帕罗西汀干预破骨细胞分化的作用机制

doi:10.12307/2023.534

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (32): 5184-5190.doi: 10.12307/2023.534

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帕罗西汀干预破骨细胞分化的作用机制

莫耀民1，刘槃1，马瑞鑫2，曾高峰3，宗少晖1

1广西医科大学第一附属医院脊柱骨病外科，广西壮族自治区南宁市 530000；广西医科大学，2再生医学与医用生物资源开发应用省部共建协同创新中心，3公共卫生学院，广西壮族自治区南宁市 530000

收稿日期:2022-06-28 接受日期:2022-09-02 出版日期:2023-11-18 发布日期:2023-03-23
通讯作者: 宗少晖，教授，主任医师，博士生导师，广西医科大学第一附属医院脊柱骨病外科，广西壮族自治区南宁市 530000 曾高峰，教授，博士生导师，广西医科大学公共卫生学院，广西壮族自治区南宁市 530000
作者简介:莫耀民，男，1995年生，广西壮族自治区玉林市人，汉族，广西医科大学在读硕士，主要从事脊柱外科学、骨组织工程方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81860402)，项目负责人：宗少晖；广西医学高层次骨干人才培养“139”计划(桂卫科教发[2020]15号)，项目负责人：宗少晖

Mechanism of paroxetine on osteoclast differentiation

Mo Yaomin1, Liu Pan1, Ma Ruixin2, Zeng Gaofeng3, Zong Shaohui1

1Department of Spine Surgery, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 2Collaborative Innovation Centre of Regenerative Medicine and Medical BioResource Development and Application Co-constructed by the Province and Ministry, 3School of Public Health, Guangxi Medical University, Nanning 530000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2022-06-28 Accepted:2022-09-02 Online:2023-11-18 Published:2023-03-23
Contact: Zong Shaohui, Professor, Chief physician, Doctoral supervisor, Department of Spine Surgery, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China Zeng Gaofeng, Professor, Doctoral supervisor, School of Public Health, Guangxi Medical University, Nanning 530000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Mo Yaomin, Master candidate, Department of Spine Surgery, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81860402 (to ZSH); Guangxi Medical High-level Backbone Talents Training "139" Program, No. [2020]15 (to ZSH)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
骨质疏松症：一种全身性代谢性骨病，其特征是骨量减低、骨组织微结构损坏、骨脆性增加，随着病情进展易发生骨质疏松性骨折，严重影响患者生活质量。成骨细胞或破骨细胞功能障碍会导致骨形成与骨吸收失调，导致体内骨稳态失衡，最终导致骨质疏松症的发生、发展，所以在骨质疏松症早期对骨稳态进行调节，可以有效控制病情发展。
帕罗西汀：一种高效的选择性5-羟色胺再摄取抑制剂，可阻断突触前膜对5-羟色胺的再摄取，延长和增加5-羟色胺的作用，从而产生抗抑郁作用。帕罗西汀还能够通过抑制 GRK2活性，进而对体内的细胞增殖、分化及凋亡等许多生理过程起到重要的调节作用。

背景：破骨细胞过度活化是骨质疏松症发生、发展过程中的关键环节，探究破骨细胞功能、开发具有抑制破骨细胞分化减少骨重吸收的药物，是当前探索骨质疏松症临床治疗的重要手段。
目的：基于MAPK/核因子κB信号通路，分析帕罗西汀影响破骨细胞分化的作用机制。
方法：①体外实验：采用CCK-8实验检测不同浓度帕罗西汀对小鼠骨髓源性巨噬细胞增殖的影响。在巨噬细胞集落刺激因子和核因子κB受体活化因子配体的诱导下，使用不同浓度帕罗西汀干预破骨细胞分化，抗酒石酸酸性磷酸酶染色确定破骨细胞数目；RT-qPCR检测帕罗西汀对破骨细胞分化相关细胞因子mRNA表达的影响；Western Blot检测帕罗西汀对小鼠骨髓源性巨噬细胞中核因子κB、MAPK信号通路及破骨细胞相关蛋白表达的影响。②体内实验：将40只C57BL/6小鼠按随机数字表分为空白对照组、脂多糖组、帕罗西汀2 mg/kg，5 mg/kg组，每组10只。脂多糖组、帕罗西汀2 mg/kg，5 mg/kg组每2 d颅骨矢状缝皮下注射脂多糖(构建小鼠颅骨骨溶解模型)，帕罗西汀两组每次皮下注射脂多糖1 d后注射对应剂量的帕罗西汀，14 d后，分离颅骨进行Micro-CT扫描分析。
结果与结论：①体外实验：当帕罗西汀浓度≤5 μmol/L时对小鼠骨髓源性巨噬细胞的增殖无影响，浓度大于10 μmol/L时抑制细胞的增殖；当帕罗西汀浓度≥0.5 μmol/L时，可明显抑制破骨细胞分化的数量及形态，抑制破骨细胞分化c-Fos、Nfatc1、Ctsk、Mmp9、Acp5、Atp6v0d2的mRNA表达水平；0.5 μmol/L的帕罗西汀可通过抑制核因子κB、MAPK信号通路的激活，进而抑制破骨细胞相关蛋白c-Fos、Nfatc1、Ctsk的表达；②体内实验：Micro-CT扫描分析结果显示，与脂多糖组比较，帕罗西汀5 mg/kg组可以有效提高骨小梁数量、骨体积分数(P < 0.05)，降低骨表面积骨体积比、骨小梁分离度(P < 0.05)；③结果表明，帕罗西汀可以通过抑制破骨细胞分化减少骨的重吸收，具有潜在的治疗骨质疏松症作用。
https://orcid.org/0000-0002-8966-4625(莫耀民)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 帕罗西汀, MAPK, 核因子κB, 破骨细胞, 骨质疏松, 骨髓源性巨噬细胞

Abstract: BACKGROUND: Excessive activation of osteoclasts is one of the key links in the occurrence and development of osteoporosis. Exploring the function of osteoclasts and developing drugs that can inhibit osteoclast differentiation and reduce bone resorption is an important means to explore the clinical treatment of osteoporosis.
OBJECTIVE: To analyze the mechanism of paroxetine on osteoclast differentiation based on the mitogen-activated protein kinase/nuclear factor-κB signal pathway.
METHODS: (1) In vitro experiment: Different concentrations of paroxetine were used to interfere with bone marrow-derived macrophages in mice, and then the effect of paroxetine on cell activity was determined by cell counting kit-8. Under the induction of macrophage colony stimulating factor and receptor activator of receptor activator of nuclear factor-κB ligand, different concentrations of paroxetine were used to interfere with osteoclast differentiation. The number of osteoclasts was determined by tartrate-resistant acid phosphatase staining. The effect of paroxetine on the mRNA expression of osteoclast differentiation related cytokines was detected by real-time fluorescence quantitative real-time PCR. The effect of paroxetine on nuclear factor κB and mitogen-activated protein kinase signal pathways in the cells was detected by western blot. (2) In vivo experiment: Forty male C57BL/6 mice were randomly divided into four groups (n=10 per group): blank control group, lipopolysaccharide group, paroxetine 2 mg/kg treatment group, and paroxetine 5 mg/kg treatment group. Lipopolysaccharide was injected subcutaneously into the sagittal suture of the skull every 2 days to construct the mouse skull osteolysis model in the lipopolysaccharide group, paroxetine 2 mg/kg and 5 mg/kg groups. The corresponding dose of paroxetine was injected 1 day after each lipopolysaccharide injection in the two paroxetine groups. After 14 days of treatment, mouse skulls were isolated for Micro-CT scanning.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) In vitro experiment: there was no significant effect on the proliferation of bone marrow-derived macrophages when paroxetine concentration was ≤ 5 μmol/L, while paroxetine concentration > 10 μmol/L could inhibit cell proliferation. When paroxetine concentration was ≥ 0.5 μmol/L, there was a significant reduction in the number and morphology of osteoclast differentiation as well as the mRNA expression of c-Fos, Nfatc1, Ctsk, Mmp9, Acp5, and Atp6v0d2. Paroxetine at a dose of 0.5 μmol/L could inhibit the protein expression of c-Fos, Nfatc1, and Ctsk through activating nuclear factor-κB/mitogen-activated protein kinase signal pathway. (2) In vivo experiment: Micro-CT scanning results showed that compared with lipopolysaccharide, 5 mg/kg paroxetine could significantly increase the number of trabeculae and bone volume fraction and reduce bone surface bone volume ratio and trabecular separation (P < 0.05). (3) To conclude, paroxetine can inhibit bone resorption by reducing osteoclast differentiation and has a potential effect in the treatment of osteoporosis.

Key words: paroxetine, MAPK, nuclear factor κB, osteoclast, osteoporosis, bone marrow-derived macrophage

中图分类号:

莫耀民, 刘槃, 马瑞鑫, 曾高峰, 宗少晖. 帕罗西汀干预破骨细胞分化的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(32): 5184-5190.

Mo Yaomin, Liu Pan, Ma Ruixin, Zeng Gaofeng, Zong Shaohui. Mechanism of paroxetine on osteoclast differentiation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(32): 5184-5190.

图/表（结果） 6

2.1 帕罗西汀对骨髓源性巨噬细胞殖活性的影响帕罗西汀干预24，48 h后，当浓度> 10 μmol/L时，帕罗西汀对骨髓源性巨噬细胞有明显的抑制作用，并呈浓度依赖性(P < 0.05)；在浓度≤5 μmol/L时，帕罗西汀对骨髓源性巨噬细胞无毒性作用(P > 0.05)，见图1。

2.2 帕罗西汀对破骨细胞分化的影响骨髓源性巨噬细胞在含有巨噬细胞集落刺激因子和 RANKL的完全培养基中诱导破骨细胞，同时加入不同浓度的帕罗西汀干预。干预5 d后，抗酒石酸酸性磷酸酶染色显示，0.5 μmol/L及以上浓度的帕罗西汀对破骨细胞分化的数量及形态有明显的抑制作用，见图2。

2.3 帕罗西汀破骨细胞相关基因表达的影响 RT-qPCR检测结果显示，使用0.2 μmol/L帕罗西汀干预后，c-Fos、Ctsk、Acp5、Mmp9、Atp6v0d2的mRNA表达量低于对照组，Nfatc1表达水平无明显变化；当帕罗西汀浓度提高到0.5 μmol/L后，c-Fos、Nfatc1、Ctsk、Acp5、Mmp9、Atp6v0d2的mRNA表达量均明显低于对照组(P < 0.05)，见图3。提示帕罗西汀以剂量依赖方式对破骨细胞分化过程起抑制作用。

2.4 帕罗西汀对破骨细胞相关蛋白表达的影响 Western Blot检测结果显示，RANKL刺激1，3，5 d后，对照组c-Fos、Nfatc1、Ctsk蛋白表达呈时间依赖性；与对照组比较，帕罗西汀组3，5 d的c-Fos、Nfatc1、Ctsk蛋白表达降低(P < 0.05)，见图4。提示帕罗西汀能够抑制Nfatc1及其下游蛋白的表达，从而抑制破骨细胞的形成和功能。

2.5 帕罗西汀对核因子κB、MAPK信号通路相关蛋白表达的影响 Western Blot检测结果显示，在RANKL刺激5，10，20 min时，与对照组相比，帕罗西汀组p-p38/p38比率明显降低(P < 0.05)；在RANKL刺激5，10，20，30 min时，与对照组相比，帕罗西汀组p-ERK1/2/ERK1/2比率明显降低(P < 0.05)；在RANKL刺激5，10，20，30，60 min时，与对照组相比，帕罗西汀组p-p65/p65比率明显降低(P < 0.05)，见图5。提示帕罗西汀有抑制核因子κB、MAPK信号通路激活的作用。

2.6 帕罗西汀对多糖诱导小鼠颅骨骨溶解模型骨丢失的影响 14 d后，通过Micro-CT扫描显示骨丢失情况，脂多糖组>帕罗西汀2 mg/kg组>帕罗西汀5 mg/kg组>空白对照组，见图6A，表明帕罗西汀具有减少脂多糖诱导的颅骨骨丢失的效果。通过Micro-CT对颅骨骨溶解区域进行统计分析，骨小梁数量、骨体积分数大小顺序为：空白对照组>帕罗西汀5 mg/kg组>帕罗西汀2 mg/kg组>脂多糖组，骨表面积骨体积比、骨小梁分离度大小顺序为：脂多糖组>帕罗西汀2 mg/kg组>帕罗西汀5 mg/kg组>空白对照组，见图6B-E，证明帕罗西汀处理组小鼠骨丢失情况受到抑制。

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引言

骨质疏松症是一种常见的的全身性溶骨性骨病，其特征是骨密度减低、骨脆性增加、骨折的风险增加[1-2]。骨质疏松症受到骨形成和骨吸收共同影响，目前常用的治疗方法主要是以抗骨吸收和促骨形成药物治疗以及功能改善为主的对症治疗[3-4]。传统的抗骨质疏松药物虽能一定程度改善骨质疏松性骨缺损患者的基础病情，但是长期使用会产生一定不良反应，例如对骨质疏松性骨折患者来说，长期使用双膦酸盐类药物可能会增加股骨骨折的风险[5]。因此，开发新型抗骨质疏松症药物，在解决骨质疏松患者治疗周期过长、药物不良反应等方面有着重要意义，还可以为骨质疏松症患者提供个体化的精准治疗。
在骨质疏松症的发生发展进程中，破骨细胞是一个不可忽视的因素，目前的研究表明，靶向抑制破骨细胞的活性是逆转骨溶解最直接且有效的治疗措施[6-7]。以往机制研究发现，核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)-核因子κB受体活化因子调节轴在破骨细胞分化过程中起着关键作用，RANKL信号主要通过核因子κB信号通路传递到下游[8]；同时，核因子κB信号通路可以被上游的MAPK信号通路激活，进而参与RANKL诱导的破骨细胞的分化调节[9-10]。
帕罗西汀是一种选择性5-羟色胺再摄取抑制剂[11]，相关研究表明，帕罗西汀可通过抑制核因子κB通路减轻星形胶质细胞中反应性小胶质细胞介导的炎症反应，还可以通过抑制ERK-MAPK通路抑制T细胞的激活和滑膜组织的浸润来保护关节免受炎症和破坏，从而减轻胶原诱导性关节炎大鼠的症状[12-13]。核因子κB与MAPK通路在破骨细胞的分化过程中起着重要作用，为此，推测帕罗西汀可以通过MAPK/核因子κB通路抑制破骨细胞分化减少骨的重吸收，具有治疗骨质疏松症的潜力。此次研究通过体内外实验分析帕罗西汀抑制破骨细胞分化防治骨质疏松症的作用机制，为研究骨质疏松症的治疗提供新的方案。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞实验+随机对照动物实验，两样本均数采用t检验，多样本均数采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2021年3月至2022年3月在广西医科大学完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 41只雄性C57BL/6小鼠，4-6周龄，体质量(20±5) g，SPF级，购自广西医科大学动物实验中心，实验动物生产许可证号：SCXK(桂)2020-0003，在广西医科大学动物实验中心饲养。饲养环境独立通气笼(IVC笼)，温度20-26 ℃，湿度40%-70%，采用昼夜12 h间隔光照，实验期间自由进食饲料和淡水。
动物实验获得广西医科大学实验动物伦理委员会批准。实验过程中，动物的饲养及处理均符合动物伦理学标准。在尽可能优化实验方案以减少动物痛苦的前提下，获得所需的所有实验数据。如果动物遭受的痛苦超过预期，将对动物实施安乐死，以减少疼痛时间。
1.3.2 实验试剂帕罗西汀购自美国MEC公司；α-MEM培养基购自美国Gibco公司；胎牛血清购自美国VWR公司；巨噬细胞集落刺激因子和RANKL购自美国bio-techne公司；TRAP染色试剂购自美国Sigma-Aldrich公司；DNaseI、TRIzol、反转录试剂盒及二抗DyLight800购自美国赛默飞公司；TBGreenPremix 购自日本TaKaRa公司；核因子κB P65、p-核因子κB P65、P38 MAPK、p-P38 MAPK、p44/42 MAPK (ERK1/2)、p-P44/42 MAPK (ERK1/2)、β-actin一抗购自英国Abcam公司；IgG (H+L)二抗购自美国Thermo Fisher公司；脂多糖、0.25%胰酶、CCK-8试剂盒、PBS、青链霉素混合液购自索莱宝公司。
1.4 实验方法
1.4.1 获取和培养骨髓源性巨噬细胞选取C57BL/6小鼠1只，腹腔注射125 mg/kg三溴乙醇麻醉后颈椎脱位法处死，分离胫骨和股骨并去除骨骼周围残留的组织。将胫骨和股骨放入体积分数75%乙醇中浸泡5 min，再用PBS洗掉表面的乙醇。用眼科剪剪去骨骼的两端，用1 mL注射器冲洗出骨髓腔内的骨髓，收集细胞到离心管中并以1 500 r/min离心5 min，去除上清液，用含有巨噬细胞集落刺激因子(50 μg/L)的完全培养基(含α-MEM培养基、1%青链霉素、体积分数10%胎牛血清)重悬细胞，随后种植到T-75培养瓶中，在37 ℃、含体积分数5%CO2的培养箱中培养细胞，每2 d更换一次培养基。培养5 d后，可以将骨髓源性巨噬细胞种植到96孔板或6孔板中，进行下一步实验。
1.4.2 体外实验
帕罗西汀对骨髓源性巨噬细胞增殖-毒性检测：通过CCK-8测定骨髓源性巨噬细胞的活性。将骨髓源性巨噬细胞以(6-8)×103/孔的密度接种在96孔板上，在含有50 μg/L的巨噬细胞集落刺激因子的完全培养基中培养24 h。待24 h细胞贴壁后，用不同浓度(0，2.5，5，10，20 μmol/L)的帕罗西汀干预24，48 h。每孔加入10 μL CCK-8缓冲液并孵育2 h，随后用酶标仪检测每个孔的吸光度值。
帕罗西汀对破骨细胞分化的影响：使用含巨噬细胞集落刺激因子的完全培养基培养骨髓源性巨噬细胞，5 d后，以(6-8)×103/孔的密度种植在96孔板中，再继续培养24 h。待细胞贴壁后更换为含有巨噬细胞集落刺激因子(50 μg/L)和RANKL(100 μg/L)的完全培养基，同时加入不同浓度(0，0.1，0.2，0.5，1 μmol/L)的帕罗西汀进行干预。干预5 d后，去除培养基。用PBS洗涤3次，用多聚甲醛4 ℃固定20 min，固定完成用PBS清洗3次，随后每孔加入100 μL抗酒石酸酸性磷酸酶染液，置于37 ℃温箱内避光孵育30 min。镜下观察到抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性破骨细胞后，去除抗酒石酸酸性磷酸酶染液，使用PBS清洗，显微镜下拍照并计数破骨细胞数量，计数条件为多核细胞且核数目大于3个。

RT-qPCR检测帕罗西汀对破骨细胞相关分化基因表达的影响：将骨髓源性巨噬细胞种植在6孔板上，每孔1×105个细胞。贴壁后给予帕罗西汀(0.2，0.5 μmol/L)干预，对照组加入等体积的PBS，同时每孔加入巨噬细胞集落刺激因子(50 μg/L)和RANKL(100 μg/L)进行刺激，直至对照出现破骨细胞。用Trizol试剂提取细胞总mRNA，应用Biossystems ProFlex Base反转录成cDNA，进行Real-time PCR。RT-qPCR反应周期为95 ℃ 10 min，40个循环(95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s)，最后在72 ℃延伸90 s。以GAPDH为内参基因，用2-ΔΔCT (Livak)方程检测每个标记基因的表达水平。表1为RT-qPCR的引物序列信息。

Western Blot检测帕罗西汀对核因子κB、MAPK信号通路及破骨细胞相关分化蛋白表达的影响：①将骨髓源性巨噬细胞接种于6孔板，每孔1×105个细胞，使用含有巨噬细胞集落刺激因子(50 μg/L)的完全培养基进行刺激，24 h细胞贴壁后，更换成无血清的α-MEM饥饿 3 h；在设定的时间内，帕罗西汀组、对照组分别加入指定剂量的帕罗西汀(0.5 μmol/L)、PBS进行干预；帕罗西汀干预1 h后，两组分别加入RANKL进行刺激，设定相应的时间点，检测核因子κB、MAPK信号通路蛋白表达。②将骨髓源性巨噬细胞接种于6孔板，每孔1×105个细胞，加入含巨噬细胞集落刺激因子(50 μg/L)的完全培养基，帕罗西汀组加入0.5 μmol/L帕罗西汀+RANKL(100 μg/L)，对照组加入PBS+RANKL(100 μg/L)，进行1，3，5 d的刺激，检测破骨细胞相关蛋白c-Fos、Nfatc1、Ctsk的表达。
干预结束后，裂解细胞提取全蛋白，各组蛋白等量上样后进行SDS-PAGE电泳，200 mA恒流转膜120 min，5%BSA室温封闭90 min，4 ℃下孵育一抗12 h，室温避光孵育二抗1 h，TBST漂洗条带后在曝光机上显影。检测核因子κB、MAPK信号通路关键蛋白p65、p-p65、p38、p-p38、ERK1/2、p-ERK1/2及破骨细胞相关蛋白c-Fos、Nfatc1、Ctsk的表达，肌动蛋白(β-actin)作为内参，各抗体按1∶1 000稀释。
1.4.3 体内实验
实验动物分组：将40只C57BL/6雄性小鼠按照随机数字表法分成4组，分别为空白对照组、脂多糖组、帕罗西汀2 mg/kg，5 mg/kg组，每组10只。
脂多糖诱导小鼠颅骨骨溶解模型及分组干预：通过腹腔注射125 mg/kg三溴乙醇麻醉40只小鼠[14]，麻醉后用碘伏消毒头皮，脂多糖组、帕罗西汀2 mg/kg，5mg/kg组在颅骨矢状线皮下注射100 μL脂多糖(5 mg/kg)，空白对照组注射等量无菌生理盐水，在14 d内每隔1 d注射一次脂多糖或无菌生理盐水[15]。每次注射脂多糖1 d后，帕罗西汀2，5 mg/kg组颅骨矢状线皮下分别注入2，5 mg/kg的帕罗西汀，剂量为100 μL，空白对照组、脂多糖组注射等量生理盐水。

Micro-CT扫描：实验第14天，深度麻醉下颈椎脱臼处死小鼠，分离颅骨并去除周围残留的组织，40 g/L多聚甲醛固定后进行Micro-CT(Bruker，Skyscan1275)扫描分析，扫描参数为：扫描精度12 μm，扫描电压50 kV，扫描电流75 μA[16]。

1.5 主要观察指标帕罗西汀对小鼠骨髓源性巨噬细胞增殖及向破骨细胞分化的影响，以及帕罗西汀对小鼠颅骨骨溶解的作用。
1.6 统计学分析实验数据均使用x±s表示，采用SPSS 25.0软件进行数据分析，多样本均数采用单因素方差分析，LSD检验进行组间比较，P < 0.05时表示差异有显著性意义。该文统计学方法已经广西医科大学生物统计学专家审核。

讨论

在骨质疏松症发展过程中，骨质疏松性骨折是最常见、最严重的并发症[17]。对于骨折患者来说，手术是目前较为有效的治疗措施，但是并不能较好地改善骨质疏松症患者的基础病情[18]，所以在骨质疏松症的防治过程中早期干预尤为重要，可以有效减缓病情的进展，避免严重并发症的发生[19]。破骨细胞的过度激活在骨质疏松症的发生发展进程中起着关键作用[20]。因此，抑制破骨细胞的分化和活性、减少骨重吸收已成为治疗骨质疏松症的主要方向[21]。此次研究结果表明，帕罗西汀可以通过MAPK和核因子κB信号通路下调c-Fos-Nfatc1轴的表达水平，从而抑制RANKL诱导的破骨细胞活性及分化能力，起到抑制骨重吸收的作用，且疗效随剂量升高而增强。
此次研究在CCK-8实验结果的基础上采用抗酒石酸酸性磷酸酶染色检测破骨细胞的分化能力，结果发现帕罗西汀能显著抑制破骨前体细胞融合，减少破骨细胞数目，降低破骨细胞分化能力。破骨细胞是骨质疏松症发展过程中的重要角色，受到不同信号调节[22]。Nfatc1是调控破骨细胞形成的重要转录因子，可以在RANKL的刺激下去磷酸化后进入细胞核，进而调节相关破骨细胞基因的表达[23]。c-Fos是另一个参与破骨细胞分化的主要转录因子，在激活蛋白1的情况下与Nfatc1起协同作用[24]。此次研究中，帕罗西汀在蛋白和mRNA水平上降低了c-Fos和Nfatc1的表达，但抑制c-Fos和Nfatc1的相关机制仍不清楚，可能是直接抑制了c-Fos、Nfatc1的激活，或是通过干扰上游MAPK信号通路间接起到抑制效果。MAPK通路是机体调控破骨细胞增殖及分化的重要信号通路，可以通过调控c-Fos-Nfatc1轴来参与RANKL诱导的破骨细胞的分化，增强其骨吸收能力[25]。MAPK通路包含4个主要的激活通路：p38-MAPKs(α/β/γ/δ)、胞外信号调节激酶(ERK1/2)、c-Jun N末端激酶(JNK1、2、3)、ERK5[26-27]。
c-Fos和Nfatc1被MAPK信号激活后，可以进一步激活与破骨细胞分化相关的基因，包括TRACP(Acp5)、Mmp9、Atp6v0d2、Ctsk等[28-29]，其中ERK1/2和p38-MAPK通路在调节c-Fos和Nfatc1的表达中扮演主要角色，在骨稳态中起重要作用[30]。磷酸化的ERK1/2和p38通过上调c-Fos-Nfatc1轴的下游表达水平，导致RANKL诱导的破骨细胞的分化[31]。此次研究Western Blot检测显示，与对照组相比，帕罗西汀可以抑制ERK1/2和p38的磷酸化水平；RT-qPCR分析显示，帕罗西汀可抑制c-Fos、Nfatc1、TRACP(Acp5)、Mmp9、Atp6v0d2、Ctsk等基因的相对表达水平。因此，帕罗西汀可能通过抑制MAPK通路下调c-Fos-Nfatc1轴的表达水平，从而抑制破骨细胞的分化和功能。
核因子κB信号通路是诱导破骨细胞分化的经典途径，也是治疗骨质疏松症等溶骨性骨病的关键通路[32-33]。RANKL和巨噬细胞集落刺激因子是诱导破骨细胞成熟的2个关键因素[34]。RANKL结合核因子κB受体活化因子后，肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)被激活，并依次磷酸化IκB激酶和IκB-α，导致p65进入细胞核激活核因子κB通路，进而激活破骨细胞的相关基因，这些基因对破骨细胞的分化及其功能起着关键性作用[35]。此次研究Western Blot检测显示，与对照组相比，帕罗西汀组破骨细胞中p65的蛋白表达水平下降。因此，帕罗西汀通过降低核因子κB通路的表达来抑制破骨细胞分化。
根据帕罗西汀在体外对破骨细胞形成和功能的抑制作用，此次研究通过对小鼠颅骨局部注射脂多糖活化破骨细胞并促使其增殖，导致小鼠颅骨骨量丢失，构建小鼠颅骨骨溶解模型[36]，以证实帕罗西汀在体内的治疗潜力。Micro-CT扫描结果表明，帕罗西汀治疗组小鼠的骨小梁数目与骨体积分数提高、骨小梁分离度与骨表面积骨体积比降低，提示帕罗西汀能够在体内起到减少骨丢失、改善骨质疏松症状的作用。
目前最新的研究发现，GRK2可以参与MAPK激活级联反应，而帕罗西汀可以抑制GRK2的活性和表达水平[37-38]。为此有研究利用可诱导的软骨细胞特异性GRK2基因敲除小鼠和外科内侧半月板失稳模型，研究了GRK2在软骨细胞肥大和骨关节炎软骨退变中的作用，并通过帕罗西汀抑制GRK2的表达对骨关节炎小鼠起到治疗效果[15]。以上研究表明帕罗西汀与GRK2-MAPK通路相关，但是帕罗西汀是直接影响MAPK通路还是抑制GRK2的活性和表达水平，从而间接影响MAPK信号通路，目前尚不清楚。
骨形成和骨吸收过程在体内处于一种动态平衡，该状态受到多种细胞和因子的调节，其中由骨髓间充质干细胞分化而来的成骨细胞是新骨形成过程的关键[39]。成骨细胞不仅参与了骨形成过程，还和激活的免疫T细胞共同分泌RANKL，激活破骨细胞的细胞质适配器蛋白(如TRAF6)，从而促进骨吸收，对于维持人体的骨稳态平衡至关重要[40]。而帕罗西汀是否作用于成骨细胞尚不清楚，需进行后续的深入
研究。
综上所述，帕罗西汀可以通过MAPK和核因子κB信号通路抑制破骨细胞分化，减少骨的重吸收。因此，帕罗西汀类药物的研究对于治疗骨质疏松症等骨骼疾病具有重要意义。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

帕罗西汀干预破骨细胞分化的作用机制

Mechanism of paroxetine on osteoclast differentiation

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