2.1   实验动物数量分析   实验共选用24只SD大鼠，分为3组，实验过程中大鼠均无死亡。
2.2   血清骨代谢指标比较   如表2所示，与青年对照组大鼠比较，老年模型组大鼠血清中骨源性碱性磷酸酶和Ⅰ型前胶原N-端前肽水平降低，而抗酒石酸酸性磷酸酶和Ⅰ型胶原交联N-末端肽水平升高，差异有显著性意义(P < 0.05)；与老年模型组相比较，运动训练组大鼠血清中骨源性碱性磷酸酶和Ⅰ型前胶原N-端前肽水平升高，而抗酒石酸酸性磷酸酶和Ⅰ型胶原交联N-末端肽水平降低，差异有显著性意义(P < 0.05)。



2.3   骨密度的比较    如表3所示，与青年对照组大鼠比较，老年模型组大鼠股骨和第4腰椎的骨密度下降，差异有显著性意义(P < 0.05)；经运动干预后，运动训练组大鼠股骨骨密度高于老年模型组，差异有显著性意义(P < 0.05)；而运动训练组大鼠第4腰椎骨密度高于老年模型组，但差异无显著性意义(P > 0.05)。



2.4    骨微结构的变化    Micro-CT对3组大鼠胫骨和第5腰椎骨微结构进行检测，并对其中显微结果参数进行分析。如表4所示，老年模型组大鼠胫骨的骨体积分数、骨小梁数量均低于青年对照组，骨小梁间隙均高于青年对照组，运动训练组大鼠胫骨的骨体积分数、骨小梁数量均高于老年模型组，骨小梁间隙低于老年模型组，以上差异均有显著性意义(P < 0.05)。与青年对照组比较，老年模型组大鼠胫骨的骨小梁厚度差异无显著性意义(P > 0.05)；与老年模型组比较，运动训练组大鼠胫骨的骨小梁厚度差异无显著性意义(P > 0.05)。

如表5所示，老年模型组大鼠第5腰椎的骨体积分数、骨小梁数量、骨小梁厚度均低于青年对照组，骨小梁间隙均高于青年对照组，运动训练组大鼠第5腰椎的骨小梁间隙低于老年模型组，以上差异均有显著性意义(P < 0.05)，运动训练组大鼠第5腰椎的骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数量均高于老年模型组，但差异无显著性意义(P > 0.05)。

MicroCT扫描结果显示，与青年对照组相比，老年模型组大鼠骨小梁组织断裂明显，结构紊乱，骨髓腔内空洞较多；与老年模型组相比，运动训练组骨小梁数量变多，厚度变厚，组织完整，排列整齐，见图1，图2。







2.5   BMP2、Runx2、Osterix和PPARγ mRNA表达比较    如图3所示，与青年对照组大鼠相比较，老年模型组大鼠BMP2、Runx2与Osterix mRNA表达均减少，差异有显著性意义(P < 0.05)；而经过运动训练后，运动训练组老年大鼠BMP2、Runx2与Osterix mRNA表达均增加，差异有显著性意义(P < 0.05)；相反，与青年对照组大鼠相比较，老年模型组大鼠PPARγ mRNA表达增加，差异有显著性意义(P < 0.05)；而经过运动训练后，运动训练组老年大鼠PPARγ mRNA表达减少，差异有显著性意义(P < 0.05)。



2.6    BMP2、Runx2、Osterix和PPARγ蛋白表达水平    如图4所示，各组大鼠BMP2、Runx2、Osterix 、PPARγ 蛋白表达的趋势与mRNA表达一致。与青年对照组大鼠相比较，老年模型组大鼠BMP2、Runx2与Osterix表达均减少，差异有显著性意义(P < 0.05)；而经过运动训练后，运动训练组大鼠BMP2、Runx2与Osterix表达均增加，差异有显著性意义(P < 0.05)；相反，与青年对照组大鼠相比较，老年模型组大鼠PPARγ表达增加，差异有显著性意义(P < 0.05)；而经过运动训练后，运动训练组大鼠PPARγ表达均减少，差异有显著性意义(P < 0.05)。

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骨质疏松症是一种以骨量减低、骨组织微结构损坏、骨脆性增加、易发生骨折为特征的全身性骨骼疾病[1]，与增龄密切相关[2]。老年骨质疏松症以65岁以上女性和70岁以上男性人群较多见，容易合并髋部和腰椎骨折[3]。随着中国人口老龄化加剧，老年骨质疏松症及相关骨折已成为重要的公共卫生问题[4-6]。运动训练有维持骨量、改善骨密度等作用[7-8]，可以预防和治疗骨质疏松[9-10]，在临床被广大医生所接受[11-12]，但是，运动治疗的作用机制尚未完全明确。

在正常状态下，成骨细胞和破骨细胞通过“偶联”机制保持动态平衡，维持正常的骨重建[13]。骨质疏松症的主要病理机制包括成骨细胞活性减弱、骨形成不足；破骨细胞数量增多、活性增强，导致骨吸收加速，骨形成小于骨吸收，结果使骨代谢处于负平衡的状态[14]。成骨细胞来源于骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)，骨髓间充质干细胞可以成骨分化，也可以成脂分化，且这种分化能力与年龄相关[15]。骨髓间充质干细胞成骨、成脂分化直接影响到成骨细胞介导的成骨功能，从而影响骨量，与骨质疏松密切相关。随着年龄的增长，骨髓间充质干细胞、成骨细胞和骨细胞的生物学功能均会下降[16]。对于自然衰老的老年骨质疏松大鼠，其骨髓间充质干细胞的成骨分化能力降低，成脂分化能力增强。研究表明，由骨形成蛋白2(bone 
morphogenetic protein 2，BMP2)、Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2，Runx2)、成骨细胞特异性转录因子所构成的BMP2/Runx2/Osterix信号通路是成骨细胞生成和骨形成的主要信号通路之一[17-18]，该研究探索运动训练对老年骨质疏松大鼠成骨、成脂分化标志物表达的影响，并进一步分析BMP2/Runx2/Osterix信号通路在运动促进骨形成中的作用，为运动训练防治骨质疏松症提供一定的理论依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1   设计   随机对照动物实验，多组间比较采用单因素方差分析。
1.2   时间及地点   实验于2020-10-29/2021-01-03在南华大学动物实验部及南华大学附属第一医院中心实验室完成。
1.3   材料
1.3.1   实验动物   16只24月龄的雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，体质量(707±93) g，由成都达硕实验动物有限公司提供，合格证号SCXK(川)2020-030； 8只3月龄雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，体质量(549±27) g，由长沙市天勤生物技术有限公司提供，合格证号SCXK(湘)2019-0013。将大鼠分笼饲养在南华大学实验动物中心，控制室温(24±2) ℃和光照周期(12 h黑暗/光照循环交替)；湿度为(55±5)%并自由饮食饮水，饲料由长沙市天勤生物技术有限公司提供，每千克饲料含粗蛋白≥18%、粗灰分≤8%、钙1.0%-1.8%、磷0.6%-1.2%等，主要原料：玉米、豆粕、进口鱼粉、面粉等。

实验过程均严格遵循动物福利与伦理准则和指南的相关规定。实验方案经南华大学附属第一医院医学伦理委员会批准(批准号为202010050050)。
1.3.2   主要试剂   血清骨源性碱性磷酸酶、Ⅰ型前胶原N-端前肽、抗酒石酸酸性磷酸酶、Ⅰ型胶原交联N-末端肽试剂盒(武汉华美生物)；Runx2、Osterix一抗(英国Abcam公司)；BMP2一抗(ABclonal公司)；过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferators-activated receptor γ，PPARγ)、β-actin一抗(美国Proteintech)；SuperECL Plus超敏发光液(Abiowell)；蛋白酶抑制剂(北京金泰宏达)；琼脂糖(西班牙BIOWEST)；反转录试剂盒(北京康为世纪)；Trizol(美国Thermo)；核酸染料(北京普利莱)。
1.3.3   主要仪器   台式冷冻离心机(湖南湘仪)；荧光定量PCR仪、荧光PCR板(美国Thermo)；双能X射线骨密度测量仪(美国Dexa)；中科恺盛Micro-CT扫描仪、Micro-CT数据处理软件ZKKS-MicroCT4.1(广州中科恺盛)；南京KW-PT小动物跑步机(南京卡尔文)。
1.4   实验方法   
1.4.1   实验动物分组   将16只24月龄老年大鼠按照随机抽样法分为老年模型组和运动训练组，每组8只；将8只3月龄青年大鼠作为青年对照组[19-20]。
1.4.2   运动方案   青年对照组、老年模型组和运动训练组大鼠均可在饲养笼中自由活动，运动训练组大鼠除在饲养笼中自由活动外，需使用跑步机进行运动训练，运动方案参照以往研究及最大摄氧量研究制定[21-22]，前3 d进行适应性运动训练，逐渐达到预定负荷(0.75-1.20 km/h，60 min/d；坡度：10°)。每周干预5 d，共8周，其余组不进行运动干预，每天记录各组大鼠体质量变化。
1.5   主要观察指标   
1.5.1   血清骨代谢检测指标   8周干预结束后，对大鼠进行眼眶采血，血液标本常温(25 ℃)下静置2 h，在4 ℃下对标本以2 000 r/min离心20 min，取上清液-80 ℃冰箱保存。ELISA试剂盒测定骨源性碱性磷酸酶、Ⅰ型前胶原N-端前肽、抗酒石酸酸性磷酸酶和Ⅰ型胶原交联N-末端肽水平。采血后，麻醉下处死各组大鼠，取材进行以下指标检测。
1.5.2   骨密度   剥离右侧股骨和第4腰椎，清除结缔组织和肌肉，使用生理盐水湿润的纱布包裹保存，利用美国Dexa双能X射线骨密度测量仪中小动物扫描模式对大鼠右股骨和第4腰椎进行扫描，得到每个标本的骨密度值。
1.5.3   骨微结构   将大鼠右侧胫骨和第5腰椎保存在40 g/L多聚甲醛溶液中，采用Micro-CT平扫检测胫骨和第5腰椎的骨微结构。使用ZKKS-MicroCT4.1软件对骨组织进行定量分析，以生长板1 mm开始，长3 mm为分析区域，检测指标包括骨体积分数(bone volume fraction，BV/TV)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)、骨小梁数量(trabecular number，Tb.N)、骨小梁间隙(trabecular separation，Tb.Sp)等骨微结构参数指标。
1.5.4   实时定量RT-PCR检测Runx2、BMP2、Osterix和PPARγ基因表达   取大鼠左侧股骨骨髓保存在-80 ℃，采用Trizol法提取其总RNA，确定其浓度和纯度后，以总mRNA为模板，反转录合成cDNA，并以cDNA为模板，加入Runx2、BMP2、Osterix和PPARγ上下引物进行PCR扩增。以β-actin为内参。PCR反应条件：①95 ℃ 10 min；②95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，共40个循环。实验结束以后，记录目的基因及内参基因β-actin的Ct值，采用2-ΔΔCt法计算各基因的相对表达量。引物信息见表1。

1.5.5   Western blot检测Runx2、BMP2、Osterix和PPARγ蛋白表达   取大鼠左侧股骨骨髓，经洗涤、研磨、裂解，在4 ℃冰冻离心机以12 000 r/min离心15 min，取上清，经电泳，转膜，封闭，分别加入BMP2、Runx2、Osterix、PPARγ一抗、二抗孵育，显色、曝光，并将底片进行扫描，采用QuanitityOne软件进行灰度分析。将BMP2、Runx2、Osterix和PPARγ的吸光度分别与相应的β-actin吸光度比值作为其蛋白的相对表达量。

1.6   统计学分析   采用SPSS 23.0软件对实验数据进行统计学分析，符合正态分布的计量资料以x±s表示。采用单因素方差分析，组间两两比较时，若方差齐，用LSD-t检验；若方差不齐时，用Tamhane T2检验；若不符合正态分布，则采用非参数检验进行组间比较。显著性水平α=0.05。文章统计学方法由南华大学生物统计学专家审核。

该研究结果显示，24月龄老年雄性大鼠出现明显骨质疏松症状，表现为老年模型组大鼠骨密度低于青年对照组(P < 0.05)，这说明通过自然衰老构建的老年骨质疏松大鼠模型是成功的[23-24]，且老年模型组大鼠血清骨源性碱性磷酸酶、Ⅰ型前胶原N端前肽均降低(P < 0.05)，表明老年骨质疏松存在成骨细胞活性低、成骨能力下降的情况；老年大鼠骨髓中BMP2、Runx2、Osterix的表达减少(P < 0.05)，PPARγ的表达增多(P < 0.05)，一定程度上说明骨髓间充质干细胞的功能变化及细胞衰老参与老年骨质疏松的发病[2]。

成骨细胞介导的骨形成和破骨细胞介导的骨吸收的动态平衡对于维持骨量和骨微环境的稳态十分重要。血清中骨源性碱性磷酸酶反映成骨细胞的活性[25]；血清中Ⅰ型前胶原N-端前肽水平反映成骨细胞合成胶原的能力[26]，是新骨形成的特异性的敏感指标；抗酒石酸酸性磷酸酶和Ⅰ型胶原交联N-末端肽是骨吸收的生化标志物[27-29]。该研究中老年大鼠骨代谢标志物的变化提示老年骨质疏松大鼠骨形成不足而骨吸收加速，这种情况区别于绝经后骨质疏松大鼠的骨代谢水平，绝经后骨质疏松的机体整体处于骨代谢高转换型[30]，会出现骨吸收和骨形成均增加的病理状态[31]。在该研究中，经运动训练后的老年骨质疏松大鼠，骨形成水平增强，骨吸收水平降低，差异均有显著性意义(P < 0.05)，这说明运动训练有效增强老年骨质疏松大鼠的骨形成作用，同时抑制骨吸收水平。

在临床上，双能X射线是检测骨质疏松症的黄金标准[32-34]。该研究中，老年模型组大鼠股骨的骨密度水平低于青年对照组，经运动训练后，运动训练组大鼠的股骨骨密度提高，差异均有显著性意义(P < 0.05)。该结果提示，运动训练可以增加老年骨质疏松大鼠的骨密度。在检测各组胫骨和第5腰椎的骨微结构指标中，与青年对照组比较，老年模型组大鼠胫骨的骨体积分数、骨小梁数量减小(P < 0.05)，骨小梁间隙增大(P < 0.05)，说明老年骨质疏松存在骨小梁数量减少，分离度增加，骨质流失；经运动干预后，该研究发现运动训练对骨质疏松大鼠的骨小梁数量及空间形态有积极的作用，运动可以增加骨小梁数量，降低骨小梁间距，从而提高骨密度，这与运动促进骨形成的效应是一致的。此外，研究结果提示，运动对骨微结构的保护作用主要体现在骨质疏松大鼠胫骨上，对骨质疏松大鼠腰椎的骨微结构改善并不明显，仅仅减少骨小梁间隙。这可能与跑台训练方式、应力刺激更多作用于承重的四肢、对腰椎的应力刺激不足有关。研究表明，运动引起的机械负荷促进骨形成[35]，失重、制动都会导致动物骨量的丢失，甚至引起骨质疏松[36]。因此，有效的运动一方面预防骨量丢失，另一方面促进骨形成，从而达到防治骨质疏松的作用。

BMP2、Runx2和Osterix在骨形成和成骨细胞生成中起重要作用[37-40]，其中BMP2诱导成骨细胞分化和促进骨形成[41]，是骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞的主要因素[42]；Runx2的激活有利于间充质干细胞向成骨细胞分化，受到BMP2信号的调控[43]；Osterix直接促进成骨前体细胞向成骨细胞转化[44]。PPARγ与间充质干细胞的成脂分化有关[2，45-46]，是骨髓间充质干细胞成骨性分化和成脂性分化过程中关键调控点之一[47-49]。骨髓间充质干细胞成骨分化的潜力与骨量增加密切相关，且与老年骨质疏松关系密切。该研究中，老年模型组大鼠骨髓中BMP2、Runx2和Osterix mRNA及蛋白表达均减少(P < 0.05)，PPARγ mRNA及蛋白表达增多(P < 0.05)，这说明骨形成减少、骨髓间充质干细胞成骨分化能力下降、成脂分化增多是老年骨质疏松的原因之一；徐众华等[50]研究绝经后骨质疏松大鼠中BMP2、Runx2和Osterix表达出现相同的结果。而运动训练组大鼠骨髓中BMP2、Runx2、Osterix、PPARγ的表达变化情况提示，运动通过促进老年骨质疏松大鼠骨形成作用，增强骨髓间充质干细胞成骨分化能力，抑制成脂分化，提高老年骨质疏松大鼠的骨量。跑台运动训练同样可以抑制骨质疏松大鼠PPARγ蛋白的表达，抑制成脂分化，有研究则通过胫骨近端苏木精-伊红染色观察骨髓脂肪空泡来了解成脂分化水平[51]。通过干细胞、靶向药物、转基因技术消除衰老骨髓间充质干细胞和成骨细胞，从而增加骨量、促进骨形成，是目前治疗骨质疏松的方向之一，但应用在人类身上既费用昂贵，又有伦理等因素的限制[16，52-53]。该研究中，运动训练后大鼠骨髓组织中成骨分化标志物基因明显上调，说明运动训练促进骨形成可能通过激活BMP2 /Runx2/Osterix信号通路实现的。

运动或体育锻炼可以提高骨量和强度，促进骨形成，从而有效地治疗和预防骨质疏松。但是，运动治疗骨质疏松的机制十分复杂，运动介导的改变从不同方面对骨骼产生有利的影响，如应力刺激、激素、细胞因子、细胞信号通路以及非编码RNA，其中运动可能通过影响BMP2/Runx2/Osterix通路发挥抗骨质疏松作用；Wnt/β-catenin信号通路也参与其中[54-55]，甚至Wnt/β-catenin信号通路同样可能调控Osterix的表达[56]，影响骨髓间充质干细胞向成骨或成脂方向分化；有研究表明，Runx1可以通过Wnt/β-catenin信号通路抑制脂肪生成来调节骨髓间充质干细胞的成骨分化[57]。骨髓脂肪细胞的增加甚至会导致破骨细胞的形成增加[58]，因此，抑制骨髓脂肪细胞的生成从而影响破骨细胞的生成可能是未来治疗骨质疏松的新机制。在该研究中，运动训练组大鼠骨髓组织中PPARγ表达减少，说明运动训练在一定程度上影响了骨髓间充质干细胞的成脂分化。

综上所述，运动训练可能通过调节骨髓组织中的细胞分化方向，促进骨髓间充质干细胞成骨分化、抑制成脂分化，从而提高骨密度，改善骨组织微结构。该研究在一定程度上说明运动训练可能通过激活BMP2/Runx2/Osterix信号通路抑制老年大鼠骨质疏松。长期的运动疗法及不同的运动类型对骨质疏松的作用是否安全、有效，尚值得进一步研究。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：
骨质疏松症：是一种以骨量减低、骨组织微结构损坏导致骨脆性增加、易发生骨折为特征的全身性骨病，其中老年骨质疏松症属于原发性骨质疏松，其骨代谢属于低转换状态。
骨形成蛋白2/Runt相关转录因子2/Osterix信号通路：骨形成蛋白是一种广泛存在于骨基质中的酸性糖蛋白，骨形成蛋白2是促进骨形成和诱导成骨细胞分化最重要的细胞外信号分子之一；Runt相关转录因子是调控间充质干细胞向成骨细胞分化的特异性转录因子，Runt相关转录因子2是骨形成蛋白2的靶基因；Osterix是成骨细胞特异性转录因子，骨形成蛋白2可以通过转录因子Runt相关转录因子2调节Osterix的表达，从而促进骨形成。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

老年骨质疏松是一种骨代谢处于低转换状态的骨质疏松，破骨细胞和成骨细胞活性都下降，从成骨细胞及成骨分化水平角度研究防治老年骨质疏松是当前研究热点之一。运动对促进骨质疏松大鼠骨形成的效应是明确的，其研究多集中在绝经后骨质疏松大鼠，关于运动对老年骨质疏松大鼠的骨形成作用及其机制尚不明确。该研究采用老年骨质疏松大鼠模型，研究运动对老年骨质疏松的骨量、骨代谢、骨形成的影响，证明了运动训练促进老年骨质疏松大鼠骨形成的效应可能与BMP2/Runx2/Osterix信号通路的激活密切相关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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