炎症环境下牙髓成纤维细胞中NOD样受体蛋白3炎症体相关分子表达的调节

doi:10.12307/2022.810

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (26): 4107-4112.doi: 10.12307/2022.810

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炎症环境下牙髓成纤维细胞中NOD样受体蛋白3炎症体相关分子表达的调节

张安生1，张海欧2，倪龙兴1

1西安国际医学中心医院口腔科，陕西省西安市 710018；2解放军联勤保障部队第928医院五官科，海南省海口市 570100

收稿日期:2021-07-02 接受日期:2021-08-09 出版日期:2022-09-18 发布日期:2022-03-07
通讯作者: 倪龙兴，博士，主任医师，西安国际医学中心医院口腔科，陕西省西安市 710018
作者简介:张安生，男，1983年生，安徽省肥西县人，汉族，2014年解放军第四军医大学口腔医学院毕业，博士，主治医师，主要从事牙髓生物学领域研究。

Regulating the expression of nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3 inflammasome-related molecules in dental pulp fibroblasts under inflammation

Zhang Ansheng1, Zhang Haiou2, Ni Longxing1

1Department of Stomatology, Xi’an International Medical Center Hospital, Xi’an 710018, Shaanxi Province, China; 2Department of Ophthalmology and Otorhinolaryngology, the 928th Hospital of Chinese PLA, Haikou 570100, Hainan Province, China

Received:2021-07-02 Accepted:2021-08-09 Online:2022-09-18 Published:2022-03-07
Contact: Ni Longxing, MD, Chief physician, Department of Stomatology, Xi’an International Medical Center Hospital, Xi’an 710018, Shaanxi Province, China
About author:Zhang Ansheng, MD, Attending physician, Department of Stomatology, Xi’an International Medical Center Hospital, Xi’an 710018, Shaanxi Province, China

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
NOD样受体：即核酸结合与寡聚化结构域样受体，可识别病毒的病原相关分子模式。众所周知，NOD样受体调控炎性体的形成，诱导产生白细胞介素1β和白细胞介素18，从而参与炎症反应。
NOD样受体蛋白3炎症体：由NOD样受体蛋白3利用自体寡聚化形成蛋白支架，通过含有CARD结构域的凋亡相关点状蛋白募集Caspase-1所组成的高分子蛋白复合体。NOD样受体蛋白3是目前研究最为广泛和深入的炎症体，也是目前的研究热点。

背景：NOD样受体蛋白3炎症体是细胞抵御外来病原入侵的重要炎性因子，前期研究已证实其在牙髓成纤维细胞中有表达，然而炎症环境下牙髓成纤维细胞NOD样受体蛋白3炎症体相关分子的转录调节机制尚不清楚。
目的：阐明炎症环境下牙髓成纤维细胞中NOD样受体蛋白3炎症体相关分子的转录调节机制。
方法：选择第4代牙髓成纤维细胞，分6组：A组正常培养，不进行任何处理；B组加入脂多糖刺激6 h；C组加入Toll样受体4特异性抑制剂处理1 h，再加入Toll样受体4特异性抑制剂与脂多糖混合溶液处理6 h；D组加入髓样分化因子88特异性抑制剂处理1 h，再加入髓样分化因子88特异性抑制剂与脂多糖混合溶液处理6 h；E组加入核因子κB特异性抑制剂处理1 h，再加入核因子κB特异性抑制剂与脂多糖混合溶液处理6 h；F组加入髓样分化因子88特异性抑制剂阴性对照处理1 h，再加入髓样分化因子88特异性抑制剂阴性对照与脂多糖混合溶液处理6 h。采用RT-PCR检测NOD样受体蛋白3、Caspase-1与白细胞介素1β mRNA的表达，Western blot检测NOD样受体蛋白3与Caspase-1蛋白表达，ELISA法检测白细胞介素1β释放水平。
结果与结论：①与A组比较，B组NOD样受体蛋白3、Caspase-1及白细胞介素1β mRNA表达水平升高(P < 0.05)；与B组比较，C-E组NOD样受体蛋白3、白细胞介素1β mRNA表达水平降低(P < 0.05)，C组Caspase-1 mRNA表达水平降低(P < 0.05)；②与A组比较，B组NOD样受体蛋白3、Caspase-1蛋白表达升高(P < 0.05)；与B组比较，C-E组NOD样受体蛋白3蛋白表达降低(P < 0.05)，C组Caspase-1蛋白表达降低(P < 0.05)；③与A组比较，B组白细胞介素1β水平升高(P < 0.05)；与B组比较，C-E组白细胞介素1β水平降低(P < 0.05)；④结果表明，脂多糖通过TLR4/MyD88/NF-κB信号通路上调牙髓成纤维细胞内NOD样受体蛋白3和白细胞介素1β的表达。
https://orcid.org/0000-0003-3268-7620 (张安生)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 牙髓成纤维细胞, 固有免疫, NOD样受体4, NOD样受体蛋白3炎症体, 信号通路, 白细胞介素1β, 核因子κB

Abstract: BACKGROUND: Nucleotide-binding oligomerization domain (NOD)-like receptor protein 3 inflammasome is an important inflammatory factor for cellular defense against various pathogens, which has been confirmed to be expressed in dental pulp fibroblasts. However, the mechanisms underlying the transcription regulation of NOD-like receptor protein 3 inflammasome in dental pulp fibroblasts under inflammation remains unclear.
OBJECTIVE: To elucidate the mechanisms underlying the transcription regulation of NOD-like receptor protein 3 inflammasome in dental pulp fibroblasts under inflammation.
METHODS: The 4th generation dental pulp fibroblasts were divided into six groups. Group A was cultured normally without any treatment. Group B was simulated with lipopolysaccharide for 6 hours. Group C was treated with a specific inhibitor of Toll-like receptor 4 for 1 hour, and then it was also treated with a mixed solution of Toll-like receptor 4 specific inhibitor and lipopolysaccharide for 6 hours. Group D was treated with a specific inhibitor of myeloid differentiation factor 88 for 1 hour, and then treated with a mixed solution of specific inhibitor of myeloid differentiation factor 88 and lipopolysaccharide for 6 hours. Group E was treated with a specific inhibitor of nuclear factor κB for 1 hour, and then treated with a mixture solution of specific inhibitor of nuclear factor κB and lipopolysaccharide for 6 hours. Group F was treated with a negative control of myeloid differentiation factor 88 specific inhibitor for 1 hour, and then treated with a mixed solution of myeloid differentiation factor 88 specific inhibitor negative control and lipopolysaccharide for 6 hours. Real-time polymerase chain reaction was used to detect the mRNA expression of NOD-like receptor protein 3, Caspase-1 and interleukin 1β. Western bolt was used to detect the expression of NOD-like receptor protein 3 and Caspase-1. And enzyme linked immunosorbent assay was used to detect the release level of interleukin 1β.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with group A, the mRNA expression of NOD-like receptor protein 3, Caspase-1 and interleukin 1β was increased in group B (P < 0.05), while compared with group B, the mRNA expression of NOD-like receptor protein 3 and interleukin 1β was decreased in groups C-E (P < 0.05), and the mRNA expression of Caspase-1 was also decreased in group C (P < 0.05). Compared with group A, the protein expression of NOD-like receptor protein 3 and Caspase-1 was increased in group B (P < 0.05), while compared with group B, the protein expression of NOD-like receptor protein 3 was decreased in groups C-E (P < 0.05), and the protein expression of Caspase-1 was also decreased in group C (P < 0.05). Compared with group A, the level of interleukin 1β was increased in group B (P < 0.05), while compared with group B, the levels of interleukin 1β were decreased in groups C-E (P < 0.05). All these findings indicate that lipopolysaccharide upregulates the expression of NOD-like receptor protein 3 and interleukin 1β in dental pulp fibroblasts through the Toll-like receptor 4/myeloid differentiation factor 88/nuclear factor-kappa B signaling pathway.

Key words: dental pulp fibroblasts, innate immunity, nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor 4, nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3 inflammasome, signaling pathway, interleukin 1β, nuclear factor κB

中图分类号:

张安生, 张海欧, 倪龙兴. 炎症环境下牙髓成纤维细胞中NOD样受体蛋白3炎症体相关分子表达的调节[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(26): 4107-4112.

Zhang Ansheng, Zhang Haiou, Ni Longxing. Regulating the expression of nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3 inflammasome-related molecules in dental pulp fibroblasts under inflammation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(26): 4107-4112.

图/表（结果） 4

2.1 各组细胞NOD样受体蛋白3炎症体相关基因表达见图1。

RT-PCR检测结果显示，与A组比较，B组NOD样受体蛋白3、Caspase-1及白细胞介素1β mRNA表达水平升高(P < 0.05)。F组NOD样受体蛋白3、Caspase-1及白细胞介素1β mRNA表达水平与B组比较无明显变化(P > 0.05)。与B组比较，C-E组NOD样受体蛋白3、白细胞介素1β mRNA表达水平降低(P < 0.05)，C组Caspase-1 mRNA表达水平降低(P < 0.05)，F组NOD样受体蛋白3、Caspase-1及白细胞介素1β mRNA表达水平无明显变化(P > 0.05)，D、E组Caspase-1 mRNA表达水平无明显变化(P > 0.05)。结果说明，Toll样受体4特异性抑制剂(CLI-095)、核因子κB特异性抑制剂(Bay 11-7082)与髓样分化因子88特异性抑制剂(Pepinh-MYD)均可有效抑制NOD样受体蛋白3和白细胞介素1β基因的转录；Caspase-1 mRNA水平的上调仅受到CLI-095的抑制，髓样分化因子88特异性抑制剂阴性对照Pepinh-Control对3种基因的转录无明显影响。
2.2 各组细胞NOD样受体蛋白3相关分子蛋白表达见图2。

Western blot检测结果显示，与A组比较，B、F组NOD样受体蛋白3表达升高(P < 0.05)，B、D、E、F组Caspase-1蛋白表达升高(P < 0.05)。与B组比较，C-E组NOD样受体蛋白3表达降低(P < 0.05)，F组无明显变化(P > 0.05)；C组Caspase-1蛋白表达降低(P < 0.05)，D-F组Caspase-1蛋白表达无明显变化(P > 0.05)。结果说明，Toll样受体4特异性抑制剂(CLI-095)、核因子κB特异性抑制剂(Bay 11-7082)与髓样分化因子88特异性抑制剂(Pepinh-MYD)均可有效抑制NOD样受体蛋白3的蛋白表达量，而Caspase-1蛋白表达仅受到CLI-095的抑制，髓样分化因子88特异性抑制剂阴性对照Pepinh-Control对两种蛋白均无影响。
2.3 各组细胞白细胞介素1β分泌水平见图3。

与A组比较，B、F组白细胞介素1β水平升高(P < 0.05)；与B组比较，C-E组白细胞介素1β水平降低(P < 0.05)，F组白细胞介素1β水平无明显变化(P > 0.05)。

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引言

致龋微生物的侵袭是牙髓组织出现感染并产生炎症的最主要原因[1]。牙髓组织周围由坚硬的牙体硬组织包绕，后者使得牙髓组织免受外界病原的侵袭[2]，一旦牙体硬组织的完整性遭到破坏，致龋微生物及其代谢产物即可侵入牙髓组织。
固有免疫系统是保护机体免受病原侵袭的第一道屏障[3]，固有免疫主要由巨噬细胞等专职免疫细胞介导；然而，研究发现一些非专职免疫细胞(上皮细胞、内皮细胞以及成纤维细胞等)同样可以介导固有免疫[4]。作为牙髓的主体细胞，牙髓成纤维细胞在牙髓组织出现炎症或受到外界刺激时可表达多种促炎因子，如Toll样受体2、Toll样受体4、NOD1、NOD2、白细胞介素6、白细胞介素8和白细胞介素1β等[5-8]。
与其他的细胞因子不同，白细胞介素1β从表达上调到成熟并释放到胞外，整个过程的调节是一个两步机制[4]。当细胞受到外界刺激时，细胞膜上的Toll样受体识别病原，Toll样受体信号通路的激活上调白细胞介素1β基因表达，促进白细胞介素1β前体即白细胞介素1β酶原的合成；白细胞介素1β酶原无法被细胞释放，必须经过水解形成成熟的白细胞介素1β才能行使促炎功能，这一步依赖于一种半胱氨酸蛋白酶——Caspase-1，后者由炎症体激活。
当前，NOD样受体蛋白3炎症体是炎症领域的研究热点，也是研究最为广泛和深入的一种炎症小体，它是由NOD样受体蛋白3蛋白支架、接头蛋白ASC及Caspase-1前体所组成的高分子蛋白复合体[9]。在特定激活条件下，NOD样受体蛋白3通过其核酸结合与寡聚化结构域实现寡聚化形成NOD样受体蛋白3支架，NOD样受体蛋白3包含PYD结构域，其可通过同型反应结合接头蛋白ASC，后者再通过CARD结构域募集并结合Caspase-1，形成成熟的NOD样受体蛋白3炎症体。在NOD样受体蛋白3炎症体成熟活化以后，Caspase-1前体会自我剪切，形成p10和p20并以四聚体形式呈现，即为活化的Caspase-1，其具有蛋白水解作用，可以水解白细胞介素1β，促使其成熟并释放到胞外，行使促炎功能。
有研究证实，牙髓组织中有NOD样受体蛋白3炎症体表达[10]，研究组前期研究也证实炎症牙髓组织牙髓成纤维细胞中NOD样受体蛋白3炎症体相关分子表达上调，体外研究也进一步证实脂多糖刺激上调牙髓成纤维细胞中NOD样受体蛋白3炎症体相关分子表达水平[11]。然而，脂多糖刺激通过何种信号通路上调牙髓成纤维细胞中NOD样受体蛋白3炎症体相关分子表达水平目前仍不清楚。脂多糖是Toll样受体4的特异性配体，提示Toll样受体4信号通路在脂多糖诱导NOD样受体蛋白3炎症体相关分子表达水平上调过程中具有调节作用。BAUERNFEIND等[12]的研究表明，激活核因子κB的模式识别受体可以调控NOD样受体蛋白3的表达，因此实验采用脂多糖作为刺激物模拟牙髓炎症环境，以激活牙髓成纤维细胞中的NOD样受体蛋白3炎症体，在此基础上通过加入特异性抑制剂的方式分别抑制Toll样受体、髓样分化因子88及核因子κB的活性，观察脂多糖刺激人牙髓成纤维细胞时对NOD样受体蛋白3炎症体表达水平的影响。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞学实验，组间比较进行ANOVA检验与Lsd-t检验。
1.2 时间及地点实验于2020年7月至2021年2月在西安国际医学中心医院实验中心完成。
1.3 材料 Toll样受体4特异性抑制剂(CLI-095)、髓样分化因子88特异性抑制剂(Pepinh-MYD)、髓样分化因子88特异性抑制剂阴性对照(Pepinh-Control)及IκBα磷酸化抑制剂(Bay 11-7082)(Invivogen，美国)；脂多糖(O111:B4，Sigma，美国)；鼠抗人NOD样受体蛋白3抗体、兔抗人Caspase-1抗体(CST，美国)；人白细胞介素1β ELISA试剂盒(R&D，美国)；ATP(MP，美国)；α-MEM培养液、胎牛血清(Gibco，美国)；RNAiso Plus(Takara，日本)；反转录试剂盒、RT-PCR试剂盒(Roche，德国)；离心机(Eppendorf，德国)； RT-PCR系统(Applied Biosystems，美国)。
1.4 实验方法
1.4.1 牙髓成纤维细胞的体外培养收集西安国际医学中心医院口腔科因正畸减数或阻生需拔除的健康恒牙，患者年龄25岁以下，患者对实验知情同意，并均签署了知情同意书。采用组织块法进行牙髓成纤维细胞的原代培养[13]。取新鲜拔除的离体牙，牙面消毒后无菌条件下摘取牙髓，α-MEM培养液冲洗3次，将牙髓剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的碎块并置入EP管中，加入1 mL Ⅰ型胶原酶消化1 h；终止消化后，将组织块平铺于60 mm细胞培养皿底壁，上覆盖玻片，加入少量含体积分数10%胎牛血清及双抗的α-MEM培养液，37 ℃、体积分数5%CO2细胞培养箱中孵育，每隔3 d换液一次。待细胞融合率达80%-90%时传代，取第3代细胞进行波形丝蛋白及角蛋白染色以鉴定细胞。取第4代牙髓成纤维细胞用于后续实验。
1.4.2 实验分组与干预 Toll样受体4特异性抑制剂(CLI-095)、核因子κB特异性抑制剂(Bay 11-7082)用DMSO溶解，髓样分化因子88特异性抑制剂(Pepinh-MYD)、髓样分化因子88特异性抑制剂阴性对照使用不含内毒素的水溶解。所有刺激试剂均用不含血清的α-MEM培养基释稀到预设的工作浓度。
将第4代牙髓成纤维细胞悬液接种于6孔板内，细胞浓度为1×109 L-1，每孔2 mL，倒置显微镜下观察细胞融合率达80%时进行实验。刺激前24 h更换为不含血清的α-MEM培养基。实验分6组：A组正常培养细胞，不加刺激，实验开始前24 h更换为不含血清的α-MEM培养基，培养6 h；B组加入10 mg/L脂多糖溶液2 mL，37 ℃、体积分数5%CO2细胞培养箱中孵育6 h；C组先加入5 μmol/L的Toll样受体4特异性抑制剂2 mL，置于细胞培养箱中孵育1 h，随后加入5 μmol/L的Toll样受体4特异性抑制剂与10 mg/L脂多糖混合溶液2 mL，细胞培养箱中继续孵育6 h；D组先加入5 μmol/L的核因子κB特异性抑制剂2 mL，置于细胞培养箱中孵育1 h，随后加入5μmol/L的核因子κB特异性抑制剂与10 mg/L脂多糖混合溶液2 mL，细胞培养箱中继续孵育6 h；E组先加入50 μmol/L的髓样分化因子88特异性抑制剂2 mL，置于细胞培养箱中孵育1 h，随后加入50 μmol/L的髓样分化因子88特异性抑制剂与10 mg/L脂多糖混合溶液 2 mL，细胞培养箱中继续孵育6 h；F组先加入50 μmol/L的髓样分化因子88特异性抑制剂阴性对照2 mL，置于细胞培养箱中孵育1 h，随后加入50 μmol/L的髓样分化因子88特异性抑制剂阴性对照与10 mg/L脂多糖混合溶液2 mL，细胞培养箱中继续孵育6 h。
检测白细胞介素1β分泌时，各组处理过程的最后30 min在溶液中加入ATP，使其终浓度为5 mmol/L。

1.5 主要观察指标 RT-PCR检测NOD样受体蛋白3炎症体相关基因表达：刺激完成后，利用TRIzol试剂盒提取各组细胞总RNA，反转录成cDNA。按照FastStart Universal SybrGreen Master(ROX)试剂盒操作说明书加入检测体系，利用实时定量PCR检测相关基因的表达。每基因设4个复孔(技术性重复)。PCR反应条件： 95 ℃预变性2 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共循环40次；每组实验重复3次，内参为GAPDH。引物序列见表1。

Western blot检测NOD样受体蛋白3相关分子蛋白表达：刺激完成后，PBS清洗细胞3遍，RIPA裂解液提取总蛋白。采用BCA法测定蛋白浓度并配平，使各组样品浓度一致。100 ℃水浴孵育5 min使蛋白变性。等体积上样，进行SDS蛋白电泳；电泳结束后，PVDF膜湿式转膜，电流 300 mA，时间110 min。转膜完成后， 5%脱脂牛奶室温封闭1 h。TBST冲洗后，分别加入anti-NOD样受体蛋白3一抗稀释液(1∶1 000)和anti-Caspase-1一抗稀释液(1∶500)，4 ℃孵育过夜；TBST冲洗3次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗稀释液(1∶500)，室温孵育1 h。ECL化学荧光成像检测蛋白表达。
ELISA检测白细胞介素1β分泌水平：刺激结束后，收集各组细胞培养液上清，利用人白细胞介素1β ELISA试剂盒检测白细胞介素1β质量浓度，严格按照试剂盒说明书操作，比较各实验组白细胞介素1β分泌水平。
1.6 统计学分析实验数据收集整理后，使用SPSS15.0软件进行统计分析，通过one-way analysis of variance (ANOVA)进行差异显著性分析，组间比较采用Lsd-t检验，检验水准取α=0.05。

讨论

很多促炎信号通路如Toll样受体配体所触发的促炎信号等，都会影响炎症小体的活性并对细胞内白细胞介素1β前体的表达水平起着重要的调节作用[9]。正因为如此，检测炎症体激活的实验方案常包括一个“准备”步骤，即用Toll样受体激动剂(如脂多糖)或促炎细胞因子(如肿瘤坏死因子)对细胞进行刺激，然后再加入激动剂(如ATP)对炎症体进行“活化”[14-17]。有研究发现，尽管在没有这一“准备”步骤存在的情况下，有时同样可以观察到炎症体依赖的Caspase-1激活，但是白细胞介素1β的分泌常常检测不到，这是因为绝大多数细胞并不是持续表达白细胞介素1β前体。促炎信号如脂多糖或肿瘤坏死因子可以激活转录因子核因子κB使白细胞介素1β启动子激活，从而诱导白细胞介素1β前体的产生[18]。尽管“准备”步骤主要是为了诱导产生白细胞介素1β前体，但同时也潜在增强了NOD样受体蛋白3炎症体的活性，因为转录因子核因子κB的激活同样上调NOD样受体蛋白3的表达水平[12]。脂多糖通过TLR4/MyD88/NF-κB信号通路上调NOD样受体蛋白3和白细胞介素1β前体示意图，见图4。

脂多糖是革兰阴性菌细胞壁主要成分，其作用是诱导NOD样受体蛋白3和白细胞介素β前体的表达[19]。ATP通常由死亡细胞释放，其作用是激活NOD样受体蛋白3炎症体[20]。据文献报道，当龋坏发展到牙髓-牙本质界时，革兰阴性菌成为菌群中的优势菌[21]，因此实验选择使用脂多糖+ATP激活牙髓成纤维细胞中NOD样受体蛋白3炎症体，以模拟牙髓炎症环境。
实验发现，在脂多糖刺激的诱导下牙髓成纤维细胞中白细胞介素1β表达水平显著升高，与此同时，NOD样受体蛋白3和Caspase-1的表达水平也显著提升。由于脂多糖是Toll样受体4的特异性配体，Toll样受体4信号通路在此过程中参与NOD样受体蛋白3炎症体的转录调节。经典的Toll样受体4信号通路包括髓样分化因子88依赖和β干扰素TIR结构域衔接蛋白依赖两条。髓样分化因子88依赖的信号通路通过活化肿瘤坏死因子受体相关因子6进而激活核因子κB抑制剂的激酶IKKs，后者促使核因子κB的抑制物——IκB磷酸化；泛素连接酶复合物能识别磷酸化的IκB并使之降解，解除了对核因子κB的抑制并使之入核、启动相关细胞因子的转录[22-25]。β干扰素TIR结构域衔接蛋白依赖的信号通路主要功能是诱导干扰素β的产生：通过活化肿瘤坏死因子受体相关因子3激活两种IKK相关激酶，IKK-i和TBK1，后两者可使干扰素调节因子3和干扰素调节因子7发生磷酸化，并以二聚体的形式入核诱导干扰素β的产生以及干扰素β可诱导基因的表达；与此同时，β干扰素TIR结构域衔接蛋白同样可以激活肿瘤坏死因子受体相关因子6，与髓样分化因子88依赖的信号通路一样肿瘤坏死因子受体相关因子6被激活后，可激活IKKs进而激活核因子κB[26-29]。因此，实验利用特异性抑制剂阻断Toll样受体4信号通路，观察目的基因的表达水平变化。
CLI-095是一种Toll样受体4特异性抑制剂，其与Toll样受体4的结合位点位于胞内结构域，一旦与之结合就会阻断下游信号通路。Pepinh-MYD是一种多肽，可以竞争性结合髓样分化因子88的TIR结构域，阻碍髓样分化因子88与Toll样受体的结合。Bay 11-7082是IκBα 磷酸化抑制剂，抑制了IκBα的磷酸化就抑制了IκBα的降解，因此使转录因子核因子κB始终处于静息状态。实验结果证明，在脂多糖刺激过程中，以上3种抑制剂均可有效抑制NOD样受体蛋白3和白细胞介素1β表达水平的上调，证明Toll样受体4、髓样分化因子88、核因子κB信号通路对两种基因具有转录调节作用。
实验还发现，尽管在脂多糖刺激时Caspase-1表达水平上调，但仅有CLI-095对其有显著的抑制作用，而Pepinh-MYD和Bay 11-7082并不能抑制其表达水平的上调，说明尽管Caspase-1表达水平与NOD样受体蛋白3和白细胞介素1β表达水平同时上调，但起调节作用的信号通路却不同。Toll样受体4抑制剂CLI-095对Caspase-1表达有显著的抑制作用，说明引起Caspase-1表达水平升高的信号仍是由Toll样受体4触发的，可能的解释有2种：一是Toll样受体4触发的β干扰素TIR结构域衔接蛋白依赖信号通路可能参与其表达的调控；二是Toll样受体之间甚至是模式识别受体PRRs之间具有非常密切且目前尚不完全清楚的cross-talk，可能是Toll样受体4信号通路激活其他Toll样受体或者模式识别受体PRR，由后者完成对Caspase-1的转录调节，具体的机制有待进一步的研究。
实验初步证明脂多糖刺激通过TLR4/MyD88/NF-κB信号通路上调牙髓成纤维细胞内NOD样受体蛋白3和白细胞介素1β前体的表达，然而Caspase-1的具体转录调节机制及髓样分化因子88依赖的信号通路和β干扰素TIR结构域衔接蛋白依赖的信号通路之间是否存在一定的“串话”机制，尚有待与进一步研究。
脂多糖刺激通过TLR4/MyD88/NF-κB信号通路上调牙髓成纤维细胞内NOD样受体蛋白3和白细胞介素1β的表达，Caspase-1的转录调节机制尚有待进一步研究。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

炎症环境下牙髓成纤维细胞中NOD样受体蛋白3炎症体相关分子表达的调节

Regulating the expression of nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3 inflammasome-related molecules in dental pulp fibroblasts under inflammation

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