补肾健脾活血方干预骨质疏松模型大鼠骨代谢、氧化应激及自噬的变化

doi:10.12307/2022.816

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (26): 4147-4152.doi: 10.12307/2022.816

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补肾健脾活血方干预骨质疏松模型大鼠骨代谢、氧化应激及自噬的变化

米健国1，乔荣勤2，刘少津3

1广东江门中医药职业学院，广东省江门市 529000；2广州中医药大学第三附属医院，广东省广州市 510240；3广州中医药大学，广东省广州市 510405

收稿日期:2020-12-24 接受日期:2021-03-03 出版日期:2022-09-18 发布日期:2022-03-07
通讯作者: 刘少津，硕士，医师，广州中医药大学，广东省广州市 510375
作者简介:米健国，男，1978年生，吉林省洮南市人，汉族，2006年贵阳中医学院毕业，硕士，副教授，副主任中医师，主要从事中医药防治骨科疾病的研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(81673786)，项目参与人：乔荣勤

Bushen Jianpi Huoxue Recipe improves bone metabolism, oxidative stress, and autophagy in osteoporotic rats

Mi Jianguo1, Qiao Rongqin2, Liu Shaojin3

1Guangdong Jiangmen Chinese Medical College, Jiangmen 529000, Guangdong Province, China; 2The Third Affiliated Hospital, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510240, Guangdong Province, China; 3Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China)

Received:2020-12-24 Accepted:2021-03-03 Online:2022-09-18 Published:2022-03-07
Contact: Liu Shaojin, Master, Physician, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China
About author:Mi Jianguo, Master, Associate professor, Associate chief physician, Guangdong Jiangmen Chinese Medical College, Jiangmen 529000, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81673786 (to QRQ [project participant])

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
氧化应激：是指体内氧化与抗氧化作用失衡的一种状态，倾向于氧化，导致中性粒细胞炎性浸润，蛋白酶分泌增加，产生大量氧化中间产物。氧化应激是由自由基在体内产生的一种负面作用，并被认为是导致衰老和疾病的一个重要因素。
自噬：是一种动态的分解代谢过程，与细胞损伤、修复、增殖等密切相关，在细胞应激和环境适应中起重要作用，也是维持细胞内环境稳定性的一种保护机制。它使用溶酶体降解，恢复细胞内损伤、衰老的细胞器和生物分子，并实现蛋白质和能量更新代谢。

背景：氧化应激被认为是骨质疏松发生的最重要的始动因素之一，氧化应激除直接激活经典的线粒体和内质网凋亡途径外，还激活细胞自噬信号通路，而骨质疏松发病中成骨细胞抗氧化功能的调控机制并未被清晰阐述。
目的：探讨补肾健脾活血方改善氧化应激与自噬对骨质疏松大鼠磷脂酰肌醇3-激酶、蛋白激酶B、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白的影响。
方法：72只6月龄雌性SD大鼠随机分为假手术组24只及手术组48只，去除卵巢造模；术后3个月两组各取12只检测骨密度及血清中骨钙素、骨特异性碱性磷酸酶、Ⅰ型前胶原N端前肽、骨保护素水平。剩余手术组的36只大鼠分为模型组、补肾健脾活血方组及阿仑膦酸钠组，每组12只，药物组给予相应药物灌胃，假手术组和模型组灌胃等体积生理盐水。12周后处死各组大鼠，双能X射线法检测大鼠腰椎和股骨骨密度，ELISA法测定血清骨代谢指标及氧化应激指标，实时荧光定量PCR检测股骨组织中LC3、Beclin1、ATG5、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白的mRNA表达情况，Western blot法检测磷脂酰肌醇3-激酶、磷酸化蛋白激酶B、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白的蛋白表达情况。
结果与结论：①造模3个月及药物干预3个月后，与假手术组比较，模型组大鼠骨密度及骨保护素表达水平明显降低(P < 0.05)，骨钙素、骨特异性碱性磷酸酶、Ⅰ型前胶原N端前肽表达水平明显升高(P < 0.05)；②药物干预3个月后，与假手术组比较，模型组丙二醛、活性氧表达水平明显升高(P < 0.05)；LC3、Beclin1、ATG5的mRNA表达水平显著升高(P < 0.05)；过氧化氢酶、超氧化物歧化酶及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白mRNA、磷脂酰肌醇3-激酶、磷酸化蛋白激酶B、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白表达水平显著降低(P < 0.05)；③药物干预3个月后，与模型组比较，补肾健脾活血方组、阿仑膦酸钠组的上述指标均显著改善(P < 0.05)；④提示补肾健脾活血方能够改善绝经后骨质疏松骨代谢、氧化应激水平并抑制自噬，其机制可能和参与了磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路的调控有关。
缩略语：磷脂酰肌醇3-激酶：phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K；蛋白激酶B：protein kinase B，AKT；哺乳动物雷帕霉素靶蛋白：mammalian target of rapamycin，mTOR

https://orcid.org/0000-0001-7629-2191 (米健国)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 补肾健脾活血方, 氧化应激, 自噬, 骨代谢, PI3K/AKT/mTOR信号通路

Abstract: BACKGROUND: Oxidative stress is considered to be one of the most important initiating factors for osteoporosis. In addition to directly activating classic mitochondrial and endoplasmic reticulum apoptosis pathways, oxidative stress can also activate an autophagy signaling pathway. The regulatory mechanism underlying the antioxidant function of osteoblasts in osteoporosis has not been clearly clarified.
OBJECTIVE: To explore the effect and mechanism of Bushen Jianpi Huoxue Recipe on phosphatidylinositol 3-kinase, protein kinase B, and mammalian target of rapamycin in osteoporotic rats by improving oxidative stress and autophagy.
METHODS: Seventy-two 6-month-old female Sprague-Dawley rats were randomly divided into a sham operation group (n=24) and an operation group (n=48), in which the rat ovaries were removed to make an ovariectomized model. After 3 months, 12 rats were taken from each group for detecting bone mineral density and serum osteocalcin, bone-specific alkaline phosphatase, type I procollagen N-terminal propeptide, and osteoprotegerin levels. The remaining 36 rats in the operation group were divided into model group, Bushen Jianpi Huoxue Recipe group, alendronate vitamin D3 (II) group, with 12 rats in each group. Drug groups were given intragastric administration of corresponding drugs. Sham operation and model groups were given an equal volume of normal saline. After 12 weeks, the rats in each group were sacrificed, and the bone mineral density of the lumbar spine and femur of the rats was detected by dual energy X-ray method. ELISA method was used to measure serum bone metabolism indexes and oxidative stress indexes. Real-time fluorescence quantitative PCR was used to detect the mRNA expression of LC3, Beclin1, ATG5, and mammalian target of rapamycin in femoral tissue. Western blot assay was used to detect the protein expression of phosphatidylinositol 3-kinase, phosphorylated protein kinase B, and mammalian target of rapamycin.
RESULTS AND CONCLUSION: Three months after modeling and drug treatment, compared with the sham operation group, the bone mineral density and osteoprotegerin of the model group were significantly reduced (P < 0.05), and the expression of osteocalcin, bone specific alkaline phosphatase, and type I procollagen N-terminal propeptide were significantly increased (P < 0.05). After 3 months of drug intervention, compared with the sham operation group, the expression levels of malondialdehyde and reactive oxygen species were significantly increased in the model group (P < 0.05), the mRNA expression of LC3, Beclin1 and ATG5 was significantly increased (P < 0.05), the mRNA levels of catalase, superoxide dismutase and mammalian target of rapamycin as well as the protein expression of phosphatidylinositol 3-kinase, phosphorylated protein kinase B, and mammalian target of rapamycin were significantly reduced (P < 0.05). After 3 months of drug interventions, compared with the model group, these indicators were all improved in the Bushen Jianpi Huoxue Recipe group and alendronate vitamin D3 (II) group (P < 0.05). To conclude, Bushen Jianpi Huoxue Recipe can improve postmenopausal osteoporotic bone metabolism, oxidative stress levels and inhibit autophagy, and its mechanism may be involved in the regulation of phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B/mammalian target of rapamycin signaling pathway.

Key words: Bushen Jianpi Huoxue Recipe, oxidative stress, autophagy, bone metabolism, PI3K/AKT/mTOR signaling pathway

中图分类号:

米健国, 乔荣勤, 刘少津. 补肾健脾活血方干预骨质疏松模型大鼠骨代谢、氧化应激及自噬的变化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(26): 4147-4152.

Mi Jianguo, Qiao Rongqin, Liu Shaojin. Bushen Jianpi Huoxue Recipe improves bone metabolism, oxidative stress, and autophagy in osteoporotic rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(26): 4147-4152.

图/表（结果） 4

2.1 实验动物数量分析实验过程中麻醉意外(假手术组1只)、相互啃咬(假手术组和模型组各1只)、误吸或胃肠胀气(假手术组1只，补肾健脾活血组2只)共死亡6只，最后共42只大鼠进入结果分析。
2.2 造模后大鼠骨密度和血清骨钙素、骨特异性碱性磷酸酶、Ⅰ型前胶原N端前肽、骨保护素表达变化造模3个月后，与假手术组比较，模型组大鼠腰椎和股骨的骨密度、血清骨保护素表达水平降低(P < 0.05)，血清骨钙素、骨特异性碱性磷酸酶、Ⅰ型前胶原N端前肽表达水平升高(P < 0.05)，表明绝经后骨质疏松症大鼠模型建立成功，见表4。

2.3 药物干预后大鼠骨密度及血清骨代谢指标和氧化应激指标变化补肾健脾活血方干预绝经后骨质疏松症大鼠3个月后，与假手术组相比，模型组大鼠腰椎、股骨骨密度及血清中骨保护素、丙二醛、活性氧表达水平均显著降低(P < 0.05)，血清中骨钙素、骨特异性碱性磷酸酶、Ⅰ型前胶原N端前肽和过氧化氢酶、超氧化物歧化酶表达水平均显著升高(P < 0.05)；与模型组相比，补肾健脾活血组和阿仑膦酸钠组大鼠腰椎、股骨骨密度及血清中骨保护素、丙二醛、活性氧表达水平均显著升高(P < 0.05)，血清中骨钙素、骨特异性碱性磷酸酶、Ⅰ型前胶原N端前肽和过氧化氢酶、超氧化物歧化酶表达水平均显著降低(P < 0.05)，见表5-7。

2.4 补肾健脾活血方对骨质疏松大鼠骨组织中LC3、Beclin1、ATG5、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 mRNA表达的影响与假手术组相比，模型组大鼠骨组织中LC3、Beclin1、ATG5 mRNA表达水平显著升高(P < 0.05)，mTOR mRNA表达水平显著降低(P < 0.05)；与模型组相比，补肾健脾活血组和阿仑膦酸钠组大鼠骨组织中LC3、Beclin1、ATG5 mRNA表达水平均显著降低(P < 0.05)，mTOR mRNA表达水平升高(P > 0.05)，见表8。

2.5 补肾健脾活血方对骨质疏松大鼠骨组织中PI3K、p-AKT、mTOR蛋白表达的影响与假手术组相比，模型组大鼠骨组织中PI3K、p-AKT、mTOR的蛋白表达水平均显著降低(P < 0.05)；与模型组相比，补肾健脾活血组和阿仑膦酸钠组大鼠骨组织中PI3K、p-AKT、mTOR的蛋白表达水平均显著升高(P < 0.05)，见表9及图2。

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引言

绝经后骨质疏松症被称为“隐匿性骨骼疾病”，是一种典型的与年龄相关的骨病，其特征是随着年龄增长带来的骨量丢失、骨矿物质密度低、骨微结构恶化以及随后的骨脆性增加，其发病与许多病因有关，例如激素、细胞因子和衰老[1]。有越来越多的证据表明氧化应激可能参与骨质疏松病原体的分泌[2]，过度活性氧产生的氧化应激会损害成骨细胞中的各种细胞成分，因此氧化损伤被认为是骨质疏松症中成骨细胞形成受损的重要因素[3]。自噬是维持细胞内环境稳定性的一种保护机制，它使用溶酶体降解，恢复细胞内损伤、衰老的细胞器和生物分子，并实现蛋白质和能量的更新代谢[4]。在氧化应激下，自噬途径被证明可以区别性地清除受损的线粒体，自噬对氧化应激的保护作用已在多种细胞中发现，例如心肌细胞、成纤维细胞和成骨细胞。关键的靶向自噬调节剂可以促进成骨细胞中的自噬反应，是一种新型有效的骨质疏松症治疗策略[2]。目前氧化应激被认为是骨质疏松症发生的最重要的始动因素之一，氧化应激除直接激活经典的线粒体和内质网凋亡途径外，还激活细胞自噬信号通路，而骨质疏松症发病中成骨细胞抗氧化功能的调控机制并未清晰阐述。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信号通路参与多种细胞过程，包括细胞增殖、分化、迁移和存活，该信号通路的激活可抑制细胞自噬；相反，抑制PI3K-Akt-mTOR可诱导自噬[5]。此次研究建立骨质疏松症大鼠模型，通过中药干预，观察骨密度、骨代谢指标、氧化应激及自噬水平的变化，探讨补肾健脾活血方对绝经后骨质疏松症的影响，进而讨论其发病机制。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，单因素方差分析结合事后LSD检验。
1.2 时间及地点实验于2017年3月至2019年6月在广州中医药大学岭南医学研究中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 72只6月龄(SPF级)雌性SD大鼠，体质量(321.5±70.5) g，由广州中医药大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK(粤)2013-0034。实验方案获得广州中医药大学伦理委员会批准(编号：S2016046)。
1.3.2 药物和试剂补肾健脾活血方为广州中医药大学第三附属医院院内制剂，批件号：20170030，由补骨脂、淫羊藿、肉苁蓉、熟地、白芍、黄芪、菟丝子、丹参、当归、大枣10味中药组成，生药量 1.43 g/mL。中药制备：当归15倍量水蒸馏 1.5 h，收集约 500 mL 馏出液；药渣和另外9味中药加10倍量水煮3次，1.5 h/次，过滤，浓缩至相对密度 1.15(80 ℃热测)，冷却，pH=7；加入体积分数95%乙醇使含醇量 60%，静置 24 h，过滤，放置 24 h，过滤；滤液加入果葡糖、蒸馏液、防腐剂，蒸馏水加至 1 000 mL，调 pH =5.5，板框压滤，用垂熔玻璃器过滤，灌装，100 ℃灭菌 30 min，包装。阿仑膦酸钠维 D3片 ( Ⅱ) (杭州默沙东制药有限公司，批号：N010878 )。相关试剂来源，见表1。

1.3.3 主要仪器见表2。

1.4 实验方法
1.4.1 动物分组、造模及给药[6-8] 72只SD大鼠采用随机数字表法分为2组，假手术组24只、手术组48只。手术组背侧正中切口切除双侧卵巢造模；假手术组切除卵巢旁等体积的脂肪组织，术后肌注青霉素(8×104 U/d，维持1周)。术后3个月两组各随机取12只，检测腰椎、股骨骨密度及血清中骨钙素、骨特异性碱性磷酸酶、Ⅰ型前胶原N端前肽、骨保护素水平。手术组剩余36只分为模型组、补肾健脾活血组(2.979 g/kg补肾健脾活血方)、阿仑膦酸钠组(1.02 mg/kg阿仑膦酸钠)，分别给予相应药物灌胃，其中假手术组和模型组给予等体积生理盐水，连续3个月，1 次/d。实验流程图见图1。

1.4.2 大鼠腰椎和股骨的骨密度检测造模后3个月及药物干预3个月，于广州中医药大学第三附属医院检测大鼠骨密度，以1%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉后，采用双能X射线“小动物”模式扫描，并分析大鼠腰椎和股骨骨密度。
1.4.3 血清骨代谢指标和氧化应激指标检测造模后3个月及药物干预3个月后，各组大鼠以1%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉，腹主动脉采血3-5 mL，在4 ℃下以 3 000 r/min 离心15 min，提取血清4 ℃冰箱保存备用，按照ELISA试剂盒规范检测血清中骨钙素、骨特异性碱性磷酸酶、Ⅰ型前胶原N端前肽、骨保护素水平。比色法检测氧化应激指标，包括丙二醛、活性氧、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶。
1.4.4 实时荧光定量PCR 检测LC3、Beclin1、ATG5、mTOR mRNA的表达量药物干预3个月后各组大鼠麻醉后处死，取股骨远端松质骨，磨成粉末后，trizol法提取总RNA，在紫外分光光度仪上测定RNA浓度和纯度，按照PrimeScript RT Master Mix 说明书进行反转录反应。反应体系：2×SYBR Premix Ex Taq Ⅱ7.5 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA：2 μL，加dH2O至15 μL；95 ℃-30 s，95 ℃-5 s，60 ℃-30 s，循环42次；熔解曲线：95 ℃-10 s，65 ℃-5 s。2-ΔΔCt计算对应 mRNA 的表达量。引物序列见表3。

1.4.5 Western blot 法检测PI3K、p-AKT、mTOR蛋白表达量药物干预3个月后各组大鼠麻醉后处死，取股骨远端骨组织，在液氮中研磨成粉末后，加入200 μL细胞裂解液，冰上裂解30 min，BCA法提取总蛋白，测定浓度，上样-电泳-转膜-封闭-加入PI3K、p-AKT、mTOR一抗-二抗-TBST清洗，ECL法显影，Image J图像处理，并分析各条带灰度值。
1.5 主要观察指标 ①骨密度及血清中骨钙素、骨特异性碱性磷酸酶、Ⅰ型前胶原N端前肽、骨保护素表达的变化；②血清中氧化应激指标丙二醛、活性氧、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶表达的变化；③骨组织中自噬相关因子的表达差异。
1.6 统计学分析采用 SPSS 20.0 统计软件分析，计量资料采用x±s表示，多组间比较时，方差不齐时采用Kruskal-Wallis H非参数检验，方差齐同用单因素方差分析(one-way ANOVA)。组间多重比较，若方差齐用LSD检验，方差不齐用Dunnett’s T3检验。以P < 0.05判断为差异有显著性意义。

讨论

绝经后骨质疏松症是一种常见的系统性、代谢性骨病，据报道绝经后妇女的骨质疏松症发生率为30%-55%，是影响妇女的最普遍的变性疾病之一。随着全球人口的迅速老龄化，骨质疏松症的发病率逐年上升，继2型糖尿病和高血压之后，已成为健康老年人群的主要危险因素[9]。正常的骨代谢需要平衡骨吸收(破骨细胞活性)和骨形成(成骨细胞活性)，当骨吸收超过骨形成时，这种平衡被破坏，骨密度降低，骨脆性增加，骨代谢加快，从而骨质疏松引起的骨折发生率可能会增加[10]。目前，骨质疏松症的治疗剂包括骨质疏松症专用药物(双膦酸盐和特立哌肽)、生活因素变化(戒烟、饮食和运动)以及钙和维生素D摄入增加[11]，但是由于骨质疏松症的确切机制尚不清楚，这些抗骨质疏松症疗法并未取得令人满意的结果。因此，揭示骨质疏松症的发病机制是预防和治疗骨质疏松症的迫切问题。
绝经后骨质疏松症在传统医学上认为与“骨萎”相似，其病机为肝肾亏虚、脾肾阳虚、阴虚血瘀，病位在骨。妇女绝经后，天癸绝、肾气衰，阳气不满，阴血不足，脾气虚弱，脾肾之气无力推动阴血而致瘀；肝脾肾之气血无法滋养筋骨，故而为“骨萎”，所以补益肝肾、健脾益气、滋阴活血是治疗绝经后骨质疏松症的常用法则。补肾健脾活血方由补骨脂、淫羊藿、肉苁蓉、熟地、白芍、黄芪、菟丝子、丹参、当归、大枣组成，现代药理学研究表明，此方中含补骨脂素、淫羊藿苷、黄芪多糖、丹参酮等多种可防治骨质疏松症的有效活性成分。骨密度和骨代谢生化指标检测是诊断骨质疏松症的重要准则，骨密度可直接从宏观上反映骨的结构和脆性变化，而血清骨代谢指标则从微观上反映骨吸收与骨形成之间的平衡变化。骨钙素由成骨细胞合成分泌，沉积在骨基质中，不受骨吸收影响，可反映骨更新状况；Ⅰ型前胶原N端前肽是破骨细胞活性标志物；骨保护素是反映骨形成的关键因子，是一种由成骨细胞分泌的糖蛋白[12]；骨特异性碱性磷酸酶是反映骨形成和骨转换的特异性指标[13]。相关研究表明，此方可提升腰椎和股骨骨密度、增加最大载荷和刚度[6-8]，调控骨形态发生蛋白2/Smad、转化生长因子β1/Smads、转化生长因子β/骨形态发生蛋白2通路的信号转导，又能上调骨形态发生蛋白2、Smad2、转化生长因子β1、OPG、wnt3a、lrp5、β-catenin、Runx2等相关基因和蛋白的表达[14]；还可改善老年女性骨质疏松症患者血清骨代谢生化指标β-Ⅰ型胶原羧基端肽、N-端骨钙素和总Ⅰ型胶原氨基端延长肽的含量，从而对骨质疏松症起防治作用[15]。此次研究结果显示，补肾健脾活血方可提高绝经后骨质疏松症大鼠腰椎和股骨骨密度；增加血清中骨代谢指标骨保护素含量，降低骨钙素、骨特异性碱性磷酸酶、Ⅰ型前胶原N端前肽含量，可见这与以往应用此方防治骨质疏松症的研究相符。
氧化应激是指由于体内过度产生活性氧或清除障碍而导致组织或细胞中活性氧水平升高。丙二醛是氧化应激后脂质过氧化损伤的标志物，而过氧化氢酶、超氧化物歧化酶是体内重要的抗氧化酶，是评估氧化应激状态的可靠指标。然而，在诸如衰老和雌激素戒断的病理条件下，将产生过量的活性氧[16]。研究表明，氧化应激是各种类型骨质疏松症常见的病理基础，在不同病理过程中起着至关重要的作用。据报道，骨质疏松症患者和骨质疏松症动物模型中的活性氧水平与骨矿物质密度密切相关，活性氧含量越高、骨矿物质密度越低[17]。此次研究通过去卵巢建立绝经后骨质疏松症大鼠模型，其血清中过氧化损伤标志物丙二醛、活性氧水平升高，而抗氧化酶过氧化氢酶、超氧化物歧化酶活性降低，表明绝经后骨质疏松症大鼠氧化损伤增加，体内抗氧化酶减少，骨矿含量降低。通过补肾健脾活血方干预后，降低了血清中过氧化损伤标志物丙二醛、活性氧水平，升高了抗氧化酶过氧化氢酶、超氧化物歧化酶活性，同时也提高了大鼠骨密度和骨矿含量。万雷等[15]的研究也提示此方具有抗氧化损伤作用，能显著提高肾组织超氧化物歧化酶活性，轻度提高总抗氧化能力，降低丙二醛含量，改善患者骨密度。
自噬是一种动态的分解代谢过程，与细胞损伤、修复、增殖等密切相关，在细胞应激和环境适应中起重要作用。细胞自噬的启动由一系列自噬相关蛋白组成，例如Atg1和Atg5[18]。DESELM等[19]报道，包括Atg5，Atg7，Atg4B和LC3在内的蛋白质对于破骨细胞裂边界的产生很重要，这些边界是由分泌性溶酶体融合产生的。LC3是自噬的标志基因，敲低LC3可抑制破骨细胞的肌动蛋白环形成和组织蛋白酶K的释放[20]。自噬相关蛋白Beclin1的过表达可以部分减轻成骨细胞的氧化应激损伤，并抑制成骨细胞的凋亡[21]。mTOR通路与自噬和细胞凋亡有关，mTOR是自噬的关键调节因子，受多种途径调节[18]。在此次研究中，绝经后骨质疏松症大鼠自噬基因LC3、Beclin1、ATG5表达水平显著升高，而mTOR 基因和PI3K、p-AKT、mTOR蛋白表达水平显著降低；补肾健脾活血方干预后，降低LC3、Beclin1、ATG5表达量；提高PI3K、p-AKT、mTOR蛋白表达量，表明补肾健脾活血方可抑制自噬基因和蛋白表达水平，从而减少骨量的流失。相关研究表明，去卵巢后大鼠雌激素水平下降，骨转换速率和骨量流失加快，同时LC3、Beclin1 的表达量增加，PI3K、p-AKT、mTOR蛋白表达量降低[22]。朱伟等[23]的研究表明，抗疏强骨合剂可降低去势骨质疏松模型大鼠骨组织中自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、Beclin1、p62的表达，抑制自噬起到治疗骨质疏松症的作用。提示中药复方可降低自噬相关基因和蛋白的表达，抑制细胞自噬，从而对绝经后骨质疏松症起到防治作用，这与此次研究结果相一致。
氧化应激和自噬参与了骨代谢的全过程，氧化应激对自噬具有双向调节作用，自噬对骨代谢调控也有双重性。活性氧过多产生的氧化应激可能会损害细胞的所有成分[16]，骨质疏松症患者的氧化应激加快骨质损失，氧化应激产生的主要物质活性氧可通过多种机制诱导自噬，而自噬又可在多种病理条件下减少氧化损伤[24]。PI3K-Akt-mTOR信号通路参与多种细胞过程，包括细胞增殖、分化、迁移和存活，另外PI3K-Akt-mTOR信号传导是调节自噬的重要途径[25]。过量的活性氧可以抑制PI3K-Akt-mTOR信号通路从而激活自噬，加快自噬水平容易诱发成骨细胞凋亡，进而加速骨量丢失，加快绝经后骨质疏松症进展[26]。从此次实验研究来看，通过去卵巢建立绝经后骨质疏松症大鼠模型，可导致血清中过氧化损伤丙二醛、活性氧含量增加，抑制PI3K-Akt-mTOR信号通路从而诱导自噬，使骨代谢加速、骨组织自噬水平加快；补肾健脾活血方干预后，可降低过氧化损伤，升高抗氧化酶水平，从而减轻氧化应激反应；激活PI3K-Akt-mTOR信号通路抑制过度自噬导致的细胞凋亡，减慢骨代谢和骨细胞自噬水平，进而对绝经后骨质疏松症起到防治作用。
综上，补肾健脾活血方能够降低绝经后骨质疏松大鼠骨代谢水平、提高骨密度，改善氧化应激状态及抑制自噬，其机制可能与调控了PI3K-AKT-mTOR信号通路有关。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

补肾健脾活血方干预骨质疏松模型大鼠骨代谢、氧化应激及自噬的变化

Bushen Jianpi Huoxue Recipe improves bone metabolism, oxidative stress, and autophagy in osteoporotic rats

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