骨髓间充质干细胞可减轻脑卒中缺血周围皮质小胶质细胞过度激活引起的脑损伤

doi:10.12307/2022.555

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (24): 3790-3795.doi: 10.12307/2022.555

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骨髓间充质干细胞可减轻脑卒中缺血周围皮质小胶质细胞过度激活引起的脑损伤

颜南1，伍彦龙2，唐晓慧2，张笑妍2，王慧2，杨天泽2，周懋淳2，王正东3，杨晓霞1

沈阳医学院，1医学应用技术学院，2基础医学院，3解剖学教研室，辽宁省沈阳市 110034

收稿日期:2021-02-25 接受日期:2021-04-10 出版日期:2022-08-28 发布日期:2022-01-22
通讯作者: 杨晓霞，硕士，教授，沈阳医学院医学应用技术学院，辽宁省沈阳市 110034
作者简介:颜南，女，1978年生，辽宁省营口市人，汉族，2018年中国医科大学毕业，博士，副教授，主要从事神经损伤与修复研究。
基金资助:
国家自然科学基金青年科学基金项目(81803200)，项目负责人：颜南；辽宁省科学技术计划项目(2017225059)，项目负责人：杨晓霞；2020年度沈阳市中青年科技创新人才支持计划(RC200238)，项目负责人：颜南；沈阳医学院科学研究基金(20161009)，项目参与人：王正东

Bone marrow mesenchymal stem cells may alleviate brain damage caused by the microglial overactivation in the cortex around ischemic site of stroke

Yan Nan1, Wu Yanlong2, Tang Xiaohui2, Zhang Xiaoyan2, Wang Hui2, Yang Tianze2, Zhou Maochun2, Wang Zhengdong3, Yang Xiaoxia1

1School of Medical Applied Technology, 2Basic Medical College, 3Department of Anatomy, Shenyang Medical College, Shenyang 110034, Liaoning Province, China

Received:2021-02-25 Accepted:2021-04-10 Online:2022-08-28 Published:2022-01-22
Contact: Yang Xiaoxia, Master, Professor, School of Medical Applied Technology, Shenyang Medical College, Shenyang 110034, Liaoning Province, China
About author:Yan Nan, MD, Associate professor, School of Medical Applied Technology, Shenyang Medical College, Shenyang 110034, Liaoning Province, China
Supported by:
the Youth Science Fund Project of National Natural Science Foundation of China, No. 81803200 (to YN); Science and Technology Program Project of Liaoning Province, No. 2017225059 (to YXX); Youth Science and Technology Innovation Talent Support Program of Shenyang in 2020, No. RC200238 (to YN); Scientific Research Fund of Shenyang Medical College, No. 20161009 (to WZD)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
缺血性脑卒中：是由于心脑血管系统发生病变或损伤，产生的斑块或栓子进入血液，导致脑部血流中断，大脑无法获取营养和氧气而引发的脑组织结构和功能严重损伤的一种急性脑血管疾病，具有高死亡率、高致残率的特点。
小胶质细胞：是神经胶质细胞的一种，参与中枢神经系统的稳态保护和宿主对病原体的防御。近年来，人们认识到小胶质细胞在脑损伤后具有双重作用，一方面在脑损伤周围皮质小胶质细胞会迅速激活，通过吞噬作用清除细胞碎片，并释放神经生长及抗炎因子而减轻神经损伤，促进组织修复；另一方面，小胶质细胞过度活化后可释放高水平的促炎因子及细胞毒性物质，诱发神经炎症，加重对大脑周围皮质的损伤作用。

背景：骨髓间充质干细胞移植治疗缺血性脑卒中取得了较好效果，但其作用机制仍需进行深入研究。
目的：探讨骨髓间充质干细胞对缺血周围皮质过度活化的小胶质细胞损伤的影响。
方法：将30只8周龄的SD大鼠分为假手术组、模型组、移植组。模型组和移植组采用栓线法阻断大脑中动脉，建立大鼠缺血性脑卒中模型，术后将第3代骨髓间充质干细胞注入到移植组大鼠腹腔内，模型组和假手术组大鼠腹腔内注射相同量的DMEM培养液，各组均隔天注射1次，共持续14 d。术后第7，14天，通过BBB法来评估各组大鼠的运动功能，术后15 d取大鼠脑梗死灶周围皮质并应用免疫组织化学染色法、蛋白印迹法检测活性小胶质细胞标志物Ox-42以及促炎因子肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、白细胞介素1β的表达。
结果与结论：与假手术组相比，模型组小胶质细胞激活的Ox-42和肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、白细胞介素1β表达水平较高，移植组上述指标表达水平较低。与模型组相比，移植组BBB评分明显提高，肢体运动功能有所改善。结果表明，骨髓间充质干细胞抑制梗死灶周围小胶质细胞的过度活化，降低了炎性细胞因子的表达，从而在一定程度上保护了大脑皮质免受伤害，促进了运动功能的恢复。

https://orcid.org/0000-0002-8250-8080 (杨晓霞)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 骨髓间充质干细胞, 缺血性脑卒中, 肿瘤坏死因子α, 白细胞介素6, 白细胞介素1β, Ox-42

Abstract: BACKGROUND: Bone marrow mesenchymal stem cell transplantation has achieved good results in the treatment of ischemic stroke, but its mechanism of action still needs to be studied in depth.
OBJECTIVE: To study the effects of bone marrow mesenchymal stem cells on further damage of overactivated microglia in the cortex around ischemic site.
METHODS: Thirty 8-week-old Sprague-Dawley rats were divided into sham operation, model, and transplantation groups. The ischemic stroke models of rats were established with blocking the middle cerebral artery with an embolic thread method for the model group and transplantation group. The third generation of bone marrow mesenchymal stem cells was injected into the abdominal cavity of the transplantation. Rabbits of the model group and the sham operation group were injected with the same amount of DMEM. The injection was taken on every other day after surgery for 14 consecutive days. The motor function of paralyzed rats in different groups was evaluated by BBB scores at 7 and 14 days after surgery. At 15 days after operation, the cortex around the cerebral infarction was taken from the rats. Immunohistochemical staining and western blot assay were applied to study the expression of Ox-42, a marker of activated microglia, and tumor necrosis factor-α, interleukin-6, and interleukin-1β in the cortex near the ischemia cortex.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the sham operation group, expression levels of Ox-42 activated by microglia and tumor necrosis factor-α, interleukin-6, and interleukin-1β were higher in the model group, and decreased in the transplantation group. Compared with the model group, BBB scores showed an improved motor function of paralysis limbs in the transplantation group. It is concluded that the over-activation of microglia is inhibited, and the expression of inflammatory cytokines is decreased with bone marrow mesenchymal stem cells, thus to protect the cerebral cortex from damaging and promote motor function recovery to a certain extent.

Key words: stem cells, bone marrow mesenchymal stem cells, ischemic stroke, tumor necrosis factor-α, interleukin-6, and interleukin-1β, Ox-42

中图分类号:

颜南, 伍彦龙, 唐晓慧, 张笑妍, 王慧, 杨天泽, 周懋淳, 王正东, 杨晓霞. 骨髓间充质干细胞可减轻脑卒中缺血周围皮质小胶质细胞过度激活引起的脑损伤[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(24): 3790-3795.

Yan Nan, Wu Yanlong, Tang Xiaohui, Zhang Xiaoyan, Wang Hui, Yang Tianze, Zhou Maochun, Wang Zhengdong, Yang Xiaoxia. Bone marrow mesenchymal stem cells may alleviate brain damage caused by the microglial overactivation in the cortex around ischemic site of stroke[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(24): 3790-3795.

图/表（结果） 6

2.1 骨髓间充质干细胞培养与鉴定结果接种2 d后，细胞开始贴壁生长，见图1A；3 d后镜下可见许多梭形细胞，见图1B；4 d或5 d出现分散的细胞集落，见图1C，D；6 d后梭形细胞充满培养瓶底部，7 d后大多数细胞融合。免疫组化染色显示，超过95%的细胞呈CD29阳性染色，见图1E，F。

2.2 实验动物数量分析根据Zea Longa评分评估大鼠瘫痪肢体的运动功能。模型组和移植组大鼠苏醒后对侧肢体瘫痪，无法站立或不稳定地向前移动，抬起尾巴时身体转向一侧。假手术组大鼠均为0级，其余两组8只大鼠为2级，12只大鼠为3级，均进入结果分析。
2.3 各组大鼠BBB评分术后，模型组和移植组大鼠对侧肢体立即瘫痪，BBB评分为0。术后第1周末，模型组和移植组大鼠关节运动次数、运动负荷、伸展范围以及前后肢的协调程度都有一定程度的改善，BBB评分也逐渐升高，移植组与模型组之间的BBB评分无显著差异(P > 0.05)，但是移植组与模型组的BBB评分显著低于假手术组(P < 0.001)；术后第2周末，移植组BBB评分明显高于模型组(P < 0.01)，移植组和模型组的BBB评分仍低于假手术组(P < 0.001)，见图2。

2.4 苏木精-伊红染色结果假手术组皮质神经元正常，神经纤维未见异常，观察到少量神经胶质。模型组大鼠皮质结构不清楚，液化坏死溶解，结构规则破坏，炎症细胞浸润，可见部分胶质细胞，神经元数量减少，一些神经元的细胞核变小，而胞质肥大，细胞质明显减少，小血管和毛细血管充血、水肿、渗出。移植组皮质神经元的形态和结构正常，神经细胞分布相对均匀，可以看到细胞核和丰富的细胞质，在血管周围仍有一些炎症细胞，见图3。

2.5 免疫组化染色结果与假手术组相比，造模后小胶质细胞活化的特异性标志物Ox-42蛋白表达水平显著增加(P < 0.05)，移植组Ox-42蛋白表达水平显著低于模型组(P < 0.01)。模型组肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、白细胞介素1β的表达水平明显高于假手术组(P < 0.001)，移植组肿瘤坏死因子α、白细胞介素6的表达水平明显低于模型组(P < 0.05)，移植组白细胞介素1β的表达水平与模型组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图4。

2.6 免疫印迹结果造模后小胶质细胞被激活，与假手术组相比，模型组Ox-42蛋白表达水平显著增加(P < 0.001)，移植组Ox-42蛋白表达水平显著低于模型组(P < 0.01)。模型组大脑皮质中激活的小胶质细胞会影响炎症因子的表达。模型组肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、白细胞介素1β的表达水平明显高于假手术组(P < 0.001)，移植组肿瘤坏死因子α、白细胞介素6的表达水平明显低于模型组(P < 0.01)，移植组白细胞介素1β的表达水平与模型组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图5。

2.7 生物相容性各组大鼠均未出现过敏反应、免疫反应及排斥反应，说明骨髓间充质干细胞具有良好的生物相容性。

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引言

缺血性脑卒中是由于急性脑血管阻塞，导致脑组织缺血，从而使脑组织结构和功能严重受损，具有高死亡率、高致残率的特点，是脑卒中最常见的一类。随着生活水平的提高，并伴随生活压力的增大，脑卒中发病越来越有年轻化的趋势。因此，探讨缺血性脑卒中的病因和机制并研究出良好的治疗方法很有必要。缺血性脑卒中的病理生理学机制涉及能量代谢紊乱、免疫和炎症反应[1]、细胞凋亡[2]、离子失衡和血脑屏障破坏[3]。在中枢神经系统疾病中，小胶质细胞是产生炎症的关键细胞，参与中枢神经系统的稳态保护和宿主对病原体的防御。近年来，人们认识到小胶质细胞在脑损伤后具有双重作用，一方面在脑损伤周围皮质小胶质细胞会迅速激活，通过吞噬作用清除细胞碎片，并释放神经生长及抗炎因子而减轻神经损伤，促进组织修复[4-5]；另一方面，小胶质细胞过度活化后可释放高水平的促炎因子及细胞毒性物质，诱发神经炎症，加重对大脑周围皮质的损伤作用[6]。
骨髓间充质干细胞具有无免疫应答、体外培养增殖快、多能分化等优点[7-9]，治疗多种疾病均有良好的疗效[10-14]。许多研究发现骨髓间充质干细胞直接移植入脑内治疗脑缺血，可有效减少缺血半暗带的细胞凋亡，促使脑部周围干细胞、祖细胞的增殖与分化，改善脑缺血动物的神经功能缺失症状。该研究拟建立大脑中动脉梗死模型，通过腹腔注射移植骨髓间充质干细胞后进行动物模型的行为学和生物分子分析，旨在探讨腹腔内移植骨髓间充质干细胞对脑卒中缺血周围皮质小胶质细胞过度激活引起的脑皮质损伤的保护作用。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，多组间比较采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2019年3-7月在沈阳医学院实验动物中心、中心实验室和公共卫生实验中心完成。
1.3 材料 2只健康SD大鼠(1周龄，体质量15-25 g，雄性)分离培养骨髓间充质干细胞和30只SD大鼠(8周龄，体质量210-310 g，雄性)制作缺血性脑卒中模型，由辽宁长生生物技术有限公司提供，动物生产许可证号：SCXK(辽)2015-0001。该研究获得沈阳医学院实验动物福利伦理委员会的批准(许可证号：SYYXY2019030601)。大鼠自由进食和饮水，饲养温度26-28 ℃，相对湿度为40%-60%。常规饮食适应性喂养1周后，将30只SD大鼠随机分为3组：假手术组、模型组和移植组，每组10只。
1.4 实验方法
1.4.1 分离和培养骨髓间充质干细胞通过全骨髓贴壁方法分离并培养骨髓间充质干细胞。颈椎脱位处死2只SD大鼠，浸入体积分数75%乙醇中3 min，在无菌条件下分离大鼠双侧股骨和胫骨，去除附着于骨表面的软组织，切除骨骺端，用DMEM培养液(Hyclone)冲洗骨髓腔，直至骨髓腔变白。收集细胞冲洗液，过200目筛网制成单细胞悬液，移入15 mL离心管，1 000 r/min离心5 min，将细胞沉淀重悬于 5 mL含体积分数10%胎牛血清的新鲜DMEM完全培养基，然后轻轻吹打制成单细胞悬液，接种到25 cm2培养瓶，置于37 ℃、体积分数为5%CO2培养箱，每隔24 h用相差显微镜观察1次，当细胞融合至85%左右时，用2.5 g/L胰蛋白酶/ 0.02%EDTA
(Genview)消化传代，在显微镜下观察大多数细胞收缩变圆时用DMEM完全培养基终止消化，用第3代细胞进行以下实验。
1.4.2 骨髓间充质干细胞的鉴定将生长至80%的第3代骨髓间充质干细胞用40 g/L多聚甲醛固定30 min，在室温下用1%TritonX-100处理10 min，PBS清洗3遍，用蜡笔描绘细胞，加入1滴内源性过氧化物酶阻断剂室温孵育10 min，加入1滴非特异性阻断剂室温孵育10 min，加入兔抗小鼠CD29抗体(ABclonal)，4 ℃湿盒中孵育过夜，加入生物素标记的羊抗兔IgG二抗，室温孵育1 h，PBS冲洗3次，加入链霉素抗生物素蛋白过氧化物酶室温孵育10 min，PBS冲洗3次，DAB显色，苏木精对细胞核进行染色，1%盐酸乙醇分化几秒钟，用流水冲洗至蓝色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封固，显微镜下观察。
1.4.3 大脑中动脉梗死模型制备及骨髓间充质干细胞移植腹腔注射戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉SD大鼠，大鼠颈前部剃毛，皮肤消毒，沿着颈部正中线切开浅筋膜和气管前肌，然后将肌肉和筋膜与右胸锁乳突肌一起钝性分离，使其暴露出右颈总动脉，操作过程中小心分离伴随的迷走神经，分离到右颈总动脉分叉时，结扎右颈总动脉的近心端和颈外动脉的起始处，并夹闭颈内动脉阻断血流以控制剪开右颈总动脉后血液反流，并在靠近右颈总动脉分叉处，距离分叉点约为4 mm用眼科剪将右颈总动脉的近端剪成45°倾斜的开口，从开口处将线栓插入右颈总动脉，当线栓顶点接近颈内动脉时，松开颈内动脉血管夹，然后将线栓慢慢插入距右颈总动脉分叉约18 mm的大脑中动脉并结扎，逐层缝合伤口。术后将大鼠放在干燥的笼子里，注意呼吸道通畅，防止窒息。术后约1 h，移植组腹腔内注射细胞浓度为1×1010 L-1的第3代骨髓间充质干细胞3 mL，模型组和假手术组术后约1 h注射等体积的DMEM，各组均隔天注射，共持续14 d。
采用Zea Longa的6级评分方法筛选出正常可参与实验的大鼠，剔除不合格大鼠[15]。Zea Longa的6级评分方法分级标准为：0级，无神经缺陷症状；1级，不能完全伸展到对侧前肢；2级，行走时向偏瘫侧转圈；3级，行走时向偏瘫侧倾倒；4级，不能自发行走，伴随意识障碍；5级，死亡，其中1-3级大鼠可纳入实验。造模成功率约为 77% (23/30)，死亡率为 23% (7/30)，死亡大鼠以新鼠补充，确保每组实验动物总数相等。
1.4.4 运动功能评估术后7 d根据BBB功能评定量表评估3组大鼠四肢运动功能[16]，根据关节运动的频率、范围和运动负荷对大鼠四肢运动功能进行评分。0分为完全瘫痪，21分为运动功能正常，并由2名独立的技术人员根据BBB评定量表观察肢体的协调性，使用双盲法评估。
1.4.5 样本采集术后15 d SD大鼠腹膜内注射戊巴比妥钠(100 mg/kg)麻醉处死，一部分脑组织转移至-80 ℃冰箱保存备用；另一部分脑组织浸泡在40 g/L多聚甲醛中固定，置于4 ℃冰箱中保存固定2 d备用。
1.4.6 苏木精-伊红染色取出40 g/L多聚甲醛固定好的脑组织，切取梗死灶旁0.5 cm的大脑皮质，浸入30%蔗糖溶液中浸泡48 h，直至组织沉底，然后用OCT包埋剂包埋，将其放在冷冻切片机(Leica)的样品架上，快速冷冻至-20 ℃，切成厚度为8-15 μm的切片，在37 ℃烘箱中干燥，苏木精染色5 min，流水洗涤，1%盐酸乙醇分化30 s，流水冲洗10 min，伊红染色1 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封固，显微镜下观察。
1.4.7 免疫组化实验取出40 g/L多聚甲醛固定好的脑组织，切取梗死灶旁0.5 cm的大脑皮质，大脑皮质切片的处理步骤与苏木精-伊红染色相同，PBS冲洗切片3次，加入内源性过氧化物酶阻断剂室温孵育10 min，PBS冲洗3次，加入非特异性染色阻断剂室温孵育10 min，去除阻断剂，加入肿瘤坏死因子α(1∶1 000，ABclonal)、白细胞介素6(1∶1 000，ABclonal)、白细胞介素1β(1∶1 000，ABclonal)、Ox-42(1∶1 000，Abcam)一抗，4 ℃孵育过夜，阴性对照不加抗体，PBS漂洗3次，加入生物素标记的羊抗兔IgG，室温孵育40 min，加入链霉素抗生物素蛋白过氧化物酶室温孵育1 h，PBS漂洗5次，DAB染色10 min，切片浸泡于蒸馏水中洗涤后苏木精染色，1%盐酸乙醇分化数秒钟，用流水冲洗至蓝色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封固，显微镜下观察阳性细胞，在100×镜下随机选取5个视野，Image J图像分析软件定量测定每个视野区域内阳性表达的平均吸光度值。
1.4.8 免疫印迹实验取出-80 ℃冰箱保存的脑组织，切取梗死灶旁0.5 cm的大脑皮质，提取蛋白，按照每100 mg 组织加入1 mL裂解液的比例加入含有PMSF的 RIPA裂解液，匀浆后4 ℃静置2 h使其充分裂解，在4 ℃条件下12 000 r/min离心8 min，取上清，采用Bradford蛋白检测试剂盒对蛋白定量。将蛋白浓度调节至4 g/L，在100 ℃加热器中变性8 min，轻微离心后储存于-20 ℃。制备12%SDS-PAGE，加入缓冲液，100 V电压分离约2 h，将PVDF膜浸入甲醇中激活30-60 s，然后转入转膜缓冲液中平衡5 min，运行100 V电压1 h；PVDF膜用5%脱脂奶粉在摇床上室温封闭2 h，PBST洗膜3遍，加入一抗肿瘤坏死因子α(1∶1 500，ABclonal)、白细胞介素6(1∶1 000，ABclonal)、白细胞介素1β(1∶1 000，ABclonal)、Ox-42(1∶1 000，Abcam)，ACTB(1∶100 000，ABclonal)，4 ℃孵育过夜，PBST冲洗3次，每次15 min，加入辣根过氧化物酶偶联的羊抗兔IgG抗体(1∶500，ABclonal)，室温孵育1 h，PBST冲洗4次，每次10 min，用高灵敏度ECL化学发光检测试剂盒对蛋白条带进行可视化，多荧光图像分析系统(Tanon 5200)进行扫描，使用Image J软件对蛋白条带进行灰度分析。
1.5 主要观察指标 ①Zea Longa 6级评分方法筛选动物模型大鼠，根据BBB评定量表使用双盲法评估观察肢体的协调性；②苏木精-伊红染色观察各组海马区微细结构变化；③免疫组化染色检测各组炎症因子和小胶质细胞活化标志蛋白的表达部位；④Western blot检测各组炎症因子和小胶质细胞活化标志蛋白的表达量。
1.6 统计学分析应用SPSS 20.0软件进行数据统计分析，统计图使用GraphPad Prism 6.0绘制。计量数据以x±s表示，用单因素方差分析进行多组间比较。当方差齐时，用Bonferroni检验进行显著性分析；当方差不齐时，用Dunnett’sT3检验进行显著性分析。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

小胶质细胞是中枢神经系统中最小的一种胶质细胞，其胞体小、胞质少、形状细长或椭圆形、分支细小，主要分布在皮质、海马、嗅叶、白质中，占5%-20%，是中枢神经系统的第一道且重要的免疫防御线[17]。小胶质细胞通常处于静止状态，具有胞吞和迁移能力，并监视大脑微环境的变化，识别和去除入侵的病原微生物和外来细胞，迅速消除中枢神经系统中受损的神经元，保持动态平衡并参与宿主的免疫防御[18]。当发生缺血性损伤或炎症刺激时，静止的小胶质细胞会迅速活化，从分支状转化为变形虫样，并具有细胞吞噬、抗原提呈、产生氧自由基、细胞因子和生长因子等功能[19-20]。在该研究中，缺血后小胶质细胞特异性标记物Ox-42的表达水平显著增加，表明小胶质细胞被激活。
活化的小胶质细胞具有双重作用，一方面，吞噬性小胶质细胞去除神经元碎片，并分泌各种抗炎因子来修复神经组织；另一方面，小胶质细胞释放出多种促炎因子和细胞毒性物质[17，21-22]。许多研究表明，当发生缺血性脑卒中时，靠近缺血皮质的小胶质细胞会从静止状态(M0型)变为激活状态(M1型或M2型)[23-24]。M1型小胶质细胞发挥促炎和细胞毒性作用，抑制细胞体轴突分支的生长；另外，经典激活的 M1型小胶质细胞通过脂多糖、γ 干扰素及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的诱导[25]，刺激分泌白细胞介素1β、白细胞介素6、白细胞介素12、肿瘤坏死因子α、干扰素γ和其他促炎因子，加速对神经组织的炎症反应损害[26-27]。M2型小胶质细胞抑制过度的炎症反应，促进受损神经元的存活，减少瘢痕的发生，分泌白细胞介素4、白细胞介素10、白细胞介素13、转化生长因子β等抗炎因子，抑制过度的炎症反应，增强吞噬功能[27]。因此，抑制小胶质细胞的M1型活化为促炎性，将活化的M2型转化为抗炎性，以及从M1型转变为M2型可以减少缺血性脑卒中后炎症对神经元的损害[28]。免疫组织化学和蛋白印迹结果表明，周围缺血的小胶质细胞过度活化，并且还增加了大脑皮质炎性因子肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、白细胞介素1β的表达。
肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、白细胞介素1β是介导炎性反应发生的必要因素，是促炎性细胞因子。在生理条件下，细胞因子参与脑损伤修复和自身免疫过程。在病理状态下，自分泌或协同其他细胞因子产生大量炎性细胞因子。肿瘤坏死因子α主要由巨噬细胞和T淋巴细胞产生，与免疫防御、炎症反应和其他具有广泛生物学特性的多肽细胞因子有关。肿瘤坏死因子α可以激活小胶质细胞并诱导黏附因子和趋化因子的高表达，促进炎性细胞的迁移，这是导致缺血性脑卒中神经元损伤的关键因素。高水平肿瘤坏死因子α导致内皮细胞功能受损，并使周围的炎症细胞通过血脑屏障，促进炎症反应，进一步加重对血脑屏障的损害。在该研究中，肿瘤坏死因子α的表达增加导致运动功能受损，这可能是脑缺血损伤进一步损害中枢神经系统的因素之一[29]。缺血后大脑皮质小胶质细胞激活诱导了白细胞介素6和白细胞介素1β的表达。白细胞介素1β是介导免疫和炎症级联反应的重要因子，与其他细胞因子相互作用，促进脑缺血后B细胞和T细胞活化；白细胞介素1β过表达也可促进其他炎症因子，例如肿瘤坏死因子α、白细胞介素6进一步加重对大脑的伤害[30]。在生理条件下，缺血后大脑皮质中白细胞介素1β的表达相对较低，并在高度致敏时大量增加，引起Ca2+超负荷并刺激内皮细胞表达白细胞黏附因子，增加了缺血皮质的神经毒性[31]。白细胞介素1β还可以激活大脑中的巨噬细胞和内皮细胞产生多种活性物质，从而加剧继发性脑损伤。骨髓间充质干细胞抑制小胶质细胞的过度活化并抑制炎性因子释放，这可以减少对中枢神经系统的伤害程度。
骨髓间充质干细胞发挥的神经保护作用尚未完全了解，几种可能的机制如下：首先，骨髓间充质干细胞可以通过抑制炎症性免疫反应来减少神经毒性物质对中枢神经系统的损害[12]；其次，骨髓间充质干细胞可能分泌大量神经保护因子，以启动中枢神经系统的内源性修复机制，并防止神经组织变性[32]；第三，骨髓间充质干细胞可能通过血脑屏障迁移至病变区域，然后分化为脑细胞，从而取代功能障碍的神经元[33]，这种转分化作用较弱，因为最终到达皮质的骨髓间充质干细胞数量很少。研究表明，小胶质细胞的活化与皮质损伤有关，而骨髓间充质干细胞可能会抑制其过度活化，从而在一定程度上保护大脑皮质免受伤害。
NF-κB是广泛存在于神经元和神经胶质细胞中的转录因子。在生理条件下，NF-κB及其特异性抑制剂IκB抑制其转录功能；当发生缺血性脑卒中时，小胶质细胞释放多种因子，例如肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、白细胞介素1β，激活NF-κB途径，然后激活核内基因并在NF-κB进入细胞核之后产生相应的mRNA[34]，促进更多炎性细胞因子的合成和释放，引起一系列炎症反应[35]。因此，NF-κB在缺血性脑卒中后的炎症反应中起着至关重要的作用，骨髓间充质干细胞可能通过干预NF-κB信号通路，抑制小胶质细胞释放一氧化氮、前列腺素E2、白细胞介素1β和白细胞介素6，减少了促炎递质的产生[36]，从而对脑组织起保护作用[22]。
炎症反应是缺血性脑卒中损伤的重要病理因素，其病理变化持续时间长[37]，而脑卒中后神经炎症是影响长期预后的重要因素[38]，与其机制及信号转导相关的因素很多，尚需进一步研究。实验动物与人类之间的免疫系统不同，影响脑损伤的关键因素有待进一步研究，另外，需要更先进的技术和更全面的检测方法来研究预防和保护缺血性脑血管疾病的作用机制。
该实验使用的是第3代骨髓间充质干细胞，并且没有对其他代数细胞进行系统和深入的研究，也没有设置不同细胞数量进行对比。另外，结果仅设置一个时间点，没有对多个时间点进行深入的动态检测，无法获得动态表达的趋势。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

骨髓间充质干细胞可减轻脑卒中缺血周围皮质小胶质细胞过度激活引起的脑损伤

Bone marrow mesenchymal stem cells may alleviate brain damage caused by the microglial overactivation in the cortex around ischemic site of stroke

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