补肾调肝方含药血清促进大鼠软骨细胞自噬治疗关节炎

doi:10.12307/2022.617

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (20): 3178-3183.doi: 10.12307/2022.617

• 软骨组织构建 cartilage tissue construction • 上一篇下一篇

补肾调肝方含药血清促进大鼠软骨细胞自噬治疗关节炎

范帅1，吴春飞1，梁祖建1，徐兆辉2，谢平金2，朱根福1

1广州中医药大学第三附属医院，广东省广州市 510240；2深圳市罗湖区中医院，广东省深圳市 518000

收稿日期:2021-09-22 接受日期:2021-11-11 出版日期:2022-07-18 发布日期:2022-01-18
通讯作者: 朱根福，博士，副主任中医师，广州中医药大学第三附属医院，广东省广州市 510240
作者简介:范帅，男，1987年生，河北省石家庄市人，汉族，2017年广州中医药大学毕业，硕士，主治医师，主要从事中医药防治骨伤科疾病研究。
基金资助:
广东省自然科学基金项目(2021A1515011469)，项目负责人：梁祖建；广东省中医药局科研项目(20201171)，项目负责人：范帅；广东省中医药局科研项目(20211211)，项目负责人：吴春飞；广州中医药大学第三附属医院科研创新基金项目(sy201701，sy2018007)，项目负责人：范帅；2020年深圳市科技创新委员会基础研究面上项目(JCYJ20190812170815559)，项目参与人：谢平金

Bushen Tiaogan Prescription containing serum in the treatment of osteoarthritis by promoting chondrocyte autophagy in rats

Fan Shuai1, Wu Chunfei1, Liang Zujian1, Xu Zhaohui2, Xie Pingjin2, Zhu Genfu1

1Third Affiliated Hospital, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510240, Guangdong Province, China; 2Luohu District Hospital of Traditional Chinese Medicine, Shenzhen 518000, Guangdong Province, China

Received:2021-09-22 Accepted:2021-11-11 Online:2022-07-18 Published:2022-01-18
Contact: Zhu Genfu, MD, Associate chief physician, Third Affiliated Hospital, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510240 Guangdong Province, China
About author:Fan Shuai, Master, Attending physician, Third Affiliated Hospital, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510240 Guangdong Province, China
Supported by:
Guangdong Provincial Natural Science Foundation, No. 2021A1515011469 (to LZJ); Guangdong Provincial Bureau of Traditional Chinese Medicine Research Projects, Nos. 20201171 (to FS) and 20211211 (to WCF); Research and Innovation Projects of the Third Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Nos. sy201701 and sy2018007 (both to FS); 2020 Basic Research Project of Shenzhen Science and Technology Innovation Committee, No. JCYJ20190812170815559 (to XPJ [project participant])

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
骨关节炎：是一种临床常见的慢性退行性骨关节疾病，多以疼痛为主要表现，最终可导致关节畸形及功能障碍。其主要病理改变是软骨退化、滑膜炎和关节周围硬化包括骨赘形成和软骨下骨硬化。
自噬：又称Ⅱ型程序性细胞死亡，是一种高度保守的降解系统，在调节机体能量和营养、维持机体能量代谢中起着至关重要的作用。许多研究表明自噬是多种组织细胞使用的一种抗凋亡细胞保护机制。大量证据表明，自噬参与骨关节炎的病理进展，自噬的增强可以保护关节软骨，延缓骨关节炎的进展。

背景：前期研究发现，补肾调肝方治疗骨关节炎有明显临床疗效，但缺乏对其作用机制的研究。
目的：观察补肾调肝方含药血清对大鼠软骨细胞自噬的影响，并探讨其内在机制。
方法：传代培养的第3代大鼠软骨细胞随机分为4组：二甲基亚砜组、10 μg/L白细胞介素1β组、10 μg/L白细胞介素1β+10%补肾调肝方含药血清组和雷帕霉素5 μmol/L组，分别处理软骨细胞24 h。单丹磺酰尸胺染色法检测软骨细胞自噬小体表达；实时荧光定量PCR检测自噬相关基因ATG5、ATG7 mRNA的表达；Western blot检测Beclin1、LC3A/B和磷酸化蛋白激酶B (p-AKT)、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)的蛋白表达水平。
结果与结论：①与二甲基亚砜组比较，10 μg/L白细胞介素1β组中细胞的自噬小体数量明显减少；雷帕霉素处理后的软骨细胞与二甲基亚砜组相比，自噬小体的数量明显增多；与10 μg/L白细胞介素1β组相比，10 μg/L白细胞介素1β+10%补肾调肝方含药血清组的自噬小体明显增多；②实时荧光定量PCR及Western blot结果显示，与二甲基亚砜组比较，10 μg/L白细胞介素1β组中软骨细胞自噬相关基因ATG5、ATG7 mRNA及Beclin1和LC3A/B-Ⅱ/LC3A/B-Ⅰ蛋白表达水平均明显下降(P < 0.05，P < 0.01，P < 0.01，P < 0.05)，而p-AKT和p-mTOR蛋白表达水平明显上升(P < 0.05，P < 0.05)；与二甲基亚砜组相比，雷帕霉素处理后的软骨细胞中ATG5、ATG7 mRNA及Beclin1和LC3A/B-Ⅱ/LC3A/B-Ⅰ蛋白表达水平均明显上升(P < 0.01，P < 0.05，P < 0.05，P < 0.05)，而p-AKT和p-mTOR蛋白表达水平明显下降(P < 0.01，P < 0.01)；与10 μg/L白细胞介素1β组相比，10 μg/L白细胞介素1β+10%补肾调肝方含药血清组中软骨细胞自噬相关基因ATG5、ATG7 mRNA及Beclin1和LC3A/B-Ⅱ/LC3A/B-Ⅰ的蛋白表达水平均明显上升(P < 0.01，P < 0.01，P < 0.05，P < 0.01)，而p-AKT和p-mTOR蛋白表达水平明显下降(P < 0.05，P < 0.05)；③提示补肾调肝方含药血清可能通过抑制软骨细胞内AKT/mTOR信号通路增加软骨细胞的自噬能力，延缓关节软骨退变，起到治疗骨关节炎的作用。
缩略语：蛋白激酶B：protein kinase B，PKB/AKT；哺乳动物雷帕霉素靶蛋白：mammalian target of rapamycin，mTOR

https://orcid.org/0000-0001-9864-6771 (范帅)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 自噬, 骨关节炎, 补肾调肝方, 关节软骨, AKT/mTOR

Abstract: BACKGROUND: Previous studies have found that Bushen Tiaogan Prescription has obvious clinical efficacy in the treatment of osteoarthritis, but there is a lack of research on its mechanism.
OBJECTIVE: To study the effect of Bushen Tiaogan Prescription containing serum on the autophagy of rat chondrocytes, and to explore its internal mechanism.
METHODS: The third-generation rat chondrocytes subcultured were randomly divided into four groups: dimethyl sulfoxide (DMSO), 10 μg/L interleukin-1β (IL-1β), 10 μg/L IL-1β+10% Bushen Tiaogan Prescription medicated serum (BSTG), and 5 μmol/L rapamycin groups, and chondrocytes in each group were treated correspondingly for 24 hours. Dansylcadaverine staining was used to detect the expression of chondrocyte autophagosomes. Real-time fluorescence quantitative PCR was used to detect the expression of autophagy-related genes ATG5 and ATG7 mRNAs, and the expression levels of Beclin1, LC3A/B, phosphorylated protein kinase B (p-AKT), and phosphorylated mammalian target of rapamycin (p-mTOR) proteins were analyzed by western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the DMSO group, the number of autophagosomes was significantly reduced in the IL-1β group. Compared with the DMSO group, the number of autophagosomes was significantly increased in the rapamycin group. Compared with the IL-1β group, the number autophagosomes was significantly increased in the 10 μg/L IL-1β+10% BSTG group. Compared with the DMSO group, the mRNA expressions of chondrocyte autophagy-related genes ATG5, ATG7 and the protein expressions of Beclin1 and LC3A/B-II/LC3A/B-I protein expression were significantly decreased in the IL-1β
group (P < 0.05, P < 0.01, P < 0.01, P < 0.05), while the protein expressions of p-AKT and p-mTOR were significantly increased (P < 0.05, P < 0.05). Compared with the DMSO group, the mRNA expressions of ATG5 and ATG7 and the protein expressions of Beclin1 and LC3A/B-II/LC3A/B-I were significantly increased in the rapamycin group (P < 0.01, P < 0.05, P < 0.05, P < 0.05), while the protein expressions of p-AKT and p-mTOR were significantly decreased (P < 0.01, P < 0.01). Compared with the IL-1β group, the mRNA expressions of ATG5 and ATG7 the protein expressions of Beclin1 and LC3A/B-II/LC3A/B-I were significantly increased in the 10 μg/L IL-1β+10% BSTG group (P < 0.01, P < 0.01, P < 0.05, P < 0.01), while the protein expressions of p-AKT and p-mTOR were significantly decreased (P < 0.05, P < 0.05). To conclude, Bushen Tiaogan Prescription containing serum increases the autophagy ability of chondrocytes by inhibiting the AKT/mTOR signaling pathway in chondrocytes and alleviating the degeneration of articular cartilage, and thereby plays a role in the treatment of osteoarthritis.

Key words: autophagy, osteoarthritis, Bushen Tiaogan Prescription, articular cartilage, AKT/mTOR

中图分类号:

范帅, 吴春飞, 梁祖建, 徐兆辉, 谢平金, 朱根福. 补肾调肝方含药血清促进大鼠软骨细胞自噬治疗关节炎[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(20): 3178-3183.

Fan Shuai, Wu Chunfei, Liang Zujian, Xu Zhaohui, Xie Pingjin, Zhu Genfu. Bushen Tiaogan Prescription containing serum in the treatment of osteoarthritis by promoting chondrocyte autophagy in rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(20): 3178-3183.

图/表（结果） 4

2.1 单丹磺酰尸胺染色法检测补肾调肝方含药血清对软骨细胞自噬的影响分别用二甲基亚砜、10 μg/L白细胞介素1β、10 μg/L白细胞介素1β+10%补肾调肝方含药血清和5 μmol/L雷帕霉素处理软骨细胞24 h后采用单丹磺酰尸胺检测软骨细胞自噬小体的表达情况。雷帕霉素可抑制AKT/mTOR信号通路的活性，从而诱导细胞发生自噬[17]，因而此次研究使用雷帕霉素作为阳性对照组。结果显示与二甲基亚砜组比较，10 μg/L白细胞介素1β组中细胞的自噬小体数量明显减少；自噬诱导剂雷帕霉素处理后的软骨细胞(阳性对照组)与二甲基亚砜组相比，自噬小体的数量明显增多，10 μg/L白细胞介素1β+10%补肾调肝方含药血清组与10 μg/L白细胞介素1β组相比自噬小体明显增多，表明补肾调肝方含药血清能够提高软骨细胞的自噬水平，见图1。

2.2 补肾调肝方含药血清对软骨细胞自噬相关基因和蛋白表达的影响分别用二甲基亚砜、10 μg/L白细胞介素1β、10 μg/L 白细胞介素1β+10%补肾调肝方含药血清和5 μmol/L 雷帕霉素处理软骨细胞24 h后，采用实时荧光定量PCR检测软骨细胞中自噬相关基因ATG5和ATG7 mRNA表达的情况，Western blot检测软骨细胞中自噬蛋白Beclin1和LC3A/B的表达情况。结果显示，与二甲基亚砜组比较，10 μg/L白细胞介素1β组中细胞的自噬相关基因ATG5、ATG7 mRNA表达水平明显下降(P < 0.05，P < 0.01)，Beclin1和LC3A/B-Ⅱ/LC3A/B-Ⅰ蛋白表达水平明显下降(P < 0.01，P < 0.05)；自噬诱导剂雷帕霉素处理后的软骨细胞与二甲基亚砜组相比，ATG5、ATG7 mRNA水平明显上升(P < 0.01，P < 0.05)，Beclin1和LC3A/B-Ⅱ/LC3A/B-Ⅰ蛋白表达水平明显上升(P < 0.05，P < 0.05)；10 μg/L细胞介素1β+10%补肾调肝方含药血清组与白细胞介素1β组相比ATG5、ATG7 mRNA水平明显上升(P < 0.01，P < 0.01)，Beclin1和LC3A/B-Ⅱ/LC3A/B-Ⅰ蛋白表达水平明显上升(P < 0.05，P < 0.01)。结果表明，与二甲基亚砜组比较，白细胞介素1β组细胞的自噬能力降低；与10 μg/L白细胞介素1β组相比，白细胞介素1β处理后的细胞经补肾调肝方治疗后细胞自噬水平增强，见图2，3。

2.3 补肾调肝方含药血清对软骨细胞AKT/mTOR信号通路的影响分别用二甲基亚砜、10 μg/L白细胞介素1β、10 μg/L白细胞介素1β+10%补肾调肝方含药血清和5 μmol/L 雷帕霉素处理软骨细胞24 h后，采用Western blot法检测p-AKT和p-mTOR蛋白表达的影响。结果显示，与二甲基亚砜组比较，10 μg/L白细胞介素1β组中细胞的p-AKT和p-mTOR蛋白表达水平明显上升(P < 0.05，P < 0.05)；雷帕霉素处理后的软骨细胞与二甲基亚砜组相比，p-AKT和p-mTOR蛋白表达水平明显下降(P < 0.01，P < 0.01)；10 μg/L白细胞介素1β+10%补肾调肝方含药血清组与10 μg/L白细胞介素1β组相比，p-AKT和p-mTOR蛋白表达水平明显下降(P < 0.05，P < 0.05)。结果表明补肾调肝方含药血清能够抑制软骨细胞的AKT/mTOR信号通路，见图4。

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引言

骨关节炎是一种临床常见的多以疼痛为首要表现，最终导致关节畸形及功能障碍的慢性退行性骨关节疾病，其主要病理改变是软骨退化、滑膜炎和关节周围硬化包括骨赘形成和软骨下骨硬化[1-2]。骨关节炎的发生与多种危险因素有关，如年龄、肥胖、遗传因素、既往关节损伤等。衰老是骨关节炎的最大危险因素，近年来由于肥胖人口的增加和人口的快速老龄化，骨关节炎的发病率正在逐渐上升[3-4]。研究表明，超过50%的骨关节炎患者年龄在65岁以上，甚至80%的骨关节炎患者年龄在75岁以上[5-6]，严重影响了老年患者的生活质量，给社会造成了沉重的负担。目前骨关节炎的治疗仍以对症消炎止痛为主，然而，在控制关节炎症和促进受损软骨细胞功能的恢复方面，目前仍缺乏能够改变骨关节炎自然病程的有效干预措施[7]。因此，深入研究骨关节炎的发病机制，探索新的治疗靶点是必要的。
自噬又称Ⅱ型程序性细胞死亡，是一种高度保守的降解系统，在调节机体能量和营养、维持机体能量代谢中起着至关重要的作用[8-9]。许多研究表明自噬是多种组织细胞使用的一种抗凋亡细胞保护机制。蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信号通路已被证实是细胞调节细胞自噬的主要通路，mTORC直接参与调节主要细胞自噬蛋白的活动。大量证据表明，自噬参与骨关节炎的病理进展，自噬的增强可以保护关节软骨，延缓骨关节炎的进展[10-12]。因此，骨关节炎治疗靶点可能与调控软骨细胞自噬的发生存在联系。
骨关节炎属于中医“骨痹”的范畴，多发于老年人，患者因衰老，先天之肾气渐亏，筋骨得不到肾髓滋养，骨渐衰退，筋骨失养而发为此病。基于肝肾同源、筋骨并重的理论，在临床治疗过程中，作者提出了补肾调肝治疗骨关节炎的新观念，并自拟补肾调肝方，临床疗效满意[13]。而且前期研究发现，补肾调肝方含药血清可通过调控SOX9/核因子κB抑制白细胞介素1β诱导的软骨细胞凋亡[14]。中药复方含药血清可模拟药物在人体内的代谢过程，从而准确地反映药物在体外实验中的实际情况，因此，作者所在课题组拟利用血清药理学方法[15-16]，以软骨细胞自噬为出发点，通过补肾调肝方含药血清的干预，研究补肾调肝方对软骨细胞自噬的影响，揭示补肾调肝方治疗骨关节炎的潜在作用机制。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计实验动物体外实验，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2021年4-8月广州中医药大学广东省中医药科学院实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 SPF级雌性SD大鼠8只，3月龄，体质量220-280 g，由广州中医药大学动物实验中心提供；使用许可证号：SYXK(粤)2013-0001。
1.3.2 药品与试剂补肾调肝方包括柴胡12 g、郁金15 g、骨碎补15 g、龟板30 g、怀牛膝15 g、川芎10 g、白芍30 g、玫瑰花12 g、川楝子12 g、白术15 g、菊花15 g、石菖蒲15 g、甘草10 g，共206 g生药，由广州中医药大学第三附属医院药剂室提供，经广州中医药大学第三附属医院涂兴明主任药师鉴定合格。DMEM高糖培养基、胎牛血清、含EDTA 0.25%胰酶、不含EDTA 0.25%胰酶、青霉素/链霉素双抗(美国Gbico公司)；p-AKT(Ser473)、p-mTOR、Beclin-1、LC3A/B和β-actin一抗抗体(美国CST公司)；大鼠白细胞介素1β一抗抗体(美国PeproTech公司)；单丹磺酰尸胺细胞自噬染色检测试剂盒(北京Solarbio科技有限公司)；Trizol RNA分离试剂盒(日本Takara公司)；反转录试剂盒、Fast SYBR Green master mix试剂盒(美国Applied Biosystems公司)；SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；实时荧光定量PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司提供。
1.3.3 主要实验仪器 CO2细胞培养箱(美国Thermo Scientific公司)；900LC型生物安全柜(青岛海尔生物医疗股份有限公司)；5200型全自动化学发光图像分析系统(上海天能)；多功能酶标仪(美国Biotek公司)；倒置荧光显微镜(日本Olympus公司)；ABI实时荧光定量PCR系统(美国ThermoFisher公司)。免疫蛋白印迹系统通用设备(美国 BIO-RAD 公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 补肾调肝方含药血清制备补肾调肝方含药血清制备的具体操作方法同作者前期研究[14]，具体如下：将2剂补肾调肝方加入1 000 mL水煎煮1.5 h，过滤，药渣加800 mL水煎煮1.5 h，合并2次提取液约200 mL。按照等效剂量换法给予大鼠灌服中药液，并于每天9：00和15：00左右灌胃2次，共灌胃7 d。于末次灌胃后1 h，1%的异戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠后，无菌操作，腹主动脉采血，提取血清后分装放置在-80 ℃保存备用。
1.4.2 大鼠原代软骨细胞提取大鼠原代软骨细胞提取与鉴定具体操作方法同作者前期研究[14]，无菌条件下取SD大鼠正常关节表面软骨组织，收集大鼠软骨组织后采用胰酶和Ⅱ型胶原酶两步酶消化法提取软骨细胞，同时用甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原蛋白免疫荧光染色法鉴定大鼠原代软骨细胞。
1.4.3 单丹磺酰尸胺染色法检测软骨细胞自噬小体表达取第3代软骨细胞，24孔板中每孔接种1 mL含2×107 L-1的细胞悬液，贴壁48 h后，分别用二甲基亚砜、10 μg/L 白细胞介素1β、10 μg/L 白细胞介素1β+10%补肾调肝方含药血清、5 μmol/L雷帕霉素处理软骨细胞24 h。用400 μL 的1×Wash buffer清洗细胞2次，每次5 min；用1×Wash buffer将单丹磺酰尸胺 Stain稀释10倍后加入孔中，室温避光染色30 min；用400 μL的1×Wash buffer清洗细胞2次，每次5 min；荧光显微镜下观察(激发滤光片波长355 nm，阻断滤光片波长512 nm)，计数并拍照。

1.4.4 实时荧光定量PCR法取第3代软骨细胞，6孔板中每孔接种2 mL 含2×108 L-1的细胞悬液，贴壁48 h后，分别用二甲基亚砜、10 μg/L白细胞介素1β、10 μg/L白细胞介素1β+10%补肾调肝方含药血清、5 μmol/L雷帕霉素处理软骨细胞24 h，按照life technology公司RNA提取试剂盒说明书，加入1 mL Trizol消化裂解，并充分混匀，进行总RNA的提取。以1 μg总RNA为模板，按照反转录酶说明书的方案配制反转录反应体系，总体系为20 μL，合成cDNA。按Fast SYBR GREEN Master Mix (Applied Biosystems)试剂盒说明书进行加样，采用2-ΔΔCt法计算各组间的基因表达水平。实时荧光定量PCR引物序列见表1。

1.4.5 Western blot Western blot检测Beclin1、LC3A/B、p-AKT和p-mTOR蛋白表达，取第3代软骨细胞，6孔板中每孔接种2 mL 含2×108 L-1的细胞悬液，贴壁48 h后，分别用二甲基亚砜、10 μg/L白细胞介素1β、10 μg/L白细胞介素1β+10%补肾调肝方含药血清、5 μmol/L 雷帕霉素处理软骨细胞24 h，收集细胞，离心后加入细胞裂解液，提取蛋白质，离心取上清液，蛋白定量后取20 μg总蛋白进行SDS-PAGE电泳，随后将其转移至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭，加入一抗(1∶1 000)，同时以β-actin为内参，4 ℃孵育过夜，TBST洗涤PVDF膜，加入二抗(1∶2 000)，室温孵育1 h，ECL显色，并放入显影仪中显影，拍照保存。
1.5 主要观察指标 ①补肾调肝中药含药血清对白细胞介素1β诱导软骨细胞自噬的影响；②补肾调肝中药含药血清对自噬相关基因和蛋白表达的影响；③补肾调肝中药含药血清对AKT/mTOR信号通路的影响。
1.6 统计学分析采用SPSS 19.0软件对数据进行统计，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

关节软骨细胞病变，主要表现为软骨细胞的损伤与凋亡，是骨关节炎发生发展过程的关键环节[18-19]。在骨关节炎的发病机制中，细胞凋亡和自噬被认为是两个重要的环节，随着细胞自噬能力的降低，消除细胞自身衰老、损伤和炎症物质的能力也降低，引起细胞炎症的发生和进一步发展，导致软骨细胞的损伤和凋亡[20]。自噬作为一种适应性反应，在骨关节炎早期可以减少细胞死亡，但随着骨关节炎的发展，过度的自噬也可能导致细胞死亡。但是自噬的激活对骨关节炎早期发展中软骨细胞的存活具有积极意义[21]。因此，恢复细胞自噬，增加自我修复的能力，可能是治疗骨关节炎的重要手段。
中医认为，骨关节炎临床上多属“肝肾不足、筋脉瘀滞”。中老年人是骨关节炎发病的最主要人群，该部分人群随着年龄的增长，肝肾亏虚，呈现多郁、多虚的表现，骨得不到肝肾滋养，筋骨失养，“不荣则痛”；病久气血不畅，闭阻筋脉，“不通则痛”，故而发病。根据“肾主骨”“肝肾同源”理论，作者提出治疗骨关节炎的主要原则是补肾调肝，并根据临证经验和临床实际拟定补肾调肝方，并在临床中反复实践。方中骨碎补、怀牛膝补肝肾、强筋骨；白芍、柴胡、郁金、玫瑰花、川楝子、川芎、龟板等药物调肝气、养肝阴、补肝血；白术健脾益气，石菖蒲豁痰、理气活血；菊花散风清热、平肝阳；甘草调和诸药，使肾虚得以补，肝郁得以疏，切中病机、直达病处[13]。
mTOR是自噬过程中的主要负调控因子，它与各种蛋白质结合形成2个不同的多蛋白复合物，称为mTOR复合物1 (mTORC1)和mTOR复合物2 (mTORC2)。mTORC1作为一个包含mTOR的复合物，在自噬的调节中起着至关重要的作用。随着骨关节炎的进展，mTOR上调并介导抑制关节软骨自噬信号转导，自噬对软骨的保护作用减弱，最终促进软骨退行性变[22-23]。AKT/mTOR信号通路参与基因转录、蛋白质翻译、核糖体合成等生物过程。mTOR可通过激活AKT使细胞中的靶蛋白磷酸化，从而抑制mTORC1与p70S6等复合物活性，诱导自噬发生[24-26]。在自噬体形成过程中，Beclin-1是必需的重要元件，而LC3A/B则是构成自噬体的重要结构，因此Beclin-1和LC3A/B的表达水平可反映细胞自噬的情况。当自噬发生时，胞浆型LC3A/B(即LC3A/B-Ⅰ)转变为自噬体中的膜型LC3A/B(即LC3A/B-Ⅱ)，LC3A/B-Ⅱ/LC3A/B-Ⅰ比值的大小可反映细胞自噬的水平[27]。ZHANG等[28]的研究表明，在内侧半月板-胫骨韧带切除术的骨关节炎小鼠模型中敲除mTOR后，其软骨细胞自噬水平升高，凋亡水平降低。QIN等[29]研究发现关节内注射自噬诱导剂白藜芦醇可激活软骨细胞的自噬，显著延缓内侧半月板失稳骨关节炎小鼠模型的关节软骨变性。ZHANG等[20]研究发现姜黄素通过AKT/mTOR信号通路作用于手术诱导的骨关节炎小鼠，可提升细胞自噬能力，减缓细胞凋亡进程。XUE等[30]研究发现，抑制AKT/mTOR信号通路可提升骨关节炎大鼠关节软骨细胞自噬能力，减轻炎症反应。因此，AKT/mTOR信号通路在骨关节炎的发生发展过程中起着至关重要的作用。
虽然自噬紊乱在骨关节炎发病机制中的作用尚未完全阐明，自噬作为骨关节炎的治疗靶点仍具有广阔的临床前景[31-40]，靶向应用小分子药物调控软骨细胞自噬水平有望为骨关节炎的临床治疗提供更多选择。此次研究中单丹磺酰尸胺检测自噬小体结果显示，与空白对照组比较，白细胞介素1β组中细胞的自噬小体数量明显减少；10 μg/L白细胞介素1β+10%补肾调肝方含药血清组与白细胞介素1β组相比自噬小体明显增多。实时荧光定量PCR及Western blot结果显示，与空白对照组比较，白细胞介素1β组中软骨细胞自噬相关基因ATG5、ATG7 mRNA及Beclin1和LC3A/B-Ⅱ/LC3A/B-Ⅰ蛋白表达均明显下降，而p-AKT和p-mTOR蛋白表达明显上升；与白细胞介素1β组相比，10 μg/L白细胞介素1β+10%补肾调肝方含药血清组中软骨细胞自噬相关基因ATG5、ATG7 mRNA及Beclin1和LC3A/B-Ⅱ/LC3A/B-Ⅰ蛋白表达水平均明显上升，而p-AKT和p-mTOR蛋白表达水平明显下降。表明补肾调肝方含药血清可通过抑制p-AKT和p-mTOR蛋白表达，促进自噬相关蛋白及mRNA的表达，这可能是补肾调肝方临床治疗骨关节炎的作用靶点。
综上所述，补肾调肝方含药血清可能通过抑制AKT/mTOR信号通路中的磷酸化蛋白p-AKT和p-mTOR，促进软骨细胞自噬。此次研究结果为临床采用补肾调肝方治疗骨关节炎提供了实验依据，但此文仅为细胞实验，后续将在动物模型中进一步探索及研究。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

补肾调肝方含药血清促进大鼠软骨细胞自噬治疗关节炎

Bushen Tiaogan Prescription containing serum in the treatment of osteoarthritis by promoting chondrocyte autophagy in rats

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