚. 雌激素与跑台运动干预卵巢切除模型小鼠骨量和关节软骨的变化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(8): 1166-1171.
[4]	杨芷姗, 唐正龙. Hippo信号通路中的核心因子YAP/TAZ参与骨形成的作用与机制[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(8): 1264-1271.
[5]	邵子晨, 李华南, 顾兵, 章晓云, 孙伟康, 刘永钱, 甘斌. 痛风过程中微小RNA、长链非编码RNA和环状RNA介导降尿酸、抗炎及调控骨代谢的协同调节作用[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(5): 765-771.
[6]	张敏, 张晓明, 刘童斌. 柚皮苷在骨组织再生领域的应用潜力[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(5): 787-792.
[7]	沈梦然, 任岩松, 周宇, 岳德波, 马金辉, 王佰亮. 白细胞介素33介导的骨免疫[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(29): 4723-4728.
[8]	韦宗波, 苏允裕, 章晓云, 黄为, 许航, 刘荣发. 长链非编码RNA调控膝骨关节炎中软骨下骨稳态的作用与机制[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(29): 4736-4744.
[9]	刘官娟, 宋娜, 霍花, 罗珊珊, 程余婷, 熊玥, 洪伟, 廖健. 唑来膦酸调控NLRP3信号通路抑制脂多糖诱导的破骨细胞分化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(29): 4677-4683.
[10]	张博文, 李美, 张晋宁, 杨天翔, 程萌旗, 陈德胜. 汉防己甲素诱导自噬抑制破骨细胞的分化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(28): 4473-4479.
[11]	苏辉, 闫炳翰, 王若冲, 薛海鹏, 谭国庆, 徐展望. 补肾壮骨方干预去卵巢骨质疏松模型大鼠骨代谢及骨密度的变化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(28): 4507-4512.
[12]	熊波, 曾平, 刘金富, 陆冠宇, 陈财, 黄悦, 陈莉华. N6-甲基腺苷甲基转移酶样3调控骨代谢及其相关疾病的作用[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(28): 4566-4570.
[13]	宋建辉, 穆继宏, 黎士文. miR-23b对风湿关节炎大鼠滑膜组织转化生长因子β1及破骨细胞的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(26): 4175-4180.
[14]	崔红旺, 王良盛, 温鹏, 孟志斌. 破骨细胞TRPV5通道对体外降解生物珊瑚人工骨的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(21): 3337-3342.
[15]	曹金, 王安素, 黄妮姣, 伍富俊, 陈萍, 李成梅, 王信. 在骨组织再生过程中聚磷酸盐的作用与机制[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(21): 3375-3381.