诱导多能干细胞分化的心肌细胞电生理特点

doi:10.12307/2022.145

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (7): 1063-1067.doi: 10.12307/2022.145

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

诱导多能干细胞分化的心肌细胞电生理特点

熊挺淋1，应梦慧2，张丽莎1，张晓刚3，杨燕4

1南充市中心医院心内科•川北医学院第二临床医学院，四川省南充市 637000；2四川省医学科学院•四川省人民医院，四川省成都市 610000；3重庆医科大学附属第一医院，重庆市 400016；4四川驰鼎盛通生物科技有限公司，四川省成都市 610041

收稿日期:2021-01-18 修回日期:2021-01-20 接受日期:2021-02-23 出版日期:2022-03-08 发布日期:2021-10-29
通讯作者: 张晓刚，教授，重庆医科大学附属第一医院，重庆市 400016
作者简介:熊挺淋，男，1986年生，重庆市人，汉族，2012年重庆医科大学毕业，硕士，主治医师，主要从事心肌细胞再生研究及冠心病介入治疗。
基金资助:
四川省科学技术厅重点研发项目(2019YFS0314)，项目负责人：杨燕

Electrophysiological characteristics of cardiomyocytes differentiated from induced pluripotent stem cells

Xiong Tinglin1, Ying Menghui2, Zhang Lisha1, Zhang Xiaogang3, Yang Yan4

1Department of Cardiology, Nanchong Central Hospital, Second Clinical Medical College, North Sichuan Medical College, Nanchong 637000, Sichuan Province, China; 2Sichuan Academy of Medical Sciences, Sichuan Provincial People’s Hospital, Chengdu 610000, Sichuan Province, China; 3First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China; 4Sichuan Chidingshengtong Biological Technology Co., Ltd., Chengdu 610041, Sichuan Province, China

Received:2021-01-18 Revised:2021-01-20 Accepted:2021-02-23 Online:2022-03-08 Published:2021-10-29
Contact: Zhang Xiaogang Professor, First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China
About author:Xiong Tinglin, Master, Attending physician, Department of Cardiology, Nanchong Central Hospital, Second Clinical Medical College, North Sichuan Medical College, Nanchong 637000, Sichuan Province, China
Supported by:
the Key Research & Development Project of Sichuan Provincial Department of Science and Technology, No. 2019YFS0314 (to YY)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
诱导多能干细胞：是具有类似胚胎干细胞的多能性细胞，解决了胚胎干细胞用于移植治疗存在的伦理及免疫排斥难题。
心肌细胞：是一种终末分化细胞，心肌梗死或者其他创伤导致心肌细胞死亡，其损伤是不可逆的。目前已证实包括诱导多能干细胞在内的干细胞能够定向分化为心肌细胞，但目前很少有研究分化心肌细胞的电生理特点。
背景：诱导多能干细胞定向分化后移植治疗解决了免疫排斥及伦理问题，其向心肌细胞的定向分化为心肌细胞再生研究提供了可能。
目的：观察诱导多能干细胞分化的心肌细胞电生理功能。
方法：体外培养诱导多能干细胞，采用直接悬浮培养法及分化培养基诱导形成拟胚体，观察细胞生长情况，记录心肌细胞的形成时间、数目和收缩率；使用Axon Axopatch 200B单探头超低噪声膜片钳放大器及MED64多电极阵列系统检测心肌细胞的电生理特点，以及观察分化心肌细胞对异丙肾上腺素的反应性；免疫荧光检测分化心肌细胞中心肌肌钙蛋白T的表达。
结果与结论：①诱导多能干细胞生长特点与胚胎干细胞相似，形似鸟巢，呈集落样生长；②在分化培养基培养下，悬浮培养5 d后诱导多能干细胞聚集而形成大小不一的拟胚体，在拟胚体贴壁生长期间，最高将近10%的菌落出现跳动的心肌细胞，第20天和第25天时的搏动率明显高于其他时间点，差异有显著性意义(P < 0.05)；③诱导多能干细胞分化的心肌细胞观察到了心室、心房和窦房结样细胞的动作电位；④异丙肾上腺素可以提高诱导多能干细胞分化的心肌细胞自发搏动频率；⑤细胞免疫荧光提示诱导多能干细胞分化的心肌细胞中肌钙蛋白T呈阳性表达；⑥结果表明，诱导多能干细胞分化的心肌细胞具有窦房结样、心房样和心室样的动作电位，且具有肾上腺素信号传导。

https://orcid.org/0000-0003-0846-4515(熊挺淋)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 诱导多能干细胞, 心肌细胞, 胚胎干细胞, 拟胚体, 分化, 动作电位, 电生理, 异丙肾上腺素

Abstract: BACKGROUND: Transplantation therapy after the directional differentiation of induced pluripotent stem cells can solve the immune elimination and ethical problems, and directional differentiation of induced pluripotent stem cells into cardiomyocytes provides the possibility of cardiomyocyte regeneration research.
OBJECTIVE: To detect the electrophysiological function of cardiomyocytes differentiated from induced pluripotent stem cells.
METHODS: By culturing induced pluripotent stem cells in vitro, direct suspension culture and differentiation medium were used to induce induced pluripotent stem cells to form embryoid bodies. Cell growth was observed and formation time, number and contraction rate of cardiomyocytes were recorded. The electrophysiological characteristics of cardiomyocytes were detected by Axon Axopatch 200B single probe ultra-low noise patch clamp amplifier and MED64 multi-electrode array system. The responsiveness of differentiated cardiomyocytes to isoproterenol was observed. Cardiac troponin T expression levels in differentiated cardiomyocytes were detected by immunofluorescence.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The growth characteristics of induced pluripotent stem cells were similar to embryonic stem cells, resembling a bird’s nest and growing like a colony. (2) In the differentiation medium culture, induced pluripotent stem cells aggregated to form embryoid bodies of different sizes after 5 days of suspension culture. During the adherent growth of embryoid bodies, up to 10% of the colonies appeared beating cardiomyocytes, and the beating rate on the 20th and 25th days was significantly higher than other time points (P < 0.05). (3) Action potentials of ventricular, atrial and sinoatrial nodular cells were observed in induced pluripotent stem cells differentiated cardiomyocytes. (4) Isoproterenol could increase the spontaneous beat frequency of cardiomyocytes differentiated from induced pluripotent stem cells. (5) Cellular immunofluorescence indicated that cardiomyocytes differentiated from induced pluripotent stem cells were positive for cardiac troponin T. (6) The results confirm that cardiomyocytes differentiated from induced pluripotent stem cells have sinoatrial-like, atrial-like and ventricular-like action potentials, and have adrenaline signal transduction.

Key words: stem cell, induced pluripotent stem cell, cardiomyocyte, embryonic stem cell, embryoid body, differentiation, action potential, electrophysiology, isoproterenol

中图分类号:

熊挺淋, 应梦慧, 张丽莎, 张晓刚, 杨燕. 诱导多能干细胞分化的心肌细胞电生理特点[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1063-1067.

Xiong Tinglin, Ying Menghui, Zhang Lisha, Zhang Xiaogang, Yang Yan. Electrophysiological characteristics of cardiomyocytes differentiated from induced pluripotent stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(7): 1063-1067.

图/表（结果） 6

2.1 诱导多能干细胞和拟胚体的形态生长在小鼠胚胎成纤维细胞上的诱导多能干细胞生长特点与胚胎干细胞相似，形似鸟巢，呈集落样生长，集落呈隆起的圆形、椭圆形或不规则形态，折光性强，集落中的细胞紧密地聚集在一起，界限和形态不清，见图1A。荧光显微镜下克隆团呈现出绿色荧光(Oct-4启动)，见图1B，表明诱导多能干细胞仍维持干细胞特性。去除小鼠胚胎成纤维细胞饲养层和培养基中的白血病抑制因子，经过5 d的悬浮培养后，诱导多能干细胞聚集而形成大小不一的拟胚体，在一个35 mm细菌培养皿中可形成100-200个的拟胚体，见图1C。

2.2 诱导多能干细胞分化的心肌细胞形态及收缩率显微镜下观察贴壁后生长的拟胚体，大量分化的细胞从拟胚体贴壁的周边部位长出，呈现出上皮样或成纤维样细胞形态，出现搏动的部位在细胞生长晕附近，呈团状搏动，不能分辨单个细胞形态，见图2A。在实验期内，最高有将近10%的菌落出现跳动的心肌细胞，第20天和第25天时的搏动率明显高于其他时间点，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图2B，搏动部位的频率随着时间的增加逐渐增快，达到高峰时的大部分博动频率为60-100次/min，少于60次/min或多于100次/min的细胞团较少，此后随着培养时间的延长，博动的频率开始逐渐下降。

2.3 诱导多能干细胞分化的心肌细胞电生理学特征为了对诱导多能干细胞分化的心肌细胞电生理功能进行初步评估，在拟胚体形成后10-30 d，对自发收缩拟胚体的生长进行了清晰的微电极记录，观察到了3种主要的动作电位类型：心室、心房和窦房结。心室样细胞动作电位，见图3A，通常表现出更大的负最大舒张电位，动作电位快速上升和明显的平台期。心房样细胞动作电位与心室样细胞动作电位的区别在于复极化过程中没有明显的平台期，并且通常还表现出自发活动，其自发活动的频率高于心室样细胞，见图3B。窦房结样细胞最大舒张电位低于心室样细胞和心房样细胞的负电位，较低的动作电位，较慢的动作电位上升以及在动作电位上升之前显著的第4期去极化，且自发活动的频率高于心室样细胞和心房样细胞，见图3C。同时，比较了诱导多能干细胞分化的心肌细胞自发搏动率(每分钟心跳数)、动作电位上升的最大速率(dv/dtmax)、动作电位振幅(APA)、动作电位的平均最大舒张电位(MDP)、动作电位持续时间(APD)，见表1。

2.4 异丙肾上腺素对诱导多能干细胞分化的心肌细胞电活动的影响为了确定肾上腺素信号传导(一种典型的心肌细胞信号传导途径)是否在诱导多能干细胞分化的心肌细胞中起作用，进一步检测了诱导多能干细胞分化的心肌细胞对异丙肾上腺素的反应性。未加入异丙肾上腺素前，其自发搏动频率为55次/min左右，见图4A，而加入异丙肾上腺素之后，其自发搏动频率升至100次/min左右，见图4B。

2.5 免疫荧光染色结果搏动区域的拟胚体行细胞免疫荧光检测提示心肌细胞特异性肌钙蛋白T表达阳性，位于细胞质中，发出红色荧光，细胞核被DAPI标记呈蓝色荧光，见图5。

参考文献

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引言

心肌细胞是一种终末分化细胞，心肌梗死或者其他创伤导致心肌细胞死亡，其损伤是不可逆的。目前治疗心肌细胞损伤性疾病主要采取组织或者细胞移植，组织移植包括自体心肌组织移植以及异体心脏移植，胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞已证实能分化为心肌细胞而用于细胞移植[1-2]，但胚胎干细胞用于移植治疗一直存在着道德伦理及免疫排斥反应等需要解决的问题。TAKAHASHI等[3]成功将体细胞逆分化为类似胚胎干细胞的多能性细胞——诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)，尤其是患者本身特异性诱导多能干细胞的出现，完全克服了其他干细胞用于细胞移植治疗时的伦理和免疫排斥两大难题，是代替其他干细胞的最佳选择。目前已有很多研究，包括作者团队之前的研究表明，诱导多能干细胞在体外可以分化为心肌细胞或者心肌样细胞，在某些细胞因子或者化学物质的干预下，甚至可以提高诱导多能干细胞向心肌细胞的分化效率，并表达心肌特异性基因和蛋白[4-6]，因此诱导多能干细胞有希望提供大量患者特异性成体细胞用于心脏修复，而不会产生免疫排斥反应。鉴于将诱导多能干细胞衍生的心肌细胞作为心脏疾病的体外模型或其他研究应用，需要对分化心肌细胞的特点进行相关功能研究，因此评估诱导多能干细胞的心脏形成能力及分化心肌细胞的功能学研究是必要的。但目前很少有研究分化心肌细胞的电生理特点以及心肌细胞特异性的信号通路。因此，该研究在体外培养诱导多能干细胞并制备拟胚体，诱导其向心肌细胞分化，观察分化心肌细胞生长特点及搏动率，细胞免疫荧光法检测心肌特异性蛋白的表达，使用单探头超低噪声膜片钳放大器测量跳动拟胚体中单个心肌细胞的膜电位，使用MED64多电极阵列系统记录分化心肌细胞的电生理特点，以及研究分化心肌细胞对异丙肾上腺素的反应性，以证明分化心肌细胞存在肾上腺素信号传导。

材料方法

1.1 设计体外观察性实验，细胞功能检测数据采用两独立样本均数的t 检验。
1.2 时间及地点实验于2018年9月至2019年10月在重庆医科大学完成。
1.3 材料
1.3.1 实验所用细胞次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核苷转移酶基因缺陷和绿色荧光蛋白转基因(Oct-4)的诱导多能干细胞购自中国科学院动物研究所；小鼠胚胎成纤维细胞为课题组自行制备[7]。
1.3.2 实验试剂和仪器 DMEM-H培养基、体积分数为10%胎牛血清(Gibco公司)；β-巯基乙醇、L-谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、胰酶、DAPI(Sigma公司)；白血病抑制因子(Millipore
公司)；丝裂霉素C、多聚甲醛(Roche公司)；EDTA、0.1% Triton X-100(Genview公司)；KCl、 NaCl、NaH2PO4、
MgCl2、CaCl2、NaOH、磷酸肌酸、HEPES、L-天冬氨酸(北京鼎国生物工程公司)；异丙肾上腺素(北京双鹤药业公司)；肌钙蛋白T单克隆抗体、TRITC标记的兔抗山羊IgG荧光二抗(Santa Cruz公司)；Mg-ATP、Na-GTP(上海如吉生物科技发展有限公司)；Axon Axopatch 200B 单探头超低噪声膜片钳放大器、pClamp 9.2软件(Molecular Devices公司)；MED64多电极阵列(日本Alpha公司)；显微镜(Olympus公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 诱导多能干细胞培养诱导多能干细胞生长培养基(DMEM-H、体积分数为10%胎牛血清、0.1 mmol/L β-巯基乙醇、1%非必需氨基酸、0.1 mmol/L L-谷氨酰胺、1 000 U/mL
白血病抑制因子)；诱导多能干细胞保存在液氮中，复苏后接种在经丝裂霉素C处理过的小鼠胚胎成纤维细胞上，每天半量更换生长培养基，当克隆团过大或过密时用0.05%胰酶+
0.1 mmol/L EDTA溶液消化传代，传代时先差速贴壁1 h去除小鼠胚胎成纤维细胞，再将悬液重新接种到刚准备的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上。细胞均置于37 ℃、体积分数为5%CO2培养箱培养。
1.4.2 拟胚体的制备取对数生长期的诱导多能干细胞，0.05%胰酶+0.1 mmol/L EDTA溶液消化制成单细胞悬液，差速贴壁1 h去除小鼠胚胎成纤维细胞，吸取细胞悬液直接接种于100 mm细菌培养皿进行悬浮培养，每皿加入10 mL分化培养基(DMEM-H、体积分数为10%胎牛血清、0.1 mmol/L β-巯基乙醇、0.1 mmol/L L-谷氨酰胺、1%非必需氨基酸)，每天轻轻吹吸拟胚体数次以防止拟胚体贴壁，每隔1 d半量换液1次，持续培养5 d。细胞均置于37 ℃、体积分数为5%CO2培养箱培养。
1.4.3 诱导拟胚体向心肌细胞分化在体视学显微镜下吸出悬浮培养5 d的拟胚体并接种于96孔培养板，让其贴壁生长，加入分化培养基(DMEM-H、体积分数为10%胎牛血清、
0.1 mmol/L β-巯基乙醇、0.1 mmol/L L-谷氨酰胺、1%非必需氨基酸)，每天换液1次，分别在拟胚体贴壁生长后第10，15，20，25，30天时检测搏动比率。
1.4.4 电生理检测
(1)灌注液成分包含140 mmol/L NaCl、5.4 mmol/L KCl、1.8 mmol/L CaCl2、1 mmol/L MgCl2、10 mmol/L Hepes、10 mmol/L葡萄糖，pH值7.4。移液器成分包含110 mmol/L L-天冬氨酸、30 mmol/L KCl、5 mmol/L Mg-ATP、0.1 mmol/L Na-GTP、5 mmol/L磷酸肌酸、2 mmol/L EGTA，10 mmol/L HEPES、10 mmol/L NaOH，pH值7.2。
(2)搏动的拟胚体形成后，使用Axon Axopatch 200B 单探头超低噪声膜片钳放大器测量跳动拟胚体中单个心肌细胞的膜电位，使用MED64多电极阵列系统记录，并使用pClamp 9.2软件在10 kHz下采集数据。为了检测诱导多能干细胞分化的心肌细胞对异丙肾上腺素的反应性，在培养基中加入1 μmol/L异丙肾上腺素，在37 ℃下以1.7 mL/min的速度连续灌注分化培养基，也使用Axon Axopatch 200B 单探头超低噪声膜片钳放大器测量单个心肌细胞的膜电位，使用MED64多电极阵列系统记录，并使用pClamp 9.2软件在10 kHz
下采集数据。为了进行分析，使用频率为2 kHz的低通高斯滤波器离线过滤数据。所有记录测量均在37 ℃下使用加热灌注系统进行。
1.4.5 免疫荧光染色搏动的拟胚体培养在玻璃载玻片上，PBS洗涤3次，40 g/L多聚甲醛在室温条件下固定30 min，在室温下用0.1% Triton X-100穿孔10 min，PBS洗涤3次，然后用1%牛血清白蛋白封闭30 min，甩掉多于的封闭液，在37 ℃下用PBS稀释的单克隆山羊抗心肌肌钙蛋白T一抗(1∶100)孵育2 h，一抗孵育后用PBS洗3次，在37 ℃下用PBS稀释的TRITC标记的兔抗山羊IgG二抗(1∶100)孵育2 h，二抗孵育后用PBS洗3次，DAPI复染细胞核，最后抗淬灭剂封固以及用荧光显微镜照相。
1.5 主要观察指标分化心肌细胞的形态、搏动率以及电生理特点。
1.6 统计学分析使用SPSS 21.0软件进行统计学分析。计量数据以x±s表示，两组间比较采用两独立样本均数的t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

目前大多数诱导多能干细胞心脏分化主要使用经典的拟胚体介导法[8-9]。与以前的研究结果一样，在体外培养诱导多能干细胞，在去除白血病抑制因子的分化培养基中能够形成拟胚体，继续让拟胚体贴壁生长分化，随着时间的延长，可见搏动的拟胚体出现，细胞免疫荧光检测显示搏动细胞阳性表达心肌特异性蛋白肌钙蛋白T，表明诱导多能干细胞能够分化为心肌细胞[10]。该研究观察了拟胚体贴壁生长后30 d的搏动情况，最高只有将近10%的拟胚体出现跳动的心肌细胞，说明只有少数拟胚体能发育成心肌细胞，诱导多能干细胞形成搏动的拟胚体的效率比既往胚胎干细胞观察到的效率低。基于拟胚体搏动的百分比，说明不同时间点心肌分化的效率各不相同，与之前的研究指出人类胚胎干细胞系心脏发生效率有显著的时间性一致，这种效率不同的原因尚不清楚，可能与基础基因表达或表观遗传状态的细微差异有
关[11-12]。
该实验使用Axon Axopatch 200B 单探头超低噪声膜片钳放大器及MED64多电极阵列系统检测了分化心肌细胞的动作电位特点，根据不同动作电位特点，以及动作电位4期是否有自动去极化以及复极过程中有无平台期，进一步将分化心肌细胞区分为心室样细胞、心房样细胞和窦房结样细胞。分化心肌细胞动作电位上升的最大速率、动作电位振幅、动作电位的平均最大舒张电位、动作电位持续时间等结果与以前研究胚胎干细胞和诱导多能干细胞分化的心肌细胞动作电位特点一致[13-15]。心肌细胞动作电位是各种不同离子通道参与形成的，如0期去极化的Na通道、1期快速复极的K通道、2期平台期的L型Ca通道、K通道等，该研究观察到了3种主要的动作电位类型，心室样细胞的动作电位表现出更大的负最大舒张电位，动作电位快速上升和明显的平台期；心房样细胞的动作电位在复极化过程中没有明显的平台期；窦房结样细胞具有较低的动作电位，较慢的动作电位上升以及在动作电位上升之前显著的第4期去极化。目前对分化心肌细胞的自动节律机制未有确切的定论。既往的研究表明，If电流引起的去极化使心肌细胞膜电压上升，从而激活L型Ca2+通道，最终使Ca2+内流产生动作电位和自动节律。但也有研究表明阻断If电流对分化心肌细胞的自动节律性没有影响，分化心肌细胞存在自发的肌浆网释放Ca2+，而激活Na+-Ca2+通道，从而提供动作电位的去极化电流，这个离子交换通道促进L型Ca2+内流是引起分化心肌细胞自动节律的可能机
制[16]。
为了确定肾上腺素信号传导(一种典型的心肌细胞信号传导途径)是否在诱导多能干细胞分化的心肌细胞中起作用，进一步检测了诱导多能干细胞分化的心肌细胞对异丙肾上腺素的反应性，结果表明异丙肾上腺素的加入可以明显提高分化心肌细胞的自发搏动率。因此，该研究结果表明分化心肌细胞的电生理特征与原代心肌细胞的特点相似[17]，间接证实分化心肌细胞中可能具有Na通道、K通道、Ca通道以及存在肾上腺素信号传导等。与既往人类诱导多能干细胞分化的心肌细胞对各种离子通道阻滞剂的反应性和成年人心肌细胞相似的结果一致[18-19]。
该实验表明小鼠诱导多能干细胞可以定向和系统地诱导成各种心血管细胞，成功地建立了诱导多能干细胞的培养系统，以及在体外重现心血管细胞的分化和多样化过程，这有助于在细胞水平上了解该过程，可以使用该分化系统进一步研究诱导多能干细胞分化的分子机制，包括遗传和表观遗传方面等。该研究诱导多能干细胞的心血管细胞分化过程中，与既往胚胎干细胞向心肌细胞分化的时间进程、潜能和分化效率具有可比性，因此利用分化心肌细胞表达特异性心肌细胞蛋白，以及动作电位的特性可以鉴别分化心肌细胞的种类，对于了解细胞分化情况以及选择细胞种类的定向分化有很大的参考价值。

诱导多能干细胞分化的心肌细胞电生理特点

Electrophysiological characteristics of cardiomyocytes differentiated from induced pluripotent stem cells

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