酪蛋白激酶2相互作用蛋白1调控骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞的成骨能力

doi:10.12307/2023.249

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (6): 878-882.doi: 10.12307/2023.249

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酪蛋白激酶2相互作用蛋白1调控骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞的成骨能力

龙燕鸣1，谢梦生2，3，黄加洁2，3，薛文利2，3，荣慧2，3，李晓捷2，3

1广西壮族自治区人民医院口腔科，广西壮族自治区南宁市 530021；2广西医科大学口腔医学院，广西壮族自治区南宁市 530021；3广西口腔颌面修复与重建研究自治区级重点实验室，广西壮族自治区南宁市 530021

收稿日期:2022-01-04 接受日期:2022-04-18 出版日期:2023-02-28 发布日期:2022-08-09
通讯作者: 李晓捷，主任医师，硕士生导师，广西医科大学口腔医学院，广西壮族自治区南宁市 530021；广西口腔颌面修复与重建研究自治区级重点实验室，广西壮族自治区南宁市 530021
作者简介:龙燕鸣，女，1991年生，汉族，2019年广西医科大学毕业，硕士，主要从事口腔修复方面的研究。
基金资助:
广西自然科学基金(2019GXNSFAA245085)，项目负责人：李晓捷

Casein kinase 2-interaction protein-1 regulates the osteogenic ability of bone marrow mesenchymal stem cells in osteoporosis rats

Long Yanming1, Xie Mengsheng2, 3, Huang Jiajie2, 3, Xue Wenli2, 3, Rong Hui2, 3, Li Xiaojie2, 3

1Department of Stomatology, People’s Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 2College of Stomatology, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 3Guangxi Key Laboratory of Oral and Maxillofacial Rehabilitation and Reconstruction, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2022-01-04 Accepted:2022-04-18 Online:2023-02-28 Published:2022-08-09
Contact: Li Xiaojie, Chief physician, Master’s supervisor, College of Stomatology, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; Guangxi Key Laboratory of Oral and Maxillofacial Rehabilitation and Reconstruction, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Long Yanming, Master, Department of Stomatology, People’s Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Guangxi Zhuang Autonomous Region, No. 2019GXNSFAA245085 (to LXJ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
CKIP-1：酪蛋白激酶2相互作用蛋白1(casein kinase 2-interaction protein-1，CKIP-1)基因参与了多种蛋白质-蛋白质的相互作用，是骨形成的负调控因子。
靶向基因干扰技术：是一种同源mRNA高效特异性降解现象，其可以特异性调控蛋白表达，从而达到靶向治疗目的的转录后基因沉默技术。

背景：目前对酪蛋白激酶2相互作用蛋白1(casein kinase 2-interaction protein-1，CKIP-1)分子机制的体外研究主要集中在基因敲除小鼠来源成骨细胞或骨髓间充质干细胞，鲜见报道骨质疏松模型大鼠来源骨髓间充质干细胞中CKIP-1表达的研究。
目的：探讨下调CKIP-1基因前后骨质疏松状态骨髓间充质干细胞成骨分化能力的变化。
方法：用维甲酸诱导雌性SD大鼠骨质疏松模型，采用全骨髓贴壁法体外培养骨质疏松组、正常组大鼠骨髓间充质干细胞。成骨诱导后进行茜素红染色、碱性磷酸酶染色及实时定量RT-PCR检测骨桥蛋白、Runx2 mRNA的相对表达，实时定量RT-PCR检测成骨诱导过程中2组细胞中CKIP-1的动态表达；通过基因转染沉默CKIP-1基因，成骨诱导后进行茜素红染色、碱性磷酸酶染色及实时定量RT-PCR检测骨桥蛋白、Runx2 mRNA的相对表达。
结果与结论：①与正常组相比，骨质疏松组骨髓间充质干细胞茜素红染色钙结节定量、碱性磷酸酶活性及骨桥蛋白、Runx2的mRNA水平降低(P < 0.05)，骨质疏松组骨髓间充质干细胞中CKIP-1基因动态表达水平总体偏高；②与未下调CKIP-1的骨质疏松组骨髓间充质干细胞相比，下调CKIP-1基因表达后，骨质疏松组骨髓间充质干细胞茜素红染色钙结节定量、碱性磷酸酶活性及骨桥蛋白、Runx2的mRNA水平明显升高(P < 0.05)；③结果表明，维甲酸诱导的骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞成骨能力降低，下调CKIP-1基因可以部分提高其成骨分化能力。

https://orcid.org/0000-0002-9064-0882 (李晓捷)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 大鼠, 维甲酸, CKIP-1, 骨质疏松, 骨髓间充质干细胞, 成骨分化

Abstract: BACKGROUND: At present, in vitro studies on the molecular mechanism of casein kinase 2-interaction protein-1 (CKIP-1) mainly focus on gene knockout mouse-derived osteoblasts or bone marrow mesenchymal stem cells. There are few reports focusing on the expression of CKIP-1 in bone marrow mesenchymal stem cells derived from osteoporosis model rats.
OBJECTIVE: To investigate the changes in osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells before and after down-regulation of CKIP-1 gene.
METHODS: An osteoporotic rat model was induced by retinoic acid gavage. The bone marrow mesenchymal stem cells of the osteoporosis group and the normal group were cultured in vitro by the whole bone marrow adherence method. After osteogenic induction, Alizarin red staining, alkaline phosphatase staining and real-time quantitative RT-PCR were utilized to detect the relative expression of osteopontin and Runx2 mRNA. The dynamic expression of CKIP-1 in the two groups of cells was detected by using real-time quantitative RT-PCR. CKIP-1 gene was silenced by gene transfection. After osteogenic induction, alizarin red staining, alkaline phosphatase staining, and real-time quantitative RT-PCR were performed to detect the relative expression of osteopontin and Runx2 mRNA.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with the normal group, alizarin red staining of calcium nodules, alkaline phosphatase activity and mRNA levels of osteopontin and Runx2 in bone marrow mesenchymal stem cells decreased in the osteoporosis group (P < 0.05). The dynamic expression level of CKIP-1 gene in bone marrow mesenchymal stem cells was generally higher in the osteoporosis group. (2) Compared with bone marrow mesenchymal stem cells of osteoporosis group without down-regulation of CKIP-1, after down-regulation of CKIP-1 gene expression, the quantification of calcium nodules and alkaline phosphatase activity by alizarin red staining, mRNA levels of osteopontin and Runx2 were significantly increased in bone marrow mesenchymal stem cells of the osteoporosis group (P < 0.05). (3) Therefore, osteogenic ability of bone marrow mesenchymal stem cells in rats with retinoic acid-induced osteoporosis is reduced and down-regulation of CKIP-1 gene can partially improve their osteogenic differentiation ability.

Key words: rat, retinoic acid, CKIP-1, osteoporosis, bone marrow mesenchymal stem cell, osteogenic differentiation

中图分类号:

龙燕鸣, 谢梦生, 黄加洁, 薛文利, 荣慧, 李晓捷. 酪蛋白激酶2相互作用蛋白1调控骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞的成骨能力[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 878-882.

Long Yanming, Xie Mengsheng, Huang Jiajie, Xue Wenli, Rong Hui, Li Xiaojie. Casein kinase 2-interaction protein-1 regulates the osteogenic ability of bone marrow mesenchymal stem cells in osteoporosis rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(6): 878-882.

图/表（结果） 3

2.1 骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞成骨能力受损茜素红染色结果显示骨质疏松组骨髓间充质干细胞染色较正常组浅，钙结节定量结果亦低于正常组，见图1A，B；碱性磷酸酶染色结果显示骨质疏松组骨髓间充质干细胞染色较正常组浅，碱性磷酸酶活性检测亦支持这一结果，见图1A，C。RT-PCR检测结果显示骨质疏松组骨髓间充质干细胞的骨桥蛋白、Runx2的mRNA相对水平均低于正常组，骨桥蛋白mRNA表达约为正常组的9%，Runx2 mRNA表达则为正常组的35%，差异有显著性意义(P < 0.01)，见图1D。

2.2 CKIP-1在骨髓间充质干细胞成骨过程中的变化 RT-PCR检测2组骨髓间充质干细胞成骨诱导前(第0天)CKIP-1 mRNA的相对表达，结果显示骨质疏松组骨髓间充质干细胞的CKIP-1 mRNA表达水平是正常组的4.4倍；RT-PCR检测2组骨髓间充质干细胞成骨分化过程中CKIP-1 mRNA的表达整体趋势增高，在第10天2组骨髓间充质干细胞的CKIP-1 mRNA表达差别最大；骨质疏松组骨髓间充质干细胞的CKIP-1 mRNA表达水平总体高于正常组，见图2。

2.3 下调CKIP-1的表达促进骨髓间充质干细胞成骨分化为了检测CKIP-1是否能增强成骨功能受损的骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化能力，将骨质疏松组骨髓间充质干细胞中CKIP-1基因沉默，成骨诱导21 d，茜素红染色及定量结果显示：相比骨质疏松+空载组，沉默CKIP-1能增加钙结节的形成，见图3A，B；成骨诱导14 d 后，碱性磷酸酶染色及活性定量均显示：骨质疏松+沉默组块状深染颗粒比骨质疏松+空载组染色深，且基本接近正常+空载组，图3C，D；成骨诱导10 d，RT-PCR检测骨桥蛋白、Runx2 mRNA相对表达，结果显示，与骨质疏松+空载组相比，骨质疏松+沉默组的骨桥蛋白、Runx2 mRNA表达显著性增高，差异有显著性意义(P < 0.05，P < 0.01)，见图3E。

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引言

材料方法

1.1 设计基因调控骨质疏松状态下骨髓间充质干细胞成骨分化实验。
1.2 时间及地点实验于2017年7月至2019年3月在广西医科大学附属口腔医院科研实验中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 6只清洁级雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠，12周龄，体质量(289±33) g，由广西医科大学医学实验动物中心提供。实验方案经广西医科大学动物实验伦理委员会批准。
1.3.2 实验用主要试剂和仪器靶向干扰CKIP-1基因的慢病毒、空载基因慢病毒(苏州吉玛基因)；BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；实时荧光定量PCR检测试剂盒(TAKARA公司，中国大连)；TRIzol裂解液、反转录试剂盒(TAKARA公司，中国大连)；BX53型正置显微镜(OLYMPUS公司，日本)；维甲酸粉剂(陕西森弗生物技术有限公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 茜素红染色骨质疏松模型验证和细胞培养在之前文章中已论述[5]，实验分正常组和骨质疏松组，骨质疏松组用维甲酸70 mg/(kg•d)连续灌胃2周，正常组灌以等体积生理盐水，骨质疏松模型成功后，用全骨髓贴壁法培养2组大鼠骨髓间充质干细胞，取生长良好的传3代骨髓间充质干细胞，以1×105个/孔种于6孔板，各设置3个副孔，待细胞融合至80%时，将培养液更换为成骨诱导液(含体积分数为10%胎牛血清、1%青链霉素双抗、100 nmol/L地塞米松、50 μmol/L抗坏血酸、10 mmol/L β-甘油磷酸钠的DMEM/F12培养基)，隔天换液，诱导21 d后进行茜素红染色，显微镜下观察并拍照，利用ImageJ 1.8.0软件测量钙结节面积。
1.4.2 碱性磷酸酶染色取生长良好的传3代骨髓间充质干细胞，以1×105个/孔接种于6孔板，待细胞融合至80%时，将培养液更换为成骨诱导液，诱导14 d时各取3个副孔进行碱性磷酸酶染色(根据试剂盒步骤操作)，显微镜下观察并拍照。
1.4.3 慢病毒转染沉默CKIP-1 转染骨质疏松组大鼠骨髓间充质干细胞用于细胞实验。实验分组：骨质疏松+空载组(空慢病毒载体转染骨质疏松组大鼠骨髓间充质干细胞)，骨质疏松+沉默组(含CKIP-1基因干扰片段的慢病毒载体转染骨质疏松组大鼠骨髓间充质干细胞)，正常+空载组(空慢病毒载体转染正常组大鼠骨髓间充质干细胞)。目的基因CKIP-1沉默序列：5'-CCT GAG TGA CTA TGA GAA G-3' (由苏州吉玛基因公司设计)。取生长良好的传3代骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞，以1×105个/孔接种于6孔板，每孔加1 mL培养液；24 h细胞贴壁30%-50%后，更换为预混好的病毒感染液(含 40 μL病毒上清液、0.96 mL新鲜培养液、1 μL polybrene)加入到目的细胞培养孔中(polybrene终质量浓度 5-10 mg/L)，培养24 h后更换成含嘌呤霉素(嘌呤霉素杀灭曲线实验所得的最佳药物质量浓度为1 mg/L)的培养液培养 48 h。根据CKIP-1动态表达曲线选择最佳成骨诱导时间，将培养液换为成骨诱导液，成骨诱导10 d后收集细胞。

1.4.4 RNA分离及RT-PCR检测成骨诱导10 d后收集各组细胞，PBS清洗3遍，遵循Trizol提取试剂盒操作指南提取RNA，首先每孔加入1 mL Trizol，静置5 min，反复抽吸使细胞完全溶解，转入已灭菌的1.5 mL EP管中；每管加入200 μL氯仿，振荡30 s，充分混匀后室温静置5 min；4 ℃，12 000 r/min离心15 min，将上层透明液体吸入新的EP管；每个装有上层透明液体的EP管中加入500 μL异丙醇，充分混匀，室温静置15 min；4 ℃，12 000 r/min离心10 min，可见管底有少许白色沉淀；倒去上清液，每管加入1 mL体积分数为75%乙醇，上下颠倒使沉淀充分清洗，4 ℃，7 500 r/min继续离心5 min；弃上清，将EP管倒置于事先准备好的滤纸上，使沉淀干燥10 min左右，用适量DEPC无酶水溶解沉淀；Nanodrop调零，然后检测各样品的纯度和浓度，计算反转录所需样品的量，取适量样品根据TaKaRa反转录试剂盒的具体步骤将样本的RNA反转录合成cDNA，进行Real-time PCR反应。根据Genbank查询得到内参β-actin、CKIP-1、Runx2、骨桥蛋白等引物序列，由TAKARA公司设计，合成引物。以β-actin为内参，检测各基因相对表达，见表1。

1.5 主要观察指标观察沉默CKIP-1基因前后骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞成骨能力的变化，包括体外矿化能力、碱性磷酸酶分泌能力、骨桥蛋白和Runx2成骨相关基因表达。
1.6 统计学分析使用SPSS 22.0统计软件处理各组数据，数据用x±s表示。对统计结果进行两样本t检验，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过广西壮族自治区人民医院生物统计学专家审核。

讨论

目前主要是药物治疗骨质疏松症，双膦酸盐类可抑制骨吸收，但存在毒副作用，可引起胃肠道和皮肤病变反应，甚至导致下颌骨坏死[6-7] 。甲状旁腺激素同时促进骨形成和骨吸收过程，长期应用可造成骨吸收[8-9] 。近年来，基因靶向治疗成为骨质疏松症治疗热点。RNA干扰技术可特异性调控蛋白表达从而达到靶向治疗目的的转录后基因沉默技术，是由小干扰RNA(siRNA)诱导的高度保守的同源mRNA高效特异性降解的现象[10]。目前，RNA干扰技术已被应用于不同疾病的治疗，包括骨质疏松症[11-12]。目前已有研究者采用RNA干扰技术下调破骨细胞生成相关基因来减少骨吸收，如RANK[13]。BUCKBINDER等[14]通过RNA干扰技术干扰骨负调节基因酪氨酸激酶2(PYK2)Dev表达来增加骨形成。因此，理论上通过沉默骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的负调节因子可成为骨质疏松治疗的潜在作用靶点。

根据以往研究报道，CKIP-1通过调节经典Smad依赖性BMP信号通路，促进Smurf1介导的Smad1/5泛素化作用，进而促进骨形成[15] 。在该研究中，在骨质疏松组骨髓间充质干细胞中观察到表达增高的CKIP-1基因，并且在成骨诱导过程中CKIP-1整体表达上升，说明CKIP-1负调控干细胞的成骨分化，具体机制有待进一步研究。对比两组细胞的成骨分化能力，发现骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞矿化能力、碱性磷酸酶分泌、骨桥蛋白和Runx2相对表达水平均低于正常组大鼠骨髓间充质干细胞，而碱性磷酸酶、骨桥蛋白、Runx2是成骨相关标志分子[16-17] 。结合上述研究结果，可以推测骨质疏松组骨髓间充质干细胞成骨能力降低可能与CKIP-1基因表达上升有关，具体机制仍有待进一步研究。

骨髓间充质干细胞可以向成骨细胞分化，为了验证下调CKIP-1是否可以促进骨髓间充质干细胞成骨过程，该实验采用慢病毒转染沉默骨质疏松组骨髓间充质干细胞中CKIP-1的表达，据以往研究，CKIP-1是一种骨负调控因子，基因敲除CKIP-1可显著促进骨形成而不影响骨吸收，从而防止骨量丢失[18-19]。该实验在体外骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞中下调CKIP-1基因，结果证实下调CKIP-1可增强骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化能力，其细胞矿化、碱性磷酸酶分泌、骨桥蛋白和Runx2相对表达水平均明显高于骨质疏松+空载组，但仍低于正常+空载组，与ZHOU等[20]结果相似，这说明沉默CKIP-1基因可部分提高骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化能力。目前研究者普遍认为CKIP-1可以通过与 Smurf1 结合进而增强其泛素化活性，促进Smad降解，使BMP-Smad介导的骨形成通路受到抑制[21]。LU等[4]通过特异性干扰CKIP-1基因表达，解除了这种抑制作用从而促进骨形成。但GUO等[22]却认为沉默CKIP-1基因后，大鼠下颌骨牵张成骨过程中的骨形成似乎是通过Wnt/β-连环蛋白信号通路介导。在后续的实验研究中，有待进一步研究CKIP-1调节骨形成的可能机制通路。

该实验存在一些局限性，未来仍需开展进一步的研究：第一，动物模型不能代表真实情况，与经典的去势大鼠骨质疏松模型相比，维甲酸诱导的骨质疏松模型有其特有的优点，就是构建时间短，维甲酸处理2周即可出现明显的骨质疏松，具有操作简单、造模时间短、骨质疏松典型等优点；其缺点是模型可逆，停用维甲酸后骨质疏松状态可逐渐恢复[23]。该实验研究了维甲酸诱导的骨质疏松模型大鼠的骨髓间充质干细胞，其细胞矿化、碱性磷酸酶活力与成骨相关因子均降低，其体外特征与人和去势大鼠骨质疏松模型来源骨髓间充质干细胞相似[24-25]，证明该模型可用于骨质疏松相关的研究；第二，下调CKIP-1后的骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞成骨能力的变化仍需进行蛋白方面的实验证明；第三，需要动物活体实验进一步证明；第四，CKIP-1调节骨髓间充质干细胞成骨分化的具体机制通路仍需要进一步研究。

综上所述，该研究通过下调CKIP-1基因部分提高了骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化，但其具体调节机制仍需进一步研究。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

酪蛋白激酶2相互作用蛋白1调控骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞的成骨能力

Casein kinase 2-interaction protein-1 regulates the osteogenic ability of bone marrow mesenchymal stem cells in osteoporosis rats

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