黄芩汤调控自噬干预小鼠肠道急性移植物抗宿主病的机制

doi:10.12307/2022.144

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (7): 1057-1062.doi: 10.12307/2022.144

• 干细胞基础实验 basic experiments of stem cells • 上一篇下一篇

黄芩汤调控自噬干预小鼠肠道急性移植物抗宿主病的机制

崔兴1，孙小琪2，郑伟1，马德欣2

1山东中医药大学附属医院血液科，山东省济南市 250000；2山东中医药大学中医学(八年制)，山东省济南市 250000

收稿日期:2020-09-27 修回日期:2020-09-28 接受日期:2020-11-09 出版日期:2022-03-08 发布日期:2021-10-29
通讯作者: 崔兴，博士，副主任医师，山东中医药大学附属医院血液科，山东省济南市 250000
作者简介:崔兴，男，1980年生，山东省济南市人，汉族，2011年山东中医药大学毕业，博士，副主任医师，主要从事血液病临床与实验研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81774080)，项目负责人：崔兴；泰山学者计划(tsqn201812145)，项目负责人：崔兴；山东省重点研发计划(2019GSF108162)，项目负责人：崔兴

Huangqin Decoction regulates autophagy to intervene with intestinal acute graft-versus-host disease in mice

Cui Xing1, Sun Xiaoqi2, Zheng Wei1, Ma Dexin2

1Department of Hematology, Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250000, Shandong Province, China; 2Department of Traditional Chinese Medicine, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250000, Shandong Province, China

Received:2020-09-27 Revised:2020-09-28 Accepted:2020-11-09 Online:2022-03-08 Published:2021-10-29
Contact: Cui Xing, MD, Associate chief physician, Department of Hematology, Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250000, Shandong Province, China
About author:Cui Xing, MD, Associate chief physician, Department of Hematology, Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250000, Shandong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81774080 (to CX); the Taishan Scholar Program, No. tsqn201812145 (to CX); the Key Research & Development Plan of Shandong Province, No. 2019GSF108162 (to CX)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
黄芩汤：出自于《伤寒论》辨太阳病脉证并治第172条，原文为太阳与少阳合病，自下利者，与黄芩汤。黄芩汤以发热口苦、下利急迫、腹痛、肛门灼热、舌苔黄、脉弦数等为应用指征。现代临床黄芩汤用于治疗急性胃肠炎、细菌性痢疾、阿米巴痢疾等。黄芩汤主治病症与胃肠道急性移植物抗宿主病的症状十分相似，因此选用黄芩汤进行实验研究。
肠黏膜屏障：肠上皮细胞是肠黏膜屏障的主体，它与细胞间紧密连接是肠黏膜屏障功能的主要决定者。有证据表明，肠道急性移植物抗宿主病患者治疗后的肠上皮细胞中多种自噬相关蛋白表达明显增高，提示肠上皮细胞发生了自噬。自噬是保护肠黏膜屏障、维持肠道稳态的中药影响因素。
背景：如何应用中药干预肠黏膜屏障损伤后的自噬失衡状态，从而最终干预胃肠道急性移植物抗宿主病的发生是造血干细胞移植后亟需解决的问题。
目的：探讨黄芩汤干预急性肠道移植物抗宿主病的具体机制。
方法：CB6F1小鼠随机分成正常对照组、模型对照组、黄芩汤低剂量组、黄芩汤中剂量组、黄芩汤高剂量组，每组16只。模型对照组及黄芩汤低、中、高剂量组小鼠在60Co全身照射后4 h内(照射总剂量8 Gy)，经尾静脉输注Balb/c H-2d小鼠单个核细胞悬液(骨髓细胞8×107/只+脾细胞8×107/只)。造模后当天开始分别给予不同浓度黄芩汤灌胃，模型组及正常对照组灌胃等容量的生理盐水，连续应用15 d。最后一次灌胃后8 h取材，每组取6只小鼠小肠组织，采用PCR和Western blot检测LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin 1、P62表达水平，苏木精-伊红染色进行小肠黏膜病理分级评分，透射电镜观察小肠黏膜上皮细胞自噬泡结构；每组剩余10只(除正常对照组)小鼠进行临床急性移植物抗宿主病分级并记录生存时间。
结果与结论：①应用黄芩汤后，小鼠存活时间显著延长，临床急性移植物抗宿主病评分显著降低，小肠黏膜病理分级评分显著下降，黄芩汤中、高剂量组评分较模型对照组下降最显著，且黄芩汤中、高剂量组之间无显著差异；②模型对照组小鼠小肠组织自噬相关指标LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin 1水平显著低于正常对照组(P < 0.01)，P62水平显著高于正常对照组(P < 0.01)，黄芩汤可以促进LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1水平的恢复并下调P62水平(P < 0.01)；③透射电镜观察黄芩汤治疗组的自噬泡明显比模型对照组增多，且伴有如线粒体等重要细胞器形态的恢复；④结果表明，黄芩汤通过干预自噬相关蛋白，促进肠道急性移植物抗宿主病自噬稳态的恢复，保护肠黏膜屏障从而减轻了移植后肠道的排异，有望成为治疗急性移植物抗宿主病的新方法。

https://orcid.org/0000-0002-8771-5898(崔兴)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 骨髓, 脾脏, 单个核细胞, 急性移植物抗宿主病, 黄芩汤, 自噬, 肠黏膜屏障

Abstract: BACKGROUND: How to use traditional Chinese medicine to intervene the imbalance of autophagy after intestinal mucosal barrier injury, so as to ultimately intervene the occurrence of gastrointestinal acute graft-versus-host disease, is an urgent problem to be solved after hematopoietic stem cell transplantation.
OBJECTIVE: To verify the precise mechanism by which Huangqin Decoction interferes with acute intestinal graft-versus-host disease.
METHODS: CB6F1 mice were randomly divided into normal control group, model control group, low-dose Huangqin Decoction group, medium-does Huangqin Decoction group and high-does Huangqin Decoction group, with 16 mice per group. CB6F1 mice in the model control group, low-dose Huangqin Decoction group, medium-does Huangqin Decoction group and high-does Huangqin Decoction group were infused with mononuclear cell suspension (bone marrow cell 8×107 + spleen cell 8×107) obtained from Balb/c mice via caudal vein within 4 hours after 60Co whole body irradiation (radiation dose was 8 Gy). Different concentrations of Huangqin Decoction were given by gavage on the same day after modeling. The rats in the model control group and the normal control group were given the same volume of normal saline by gavage for 15 days. Eight hours after the last gavage, the small intestine tissues of six mice in each group were collected. PCR and western blot assay were used to detect the expression levels of LC3II/I, Beclin1 and P62. The pathological grading of small intestinal mucosa was scored by hematoxylin-eosin staining. The autophagic vesicle structure of small intestinal mucosal epithelial cells was observed by transmission electron microscope. The remaining 10 rats in each group (except the normal control group) were used to observe the clinical grading of acute graft-versus-host disease and record the survival time.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) After the application of Huangqin Decoction, the survival time of mice was significantly prolonged; the clinical acute graft-versus-host disease score was significantly decreased, and the pathological grading score of small intestinal mucosa was significantly decreased. The score of medium-does Huangqin Decoction group and high-does Huangqin Decoction group was significantly lower than that of model control group, but there was no significant difference between medium-does Huangqin Decoction group and high-does Huangqin Decoction group. (2) The LC3II/I and Beclin1 expression was significantly lower in the model control group than that in the normal control group (P < 0.01), and P62 expression was significantly higher than that in the normal control group (P < 0.01). Huangqin Decoction could promote the recovery of LC3II/I and Beclin1 levels and downregulate p62 levels (P < 0.01). (3) Under transmission electron microscope, the number of autophagic vesicles in the treatment group was significantly higher than that in the model control group, accompanied by the recovery of important organelles such as mitochondria. (4) The results confirm that by interfering autophagy related proteins, Huangqin Decoction can promote the recovery of autophagy in acute graft-versus-host disease, protect intestinal mucosal barrier and reduce intestinal rejection after transplantation and has promise as a new treatment for acute graft-versus-host disease.

Key words: bone marrow, spleen, mononuclear cells, acute graft-versus-host disease, Huangqin Decoction, autophagy, intestinal mucosal barrier

中图分类号:

崔兴, 孙小琪, 郑伟, 马德欣. 黄芩汤调控自噬干预小鼠肠道急性移植物抗宿主病的机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1057-1062.

Cui Xing, Sun Xiaoqi, Zheng Wei, Ma Dexin. Huangqin Decoction regulates autophagy to intervene with intestinal acute graft-versus-host disease in mice[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(7): 1057-1062.

图/表（结果） 2

2.1 小鼠生存时间用于记录生存时间的40只小鼠中，模型对照组10只小鼠均死于15 d内，黄芩汤低剂量组生存时间有所延长，均死于20 d内，黄芩汤中剂量组及黄芩汤高剂量组小鼠存活时间明显延长，至移植后28 d依旧有部分小鼠存活，见图1A，这表明黄芩汤治疗能延长急性移植物抗宿主病小鼠的生存时间，中、高剂量黄芩汤的效果更为明显。
2.2 急性移植物抗宿主病评分模型对照组第3天开始出现排便次数增多的情况，第5天出现软便，黄芩汤低、中、高剂量组大便形状较于模型对照组有所改善，且黄芩汤各治疗组急性移植物抗宿主病评分显著低于模型对照组，见图1B，表明黄芩汤治疗能有效降低急性移植物抗宿主病的发病率。
2.3 小肠黏膜病理评分与模型对照组相比，黄芩汤高、中、低剂量组的病理炎症评分明显降低(P < 0.01)，见图1C，其中黄芩汤高剂量组评分最低。
2.4 小肠黏膜组织学分析正常对照组小肠黏膜上皮结构最为完整，模型对照组和黄芩汤各剂量组均有不同程度的炎性细胞浸润，模型对照组肠黏膜炎性细胞浸润较严重，符合肠道急性移植物抗宿主病的病理特征。经黄芩汤治疗后，小肠黏膜上皮结构完整性部分恢复，表现为炎性细胞浸润减少，腺细胞排列更规则，杯状细胞增多，细胞碎片脱落减少，肠黏膜上皮细胞坏死较少，其中黄芩汤中剂量组小肠黏膜上皮结构完整性最好，见图1D。

2.5 各组小肠组织LC3Ⅰ、 LC3Ⅱ、Beclin 1、p62 mRNA表达水平模型对照组小鼠小肠组织自噬相关指标LC3Ⅱ/Ⅰ、
Beclin 1水平显著低于正常对照组(P < 0.01)，p62水平显著高于正常对照组(P < 0.01)，提示急性移植物抗宿主病小鼠小肠组织自噬水平显著下降，见图2A。经过黄芩汤治疗后，自噬相关指标LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1水平显著升高，p62水平显著降低，其中黄芩汤中、高剂量组自噬相关指标变化最为显著，提示应用黄芩汤治疗后小肠组织自噬水平显著升高。基于上述检测数据，选用黄芩汤中剂量组进行以下实验。
2.6 透射电镜分析透射电镜检测各组小肠黏膜上皮细胞自噬水平，相较于正常对照组，模型对照组的自噬泡明显减少，且线粒体结构破坏明显，而黄芩汤治疗组的双层膜结构的自噬泡明显比模型对照组增多，且伴有如线粒体等重要细胞器形态的恢复，见图2B。
2.7 各组小肠组织LC3Ⅰ、 LC3Ⅱ、Beclin 1、P62蛋白表达与正常对照组相比，模型对照组LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin 1水平显著下降，P62水平显著上升，提示急性移植物抗宿主病小鼠小肠组织自噬水平下降，黄芩汤治疗组LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin 1
水平显著升高，P62水平显著下调(P < 0.01)，提示黄芩汤治疗后小鼠小肠组织的自噬作用显著增强，见图2C，D。
2.8 生物相容性该研究生物相容性指Balb/c H-2d小鼠的骨髓及脾脏细胞在CB6F1小鼠的骨髓中能够植入成功。CB6F1小鼠作为C57BL/6小鼠和Balb/c H-2d的杂交一代小鼠，用Balb/c H-2d小鼠作为供体进行移植是单倍体相合移植，与受体之间的相容性较高，且排异风险较大，造模成功率较高。

参考文献

[1] LIU A, MEYER E, JOHNSTON L, et al. Prevalence of graft versus host disease and cytomegalovirus infection in patients post-haematopoietic cell transplantation presenting with gastrointestinal symptoms. Aliment Pharmacol Ther. 2013;38(8):955-966.
[2] LIN Y, WANG B, SHAN W, et al. mTOR inhibitor rapamycin induce polymorphonuclear myeloid-derived suppressor cells mobilization and function in protecting against acute graft-versus-host disease after bone marrow transplantation. Clin Immunol. 2018;187:122-131.
[3] ZOU Y, LI WY, WAN Z, et al. Huangqin-Tang Ameliorates TNBS-Induced Colitis by Regulating Effector and Regulatory CD4(+) T Cells. Biomed Res Int. 2015;2015:102021.
[4] 王康,缪志伟,董筠,等.基于STAT3/NF-kB/IL-6通路研究加味黄芩汤治疗溃疡性结肠炎的作用机制[J].南方医科大学学报,2020, 40(2):196-202.
[5] 马旭冉,王彦礼,邹迪新,等.黄芩汤调控Nrf2通路对溃疡性结肠炎大鼠氧化应激作用的影响[J].药学学报,2019,54(4):653-659.
[6] AMARNATH S, FLOMERFELT FA, COSTANZO CM, et al. Rapamycin generates anti-apoptotic human Th1/Tc1 cells via autophagy for induction of xenogeneic GVHD. Autophagy. 2010;6(4):523-541.
[7] 钟萍,崔兴.黄芩苷调控自噬保护肠黏膜屏障干预肠道急性移植物抗宿主病[J].中国组织工程研究,2020,24(25):4028-4032.
[8] 陈慧瑶,张伟,方芳,等.肠三叶因子通过自噬在急性移植物抗宿主病中发挥保护作用[J].温州医科大学学报,2017,47(7):480-484.
[9] LE TEXIER L, LINEBURG KE, MACDONALD KP. Harnessing bone marrow resident regulatory T cells to improve allogeneic stem cell transplant outcomes. Int J Hematol. 2017;105(2):153-161.
[10] COOKE KR, KOBZIK L, MARTIN TR, et al. An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin. Blood. 1996;88(8): 3230-3239.
[11] KAWAKAMI K, MINAMI N, MATSUURA M, et al. Osteopontin attenuates acute gastrointestinal graft-versus-host disease by preventing apoptosis of intestinal epithelial cells. Biochem Biophys Res Commun. 2017; 485(2):468-475.
[12] SATO A, NISHIDA C, SATO-KUSUBATA K, et al. Inhibition of plasmin attenuates murine acute graft-versus-host disease mortality by suppressing the matrix metalloproteinase-9-dependent inflammatory cytokine storm and effector cell trafficking. Leukemia. 2015;29(1): 145-156.
[13] BIAGI E, ZAMA D, RAMPELLI S, et al. Early gut microbiota signature of aGvHD in children given allogeneic hematopoietic cell transplantation for hematological disorders. BMC Med Genomics. 2019;12(1):49.
[14] VAN MONTFRANS J, SCHULZ L, VERSLUYS B, et al. Viral PCR positivity in stool before allogeneic hematopoietic cell transplantation is strongly associated with acute intestinal graft-versus-host disease. Biol Blood Marrow Transplant. 2015;21(4):772-774.
[15] 首汉蓉,唐建,黄泽林,等.黄芩汤加减联合补脾益肠丸对溃疡性结肠炎患者Toll样受体4/髓样分化因子88信号通路的影响[J].陕西中医,2020,41(6):750-753.
[16] BUHNER S, BUNING C, GENSCHEL J, et al. Genetic basis for increased intestinal permeability in families with Crohn’s disease: role of CARD15 3020insC mutation? Gut. 2006;55(3):342-347.
[17] TOUBAI T, ROSSI C, ORAVECZ-WILSON K, et al. IAPs protect host target tissues from graft-versus-host disease in mice. Blood Adv. 2017;1(19): 1517-1532.
[18] BÖTTCHER M, HOFMANN AD, BRUNS H, et al. Mesenchymal Stromal Cells Disrupt mTOR-Signaling and Aerobic Glycolysis During T-Cell Activation. Stem Cells. 2016;34(2):516-521.
[19] NIGHOT PK, HU CA, MA TY. Autophagy enhances intestinal epithelial tight junction barrier function by targeting claudin-2 protein degradation. J Biol Chem. 2015;290(11):7234-7246.
[20] LE TEXIER L, LINEBURG KE, CAO B, et al. Autophagy-dependent regulatory T cells are critical for the control of graft-versus-host disease. JCI Insight. 2016;1(15):e86850.
[21] HUBBARD-LUCEY VM, SHONO Y, MAURER K, et al. Autophagy gene Atg16L1 prevents lethal T cell alloreactivity mediated by dendritic cells. Immunity. 2014;41(4):579-591.
[22] 方健松,马媛萍,刘畅,等.自噬介导肠黏膜屏障维持肠道稳态在炎症性肠病中的作用[J].实用医学杂志,2016,32(8):1367-1369.
[23] 王彬彬,武承凤,张方信.自噬在肠黏膜屏障功能作用机制的研究进展[J].基础医学与临床,2017,37(3):405-409.
[24] 邹颖,戴世学,迟宏罡,等.Th17/Treg平衡在湿热型结肠炎大鼠中的变化及黄芩汤的调节作用[J].中药药理与临床,2012,28(2):2-5.
[25] 黄继承,王浩,贡钰霞.黄芩汤合四逆散加减联合西药治疗急性肠炎(肝郁脾虚夹湿热)的临床观察[J].中国中医急症,2019,28(3): 513-515.
[26] 王倩,别玉龙,范文涛.加味黄芩汤对TNBS诱导的结肠炎大鼠肠道菌群结构及IL-6/STAT3信号通路的影响[J].陕西中医,2017,38(4): 528-530,539.
[27] 郑学宝,封艳玲,刘洪波,等.黄芩汤对湿热型溃疡性结肠炎大鼠CD4+T细胞及其共刺激分子的影响[J].中国实验方剂学杂志,2011, 17(1):169-172.
[28] ZHANG Q, SUN J, WANG Y, et al. Antimycobacterial and Anti-inflammatory Mechanisms of Baicalin via Induced Autophagy in Macrophages Infected with Mycobacterium tuberculosis. Front Microbiol. 2017;8:2142.
[29] PIDALA J, HAMADANI M, DAWSON P, et al. Randomized multicenter trial of sirolimus vs prednisone as initial therapy for standard-risk acute GVHD: the BMT CTN 1501 trial. Blood. 2020;135(2):97-107.
[30] HUANG L, JIANG Y, SUN Z, et al. Autophagy Strengthens Intestinal Mucosal Barrier by Attenuating Oxidative Stress in Severe Acute Pancreatitis. Dig Dis Sci. 2018;63(4):910-919.
[31] 吴东升,张彧,陈大光,等.自噬在炎症性肠病肠黏膜屏障损伤中的作用[J].胃肠病学,2018,23(12):755-758.

引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。
1.2 时间及地点实验于2019年1-7月在北京科忠智实验有限公司完成。
1.3 材料
1.3.1 实验药材、抗体、仪器黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)、芍药(Paeonia lactiflora Pall)、炙甘草(Glycyrrhiza ura‐lensis Fisch)、大枣(Ziziphus jujuba Mill)购自山东中医药大学附属医院中药房。LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、Beclin 1和P62抗体
购自Affinity Biosciences公司(俄亥俄州辛辛那提市，美国)；透射电子显微镜、小动物辐照仪X-RAD225由山东省肿瘤医院提供(中国山东济南)。
1.3.2 实验动物健康SPF级Balb/c H-2d雄性小鼠15只为供鼠，体质量18-22 g，鼠龄8-10周；SPF级CB6F1雌性小鼠70只为受鼠，体质量18-22 g，鼠龄8-10周；另取6只SPF级CB6F1雌性小鼠为正常对照组。所有小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证编号为SCXK2012-0001(北京)。该动物实验由山东中医药大学附属医院伦理委员会审批通过，伦理号：AWE-2019-037。
1.4 实验方法
1.4.1 黄芩汤的制备方法参照《伤寒论》组方，黄芩汤由黄芩、芍药、甘草和大枣配伍而成，称取黄芩30 g、芍药20 g、甘草20 g和大枣24 g，加药材总质量10倍体积的水，煎煮1 h后，趁热过滤药液，药渣加8倍体积的水继续煎煮1 h，合并2次药液，浓缩成2 g/mL药液，用时稀释，黄芩汤低剂量组每只4.55 g/(kg·d)，黄芩汤中剂量组每只
9.1 g/(kg·d)，黄芩汤高剂量组每只18.2 g/(kg·d)。
1.4.2 骨髓和脾单个核细胞的制备参照文献[8]，采用脱颈椎法处死近交系Balb/c H-2d小鼠，无菌取骨髓和脾单个核细胞。
1.4.3 小鼠模型的建立及分组处理用60Co X射线照射CB6F1小鼠，剂量3.7 cGy/s，焦皮距50 cm，共照射1次，总剂量8 Gy，照射结束4 h以内通过尾静脉注射法将供鼠的骨髓及脾脏单个核细胞悬液(8×107骨髓细胞+8×107脾细胞)输入受鼠体内完成移植[8]。移植后第2，7天，分别取3只小鼠，脱颈椎处死，取得骨髓细胞，常规进行染色体制片，运用染色体G显带技术观测XY染色体是否存在，若存在Y染色体显带，则证明单倍体造血干细胞移植建模成功。
将造模CB6F1小鼠随机分为模型对照组、黄芩汤低剂量组、黄芩汤中剂量组、黄芩汤高剂量组，每组16只，另取6只CB6F1小鼠为正常对照组。正常对照组及模型对照组给予生理盐水，根据前期实验数据，黄芩汤低、中、高剂量组分别给予黄芩汤4.55，9.1，18.2 g/(kg·d)，移植后即刻开始灌胃，连续15 d。第15天灌胃后8 h取材，每组取6只小鼠用于取小肠组织进行各项指标检测，剩余10只(除正常对照组)小鼠进行临床急性移植物抗宿主病分级并记录生存时间。
1.4.4 临床急性移植物抗宿主病分级标准通过观察移植后第15天所有小鼠的体质量、姿势、活动度、毛发、皮肤完整性和腹泻等情况，按照LE TEXIER等[9]的急性移植物抗宿主病的临床评分标准计算分数，见表1。

1.4.5 小肠黏膜组织学及病理炎症评分将小肠组织固定在40 g/L多聚甲醛中进行苏木精-伊红染色，在光学显微镜下观察。通过检查小肠黏膜组织损伤、隐窝破坏、黏膜溃疡程度和炎性细胞浸润程度来确定病理炎症评分及组织学分析[10]，见表2。

1.4.6 PCR法检测小鼠小肠组织LC3Ⅰ、 LC3Ⅱ、Beclin 1、p62 mRNA表达水平将小肠组织剪碎后液氮研磨，加入1 mL Trizol匀浆，提取RNA并反转录、扩增，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司提供合成，具体序列见表3。以β-actin基因作为内参基因，采用2-ΔΔCt法对LC3Ⅰ、 LC3 Ⅱ、Beclin 1、p62的mRNA相对表达量进行分析。

1.4.7 透射电镜分析将小肠组织展平后放入电镜固定液中，置于4 ℃冰箱2 h，PBS冲洗3次，再用1%锇酸4 ℃固定2 h，经过PBS漂洗和乙醇、丙酮脱水后进行包埋过夜，制成厚度约4 μm的切片，用醋酸双氧铀、枸橼酸铅双染后置于透射电镜下观察。
1.4.8 Western blot检测小鼠小肠组织LC3Ⅰ、 LC3Ⅱ、Beclin 1、P62 蛋白表达水平将十二指肠和空肠分别剪碎成小片，加入蛋白酶进行消化，清洗后再用分散液多次分离，最终得到小肠黏膜上皮细胞悬液，使用RIPA裂解缓冲液裂解，收集总蛋白，然后将20 μg蛋白质样品加载到10%的SDS-PAGE凝胶上，在80 V下浓缩20 min，在120 V下分离约1 h，待溴酚蓝标记消失后立即停止电泳，然后用湿吸法将样品在110 V下转移到PVDF膜上，在4 ℃下保持100 min。每个免疫印迹在5%脱脂乳TBST中阻断2 h，加入一抗(LC3Ⅰ、 LC3Ⅱ、P62、Beclin 1)4 ℃
孵育过夜，TBST冲洗3次，每次10 min，然后在室温下用稀释的二抗在封闭液中孵育2 h，待二抗溶液完全冲洗干净后，用PTG-ECL化学发光检测试剂盒进行印迹，将印迹转移到成像机上进行曝光和分析。由ImageJ软件计算条带灰度值，并进行统计分析。
1.5 主要观察指标 ①小鼠生存时间；②小鼠急性移植物抗宿主病评分；③小肠黏膜组织病理学形态；④小肠黏膜上皮自噬泡结构；⑤自噬相关LC3Ⅰ、 LC3Ⅱ、Beclin 1、P62 蛋白、mRNA表达。
1.6 统计学分析实验结果用SPSS 20.0和GraphPad 8.0进行分析和绘图。结果以x±s表示，并进行方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

预处理方案导致炎症因子风暴以及化疗后机体免疫力相对较低导致某些细菌产物(如脂多糖)和其他病原体分子的系统性易位[11-12]，诱发的黏膜炎症和感染破坏肠黏膜屏障是肠道急性移植物抗宿主病发病的重要原因[13]。有研究证实，黄芩汤加减可以治疗溃疡性结肠炎，其作用机制与降低炎症因子水平有关[14]。因此，如何保护肠黏膜屏障是减轻肠道炎性反应[15]、治疗肠道急性移植物抗宿主病的关键。研究发现，应用凋亡抑制蛋白后，LC3水平降低，这表明移植物抗宿主病不仅具有凋亡激活功能，而且还伴随着自噬的抑制[16]。研究表明，降低mTOR水平、增加自噬和降低氧化应激可影响急性移植物抗宿主病的进程[17]。临床试验显示，在标准风险急性移植物抗宿主病的初始治疗中，mTOR抑制剂雷帕霉素在第28天的完全/部分缓解率与泼尼松相似，进一步提示促进自噬是治疗急性移植物抗宿主病的一种可靠方法[6]。细胞实验表明，使用雷帕霉素和PP242诱导自噬后，Caco-2细胞模型黏膜屏障增强，而通过敲减ATG16L1和ATG7等基因或加用氯喹等抑制自噬后，会减弱该细胞模型的黏膜屏障[18]。以上实验都表明了自噬与肠黏膜屏障的密切关系。
另外，自噬介导的免疫细胞异常对肠道黏膜屏障的破坏也有重要作用，比如自噬依赖的Treg细胞可以通过促进自噬功能的恢复，维持造血干细胞的植入状态，减少移植物抗宿主病的病理学改变[19-20]。有研究表明，自噬受损可导致肠道上皮细胞的黏附能力下降，进而使黏膜屏障受损，也反证了自噬在保护肠黏膜屏障中发挥重要作用[21]。除此之外，多项研究表明自噬相关蛋白在肠黏膜屏障功能中扮演重要角色[22]。从Western blot等结果可以看出，应用黄芩汤后，自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin 1、P62水平明显改变，这证明黄芩汤的应用对自噬有着重要影响。
肠道急性移植物抗宿主病的中医病机为热邪内迫，大小肠受承传导失司，出现腹痛腹泻等症。根据《黄帝内经》病机十九条中“诸呕吐酸，暴注下迫，皆属于热”，《伤寒论》中的治疗湿热型肠炎有较好疗效的黄芩汤可以用来治疗此类疾病[23-24]。研究证实，加味黄芩汤可以通过影响溃疡性结肠炎大鼠肠道菌群失调状态，缓解肠道局部的炎症[25]。还有研究表明黄芩汤可能通过调节CD4+T细胞的共刺激分子的表达量从而发挥对溃疡性结肠炎的免疫调节作用[26]，延缓肠道炎症反应，进而修复溃疡性结肠炎的肠黏膜屏障损伤，这都侧面证明黄芩汤对保护肠黏膜屏障有一定作用。
黄芩是黄芩汤的主要药物，常用于治疗腹泻症状。黄芩苷是黄芩的主要有效成分，有研究证实黄芩苷可以通过PI3K/Akt/mTOR途径诱导自噬，并发挥抗炎机制作用[27-28]。在该实验中，黄芩汤治疗后小鼠生存能力提高，临床急性移植物抗宿主病及肠道炎症评分下降，说明黄芩汤具有一定的减轻肠道急性移植物抗宿主病的作用。进一步研究发现，黄芩汤治疗后自噬泡增多，Western blot结果显示LC3-Ⅱ/Ⅰ和Beclin 1等自噬相关蛋白水平显著升高。以上都证实了黄芩汤可以促进自噬，增加自噬泡的产生，促进细胞碎片、废弃蛋白质等物质的降解，从而减少小肠黏膜上皮细胞的死亡和脱落。其他学者的研究也证实了激活自噬在减轻肠黏膜屏障功能障碍中的重要作用[29-31]，这与该研究结果一致。
该研究为黄芩汤通过促进自噬、减少肠黏膜上皮细胞死亡、干扰肠道急性移植物抗宿主病的进展而保护肠黏膜屏障提供了有力的证据。以此推断，胃肠道急性移植物抗宿主病患者服用黄芩汤后，肠黏膜屏障得到修复，其胃肠道症状会减轻，例如腹泻、呕吐、便血等症状可能会有所改善，下一步实验将着重研究黄芩汤对急性移植物抗宿主病模型中非编码RNA的影响，以进一步揭示黄芩汤保护肠黏膜屏障的机制，然后进一步明确黄芩汤有效成分，为下一步中药治疗胃肠道急性移植物抗宿主病提供依据，从而减轻病痛，提高患者的生活质量。
结论：黄芩汤调节自噬相关蛋白水平，促进自噬，减轻肠黏膜上皮细胞的死亡和脱落，进而保护肠黏膜屏障，从而干扰急性肠道移植物抗宿主病的进程。

黄芩汤调控自噬干预小鼠肠道急性移植物抗宿主病的机制

Huangqin Decoction regulates autophagy to intervene with intestinal acute graft-versus-host disease in mice

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 2

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	肖豪, 刘静 , 周君. 脉冲电磁场治疗绝经后骨质疏松症的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1323-1329.
[2]	梁学振, 杨曦, 李嘉程, 骆帝, 许波, 李刚. 补肾活血胶囊介导Hedgehog信号通路调控大鼠骨髓间充质干细胞成骨成脂分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1020-1026.
[3]	房晓磊, 冷军, 张晨, 刘会敏, 郭文. 间充质干细胞不同移植途径治疗缺血性脑卒中疗效差异的系统评价[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1085-1092.
[4]	田川, 朱向情, 杨再玲, 鄢东海, 李晔, 王严影, 杨育坤, 何洁, 吕冠柯, 蔡学敏, 舒丽萍, 何志旭, 潘兴华. 骨髓间充质干细胞调控猕猴卵巢的衰老[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 985-991.
[5]	胡伟, 谢兴奇, 屠冠军. 骨髓间充质干细胞来源外泌体改善脊髓损伤后血脊髓屏障的完整性[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 992-998.
[6]	侯婧瑛, 郭天柱, 于萌蕾, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理通过激活MALAT1靶向抑制miR-195促进骨髓间充质干细胞的生存和血管形成[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1005-1011.
[7]	冯建波, 李陈诚, 刘金月, 王小敏, 彭笳宸. 金黄色葡萄球菌生物膜克氏针置入建立创伤性大鼠骨髓炎模型[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 700-705.
[8]	康坤龙, 王新涛. 生物支架材料促进骨髓间充质干细胞成骨分化的研究热点[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 597-603.
[9]	曹炜, 冒符荣, 胡小华, 杨晓红. N-6甲基腺嘌呤RNA甲基化调控骨髓间充质干细胞的成骨及成脂分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(2): 266-270.
[10]	孙友强, 马超, 梁萌梦, 辛鹏飞, 张华, 向孝兵. 自噬在骨细胞中重要作用的最新研究进展：骨相关细胞活性和骨代谢[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(2): 276-282.
[11]	范丹阳, 付润泽, 米佳静, 刘春艳. 骨改建过程中大麻素受体的表达及作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(2): 283-288.
[12]	周宏博, 喻正文, 刘建国. 医用金属植入材料促进骨再生的分子机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(10): 1661-1670.
[13]	宋慧芳, 谈佳音, 康毅, 李斌, 毕志斐, 龙女, 夏仲年, 郭蕊. 低氧预处理增强老年人骨髓间充质干细胞条件培养基对H9C2细胞氧化应激损伤的保护作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 1-6.
[14]	梅运运, 张建军, 王东. 高压氧联合NgR基因沉默骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 12-19.
[15]	谢兴奇, 胡伟, 屠冠军. 骨髓间充质干细胞来源外泌体与硫酸软骨素酶ABC联合治疗大鼠脊髓损伤[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 20-26.