干扰或过表达慢病毒感染细胞72 h后，在荧光倒置显微镜下观察可见si-PVT1-NC组、si-PVT1组、PVT1-NC组和PVT1组的细胞内均发出不同程度的绿色荧光，其中si-PVT1组的绿色荧光要弱于si-PVT1-NC组，PVT1组要强于PVT1-NC组。Control组未进行转染，普通显微镜下可见细胞形态规则，呈长梭形，细胞排列规则，见图2B，C。

RT-PCR结果显示，PVT1组的相对mRNA表达量显著高于Control组(P < 0.01)，PVT1-NC组则与Control组相比差异无显著性意义(P > 0.05)，见图2D。实验结果提示成纤维细胞过表达或干扰都转染成功。



2.3   MTT实验结果    结果显示，随细胞培养时间延长，各组细胞的A值均逐渐升高，其中PVT1组的A值在12，24 h与Control组的A值均无明显差异(P > 0.05)。培养后36，48，72 h检测结果显示PVT1组的A值均显著高于Control组(P < 0.05)。而si-PVT1组的A值在培养后24，36，48，72 h 时与Control组相比明显降低(P < 0.05)。以上结果说明LncRNA PVT1过表达时可显著促进成纤维细胞的增殖，而其受到干扰时，细胞增殖则受到抑制，见图3A。将si-PVT1组和si-PVT1-NC组的相对抑制率比较，显示从培养后24，36，48及72 h 时si-PVT1组的抑制率明显高于si-PVT1-NC组，且差异有显著性意义(P < 0.05)，见图3B，再次说明当干扰PVT1时，成纤维细胞的增殖受到抑制。



2.4   细胞划痕实验结果   实验结果显示，细胞培养0 h时，此时5组划痕宽度无明显差别。培养48 h时，和Control组相比，si-PVT1组的平均划痕宽度增加，PVT1组的划痕宽度则减小，见图4A。培养48 h后的细胞迁移率结果显示，si-PVT1组和PVT1-NC组的细胞迁移率显著低于Control组(P < 0.05)，此外PVT1组的细胞迁移率明显大于si-PVT1组(P < 0.01)，见图4B。结果提示当LncRNA PVT1表达受到抑制时，成纤维细胞的迁移能力减弱，相反过表达时则显著提高细胞的迁移能力。



2.5   流式细胞仪检测结果   流式细胞结果见图5，与 Control组(总凋亡率为5.66%)相比，si-PVT1组细胞总凋亡率显著升高(为21.8%)，PVT1组细胞总凋亡率显著降低(为3.38%)，提示LncRNA PVT1过表达时可能会抑制成纤维细胞凋亡。



2.6   RT-PCR检测结果   结果见图6所示，si-PVT1组的c-Myc和转化生长因子β1相对mRNA表达量显著低于Control组(P < 0.05)，PVT1组的c-Myc、转化生长因子β1、Smad2和Smad3相对mRNA表达量均显著高于相应的Control组和si-PVT1组(P < 0.05)，其他组与Control组相比无明显差异(P > 0.05)。提示LncRNA PVT1过表达时可促进c-Myc、转化生长因子β1、Smad2和Smad3的mRNA相对表达，其干扰时则显著抑制c-Myc和转化生长因子β1 mRNA表达。



2.7   Western-blot检测结果   Western blot结果见图7所示，si-PVT1组的c-Myc、转化生长因子β1、smad2、smad3蛋白相对表达量均显著低于Control组(P < 0.05)，PVT1组中4种蛋白的相对表达量均显著高于Control组和si-PVT1组(P < 0.05)，其他组均与Control组无明显差异(P > 0.05)。提示LncRNA PVT1过表达时可促进4种因子的蛋白表达，而LncRNA PVT1被干扰时，4种蛋白表达量均显著下降。

盆腔器官脱垂是指由各种原因导致盆底支撑组织薄弱，造成盆腔器官下垂移位，引发器官位置和功能异常的妇科疾病[1-2]。成纤维细胞是构成盆底筋膜韧带的主要细胞，在盆腔器官脱垂的发生、发展和修复中发挥着重要作用[3]。当成纤维细胞功能受损时，可致胶原代谢障碍及细胞外基质产生紊乱，破坏盆底致密组织结构，从而促使盆腔器官脱垂的发生[4]。

长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是指长度超过200个核苷酸的不编码蛋白质的转录本，可参与基因转录、转录后调控和蛋白质合成的调控等生物学过程[5]。作者所在课题组前期通过高通量测序结果发现长链非编码RNA浆细胞瘤变异性易位基因1(long non-coding RNA plasmacytoma variant translocation1，LncRNA PVT1)在盆腔器官脱垂患者子宫主韧带中表达明显降低，转化生长因子β1信号通路也是相关通路之一[6]。LncRNA PVT1 位于染色体 8q24.21，与c-Myc基因位点位置相近，且二者关系紧密，具有共扩增机制[7]。转化生长因子β1被认为是最有效的成纤维细胞活化介质之一，能够通过Smad2和Smad3蛋白激活成纤维细胞[8-11]。

此次研究分别构建LncRNA PVT1的干扰和过表达体系，检测其对大鼠盆底韧带成纤维细胞增殖迁移和凋亡的影响，以及细胞中c-Myc、转化生长因子β1、Smad2和Smad3的表达，探讨LncRNA PVT1在盆腔器官脱垂疾病发生发展过程中的作用及可能的分子机制，从而为盆腔器官脱垂患者的临床诊断和治疗提供新思路。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1   设计   细胞学实验，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较用LSD检验。
1.2   时间及地点   实验于2019年11月至2020年12月在郑州大学第三附属医院科研中心完成。
1.3   材料
1.3.1   实验动物   6只8周龄雌性健康SD大鼠，体质量200-250 g， SPF级，购于河南省实验动物中心，实验动物许可证号：SYXK(豫)2021-0005。实验方案经郑州大学第三附属医院动物实验伦理委员会批准，批准号：2022-073-01。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。
1.3.2   主要试剂与主要仪器设备   兔抗波形蛋白抗体(Bioswamp，武汉，中国)，羊抗兔Alexa Fluor 488-conjugated(Bioswamp，武汉，中国)，兔抗C-Myc抗体(Bioswamp，武汉，中国)、兔抗转化生长因子β1抗体(Bioswamp，武汉，中国)、兔抗smad2抗体(Bioswamp，武汉，中国)、兔抗smad3抗体(Bioswamp，武汉，中国)，兔抗GAPDH抗体(Bioswamp，武汉，中国)，羊抗兔二抗(Bioswamp，武汉，中国)。AMR-100酶标仪，杭州奥盛公司；DMIL LED荧光倒置显微镜，德国Leica公司；311型CO2恒温培养箱，美国Thermo Fisher Scientific公司；Tanon-5200全自动化学发光分析仪，上海天能公司；iCEN-24R高速冷冻离心机，杭州奥盛公司。
1.4   实验方法   
1.4.1   大鼠子宫韧带成纤维细胞的分离培养及鉴定   SD大鼠用3%戊巴比妥钠溶液(35 mg/kg)腹腔注射进行麻醉。待大鼠深度麻醉后颈椎脱臼处死，剪开腹腔，无菌条件下取出双侧子宫韧带组织，PBS反复冲洗后，用眼科剪剪成1 mm×1 mm左右的小块，加入消化酶，37 ℃条件下消化2 h，期间反复吹打。加入体积分数10%的胎牛血清终止消化，1 500 r/min 离心洗涤 5 min，弃上清，用含体积分数10%胎牛血清的DMEM 培养基重悬，接种于培养瓶中，置于37 ℃、体积分数5%的CO2培养箱内培养，每2 d换液1次，待细胞生长达到80%-90%时按1∶2比例进行传代，取第3-5代细胞用于后续实验。倒置显微镜下观察细胞形态，细胞免疫荧光实验检测波形蛋白进行鉴定。
1.4.2   病毒构建   包装细胞选用人胚肾细胞系293T细胞株，购自Bioswamp细胞库；重组穿梭质粒和包装质粒pGag/Pol、pRev、pVSV-G由郑州大学第三附属医院科研中心保存。病毒包装，培养293T细胞，培养至90%融合时，更换新鲜的培养皿；离心管中按比例加入无血清DMEM和含目的序列的穿梭质粒和包装质粒，混匀；向另一个离心管中按比例加入无血清DMEM和RNAi-Mate，混匀，室温放置5 min后将两管混合，室温放置20 min；换液后将转染混合物逐滴加入培养皿中混合，温育4-6 h；换培养液继续培养72 h。

病毒收集：收集培养皿中的上清液并离心浓缩后，分装至EP管中，-80 ℃冰箱保存。
1.4.3   病毒转染与实验分组   感染前，将成纤维细胞接种于6孔板中，3×105个/孔，2 mL/孔，确保感染时细胞融合率达到90%，37 ℃孵育过夜。将构建的si-PVT1及PVT1过表达质粒，在37 ℃水浴中快速解冻，抽吸原细胞培养液，加入1 mL新鲜培养基，向细胞中加入10 μL(MOI=10)病毒，轻轻振荡使病毒与细胞充分接触，然后将培养皿放回培养箱孵育。培养8 h后，用2 mL新鲜培养基代替感染培养基。细胞感染3 d后，在荧光显微镜下观察荧光表达。根据干扰基因靶点不同，将干扰病毒组分为si-PVT1-1、si-PVT1-2和si-PVT1-3三组，另外将si-PVT1-NC组[转染含有siRNA阴性对照(NC)序列慢病毒的成纤维细胞]和空白未转染细胞(Control 组)作为对照。另外，为了验证PVT1过表达效果，同样也将成纤维细胞分为PVT1组(转染含LncRNA PVT1基因过表达质粒的成纤维细胞)，PVT1-NC组(转染空质粒的成纤维细胞)及正常细胞组。分别利用RT-PCR进行干扰和过表达感染效率测定，同时筛选出干扰效果最好的si-PVT1进行后续实验。PCR引物由武汉天一辉远生物科技有限公司合成，见表1。

接下来将培养的成纤维细胞(波形蛋白表达阳性)分为5组：PVT1组、PVT1-NC组、si-PVT1组、si-PVT1-NC组和Control 组。
1.4.4   MTT实验   收集各组成纤维细胞，调整细胞悬液浓度，接种于96 孔板，3×103个/孔，每孔100 µL，置 37 ℃、体积分数5%CO2 培养箱中培养过夜，使细胞贴壁。按照不同分组感染细胞，继续培养 12，24，36，48，72 h。取出细胞培养板，每孔加 10 μL MTT 溶液(5 g/L)，继续培养4 h。酶标仪检测 490 nm 处的吸光度(A)值。

抑制率=(空白对照组平均A值-各组平均A值)/空白对照组平均A值×100%。
1.4.5   细胞划痕实验    用记号笔在6孔板底外均匀的画2道间隔0.5 cm的直线。每孔中接种1×106个成纤维细胞，常规培养到90%融合状态。用10 µL微量移液器枪尖在细胞板上划垂直于直线的划痕。用PBS 冲洗去除划下的细胞，按照不同分组处理细胞，加入无血清培养液继续培养。放入37 ℃，体积分数5%的CO2培养箱孵育。在 0，24，48 h分别拍照，拍照时选取记号笔画的线和细胞划痕的交点作为观察点，以定点观察。

划痕迁移率=(0 h划痕宽度-48 h划痕宽度)/ 0 h划痕宽度×100%。
1.4.6   流式细胞术检测成纤维细胞的凋亡   收集各组成纤维细胞，取1×106个培养基重悬的细胞，400×g，4℃离心5 min，弃上清。加入1 mL预冷PBS，轻轻吹打混匀细胞，400×g，4 ℃离心 5 min，弃上清，将细胞重悬于200 μL PBS。加入5 μL Annexin V-PE 和5 μL 7-AAD，轻轻混匀，4 ℃避光孵育30 min。加入300 μL PBS，进行流式检测，使用 Novo Express软件进行分析。细胞的总凋亡率=Q2-2+Q2-4，其中Q2-2为晚期凋亡率，Q2-4为早期凋亡率。
1.4.7   RT-PCR检测各组c-Myc、转化生长因子β、Smad2、Smad3基因表达   用TRIZOL提取成纤维细胞总RNA。用cDNA反转录试剂盒对总RNA进行反转录反应，PCR引物由武汉天一辉远生物科技有限公司合成。扩增条件依次为：95 ℃，3 min；56 ℃，10 s；72℃，25 s，40个循环。引物序列见表2，内参基因为GAPDH。数据采用2-ΔΔCt进行计算，实验重复3次。

1.4.8   Western Blot检测c-Myc、转化生长因子β1、Smad2、Smad3蛋白表达   将大鼠盆底韧带组织剪成细小的碎片，按每20 mg组织加入200 μL裂解液的比例加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂裂解液，匀浆器匀浆直至完全裂解。用BCA试剂盒检测蛋白浓度。取50 μg蛋白溶于2×SDS上样，SDS-PAGE凝胶电泳，湿转法将蛋白转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉在室温下封闭1 h，GAPDH 为内参，将PVDF膜与稀释的一抗(稀释比例均为1∶1 000)兔抗4 ℃孵育过夜，TBST洗涤3次，二抗(稀释比例1∶10 000)孵育1 h。ECL光化学法显色，以目的条带灰度值/GAPDH条带灰度值表示相对蛋白含量。每次实验重复3次。
1.5   主要观察指标   ①镜下观察及鉴定成纤维细胞；②MTT检测各组成纤维细胞的增殖情况；③细胞划痕实验检测各组成纤维细胞的迁移情况；④流式细胞术检测成纤维细胞凋亡情况；⑤RT-PCR和western-blot检测成纤维细胞c-Myc、转化生长因子β1、Smad2、Smad3的mRNA及蛋白相对表达量。
1.6   统计学分析   文章统计学方法经由赵冰教授和梁肖老师审核。数据用x±s表示，以检验水准α=0.05。多组组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较用LSD检验。采用SPSS 26.0软件进行统计分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

盆腔器官脱垂的病因在很大程度上仍是未知的，该病的发生是多因素作用的共同结果[12-13]。大多数危险因素可导致盆底结缔组织/胶原减弱，使得盆腔器官位置下移并穿过阴道壁[14]。从组织结构的角度看，盆底韧带松弛、细胞外基质分泌减少、弹性蛋白、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原减少等是盆腔器官脱垂发生的重要原因之一。而成纤维细胞作为构成盆底韧带的主要细胞，可分泌Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原，参与维持细胞外基质的稳定和盆底致密结构的稳定[3]。波形蛋白是一种中间丝蛋白，被认为是成纤维细胞的标志性蛋白质之一[15-16]。此次实验中从大鼠盆底韧带中提取分离的细胞免疫荧光染色后发现胞浆中呈绿色荧光，证实培养的细胞为成纤维细胞。

越来越多的证据表明， LncRNA的异常表达参与多种生物学和病理过程，如细胞增殖、细胞凋亡、细胞侵袭、细胞转移、干细胞更新、耐药性等[17-18]。为了揭示LncRNA PVT1对成纤维细胞的作用机制，此文中分别构建了该基因的干扰慢病毒和过表达慢病毒载体来转染成纤维细胞。首先从3个不同靶点的干扰si-PVT1中筛选出干扰效果最明显的si-PVT1-1进行后续细胞实验，增殖实验结果显示LncRNA PVT1过表达后能够增加成纤维细胞的增殖活性，干扰后则相反。LI等[19]在研究矽肺诱导肺纤维化疾病的机制中发现，IncRNA-PVT1可促进肺成纤维细胞的激活。CAO等[20]研究IncRNA PVT1在心房颤动疾病中发挥的作用，发现PVT1过表达可促进心房成纤维细胞增殖。细胞划痕实验可在体外反映细胞迁移的情况，对于评估细胞修复愈合能力意义重大[21]。流式细胞学实验用来检测细胞的凋亡变化情况，可灵敏反映细胞的凋亡比率变化情况[22]。此次实验结果显示，成纤维细胞中LncRNA PVT1的表达水平降低时，成纤维细胞迁移速度减慢，愈合速度减慢，并且促进细胞凋亡。当其过表达时，则相反。WANG等[23]在对类风湿性关节炎疾病的研究中发现，LncRNA PVT1敲低可通过调节mir-543诱导成纤维细胞样滑膜细胞凋亡。ZHENG等[24]在研究肝纤维化疾病的过程中发现，PVT1在纤维化肝组织和活化的肝星状细胞中均明显增加，PVT1下调可抑制星状细胞的增殖。

c-Myc作为一种转录因子，在细胞增殖、细胞生长、能量代谢和凋亡等多种生物学过程中发挥着核心作用[25]。FEGHALI等[26]研究发现当成纤维细胞中c-Myc基因过表达时，可以促进成纤维细胞的活性，促进其生长和增殖。c-Myc可调节肾纤维化中的成纤维细胞活化、心脏及肺成纤维细胞的增殖和分化[27-29]。LncRNA PVT1与c-Myc不仅具有共扩增机制，而且LncRNA PVT1还可使c-Myc蛋白表达更稳定[30-31]。GHADIRI等[32]在研究急性髓细胞白血病原粒细胞中发现阻断PVT1表达会导致c-Myc的表达下调。SHIGEYASU等[33]在结直肠癌的分子研究中发现PVT1基因位点可能作为增强子直接控制MYC mRNA的表达。转化生长因子β1通过激活Smad2/3途径促进肥厚性瘢痕中纤维细胞的增殖、迁移和收缩以及胶原合成[34]。石永英等[35]在研究转化生长因子β1诱导大鼠心肌细胞肥大的过程中发现早期c-Myc随转化生长因子β1刺激表达升高，c-Myc形成Smad2/c-Myc复合物抑制p15表达。刘红艳等[36]在研究萝卜硫素对结肠癌 HT-29 细胞增殖的作用中发现，转化生长因子β1/Smad 信号传导受到抑制时c-Myc 蛋白表达也会随之下降。因而此文初步假设LncRNA PVT1可能通过转化生长因子β1/smad2/3/c-Myc通路对成纤维细胞产生影响。RT-PCR和Western blot实验结果表明当lncRNA PVT1过表达时，可显著促进c-Myc、转化生长因子β1和Smad2/3的mRNA以及蛋白表达；而当LncRNAPVT1被干扰时，上述4种因子的mRNA及蛋白表达均受到明显抑制。CAO等[20]在心房纤维化的研究中发现，心房成纤维细胞中LncRNA PVT1的过表达可促进转化生长因子β1/Smad信号通路相关蛋白的表达。HU等[37]通过研究口腔鳞状细胞癌疾病发现转化生长因子β1可上调c-Myc癌基因表达，促进了癌细胞的增殖。郝淑玲等[38]研究发现c-Myc基因表达升高可能参与转化生长因子β1促进人肺成纤维细胞增殖的过程。ZHANG等[10]发现在糖尿病肾病中，将大鼠肾小球系膜细胞中的PVT1基因敲除可显著抑制转化生长因子β1和c-Myc蛋白的表达从而抑制该细胞的过度增殖。此次实验结果与上述结果相似，提示LncRNA PVT1对成纤维细胞的生物学活性和形态的影响可能与转化生长因子β1、smad2/3和c-Myc有关。

综上，LncRNA PVT1能够促进成纤维细胞的增殖和迁移，抑制细胞凋亡；而且LncRNA PVT1对成纤维细胞产生的这种作用可能与转化生长因子β1/Smad2/3/c-Myc信号通路有关，此次研究结果可能为盆腔器官脱垂的临床个体化诊断和治疗提供新的理论依据。但是LncRNA PVT1对成纤维细胞具体作用的详细分子机制还不清楚，今后的实验中可对转化生长因子β1或smad2/3进行干预从而对其通路展开进一步研究。
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文题释义：
盆腔器官脱垂：指盆腔器官脱出于阴道内或阴道外。2001年美国国立卫生研究院提出：盆腔器官脱垂指任何阴道节段的前缘达到或超过处女膜缘外1 cm以上，可单独发生，但一般情况下是联合发生。盆底功能障碍性疾病的治疗与否取决于对患者的生活质量影响，治疗有非手术治疗和手术治疗两种方法。
LncRNA PVT1：即长链非编码RNA浆细胞瘤变异性易位基因1，其基因图谱位于8q24染色体带上，该位点是染色体遗传畸变的脆弱位点，参与细胞周期、凋亡和转化重要进程，可参与多种疾病的发生发展。

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成纤维细胞是构成盆底筋膜韧带的主要细胞，在盆腔器官脱垂的发生、发展和修复中发挥着重要作用。当成纤维细胞功能受损时，可致胶原代谢障碍及细胞外基质产生紊乱，破坏盆底致密组织结构，从而促使盆腔器官脱垂的发生。作者所在课题组前期通过高通量测序结果发现长链非编码RNA浆细胞瘤变异性易位基因1在盆腔器官脱垂患者子宫主韧带中表达明显降低，转化生长因子β1信号通路也是相关通路之一。此文通过干预长链非编码RNA浆细胞瘤变异性易位基因1的表达来研究其对盆底韧带成纤维细胞的影响，探讨该基因在盆腔器官脱垂疾病发生中的作用，为临床盆腔器官脱垂的治疗提供理论依据和新的靶点。

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