阳和汤对早期膝骨关节炎模型兔滑膜炎症的影响

doi:10.12307/2022.113

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (5): 694-699.doi: 10.12307/2022.113

• 组织构建实验造模 experimental modeling in tissue construction • 上一篇下一篇

阳和汤对早期膝骨关节炎模型兔滑膜炎症的影响

何俊君1，2，黄泽灵1，洪振强1，2

福建中医药大学，1中医学院，2中医骨伤及运动康复教育部重点实验室，福建省福州市 350122

收稿日期:2020-11-10 修回日期:2020-11-13 接受日期:2020-12-31 出版日期:2022-02-18 发布日期:2021-10-28
通讯作者: 洪振强，硕士，副教授，硕士生导师，福建中医药大学中医学院，中医骨伤及运动康复教育部重点实验室，福建省福州市 350122
作者简介:何俊君，女，1992年生，福建省莆田市人，2019年福建中医药大学毕业，硕士，助教，主要从事中医药防治骨伤科疾病的临床与基础研究。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(81973880)，项目参与人：何俊君；福建省科技厅项目(2017J01830),项目负责人：洪振强；福建中医药大学“中医脾胃优势特色学科”建设项目(X2019006-学科)，项目负责人：洪振强

Interventional effect of Yanghe Decoction on synovial inflammation in a rabbit model of early knee osteoarthritis

He Junjun1, 2, Huang Zeling1, Hong Zhenqiang1, 2

1School of Traditional Chinese Medicine, 2Key Laboratory of Orthopedics & Traumatology of Traditional Chinese Medicine and Rehabilitation, Ministry of Education, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, Fujian Province, China

Received:2020-11-10 Revised:2020-11-13 Accepted:2020-12-31 Online:2022-02-18 Published:2021-10-28
Contact: Hong Zhenqiang, Master, Associate professor, Master’s supervisor, School of Traditional Chinese Medicine, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, Fujian Province, China; Key Laboratory of Orthopedics & Traumatology of Traditional Chinese Medicine and Rehabilitation, Ministry of Education, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, Fujian Province, China
About author:He Junjun, Master, Assistant teacher, School of Traditional Chinese Medicine, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, Fujian Province, China; Key Laboratory of Orthopedics & Traumatology of Traditional Chinese Medicine and Rehabilitation, Ministry of Education, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, Fujian Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China (General Program), No. 81973880 (to HJJ [project participant]); a grant from Fujian Provincial Science and Technology Department, No. 2017J01830 (to HZQ); Characteristic Discipline Construction Project of Fujian University of Traditional Chinese Medicine, No. X2019006-Discipline (to HZQ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
阳和汤：源自清代王洪绪《外科证治全生集》，全方由熟地、鹿角胶、肉桂、炮姜碳、麻黄、白芥子、生甘草组成，具有温阳养血化痰、散寒通滞的功效，主治阳虚寒凝证。
骨关节炎：是一种以关节软骨退行性变和继发性骨质增生为特征的慢性关节疾病，主要症状包括关节疼痛、活动受限和关节畸形等，又称退行性关节炎。

背景：阳和汤是临床治疗膝骨关节炎的有效方药，前期基础研究表明阳和汤防治骨关节炎的机制与其对关节软骨的保护有关，阳和汤对膝骨关节炎早期滑膜炎症的影响尚未明确。
目的：探讨阳和汤对早期膝骨关节炎模型兔滑膜炎症的影响，进一步明确阳和汤治疗早期骨关节炎的疗效及作用机制。
方法：将24只4月龄新西兰兔随机分为空白对照组、模型组、阳和汤组和阳性对照组，每组6只。除空白对照组外，其余各组予关节腔注射木瓜蛋白酶造模。造模2周后，空白对照组和模型组给予等量生理盐水灌胃，阳和汤组给予6 g/(kg•d)阳和汤灌胃，阳性对照组给予24 mg/(kg•d)塞来昔布药物灌胃，连续给药2周。最后一次给药后4 h，测量膝关节局部皮温、关节周径，Lequesne评分评估膝关节功能；最后一次灌胃结束后第2天，ELISA法检测关节液中白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、环氧化酶2、前列腺素E2水平；苏木精-伊红染色观察滑膜组织形态；免疫组织化学染色观察滑膜组织中白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、环氧化酶2蛋白表达。
结果与结论：①与空白对照组比较，模型组膝关节周径增宽(P < 0.05)，局部皮温、Lequesne评分及关节液中白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、环氧化酶2、前列腺素E2水平均升高(P < 0.05)，滑膜形态学炎性改变明显，滑膜组织中白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、环氧化酶2蛋白表达均升高(P < 0.05)；②与模型组比较，阳和汤组和阳性对照组膝关节周径减小(P < 0.05)，局部皮温、Lequesne评分及关节液中肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、环氧化酶2、前列腺素E2水平均降低(P < 0.05)，滑膜炎性改变减轻，滑膜组织中白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、环氧化酶2蛋白表达均降低(P < 0.05)；③结果表明，阳和汤能抑制早期膝骨关节炎模型兔关节液和滑膜组织中肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、环氧化酶2、前列腺素E2的表达，减轻滑膜炎症，改善关节功能，从而延缓膝骨关节炎的进展。

https://orcid.org/0000-0002-1388-6184 (何俊君)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 阳和汤, 膝骨关节炎, 滑膜, 疼痛, 炎症, 机制, 新西兰兔

Abstract: BACKGROUND: Yanghe Decoction is an effective prescription for the clinical treatment of knee osteoarthritis. Our previous basic studies have shown that the mechanism of Yanghe Decoction to prevent and treat knee osteoarthritis is related to the protection of articular cartilage. It is still not unclear about the effect of Yanghe Decoction on early synovial inflammation of knee osteoarthritis.
OBJECTIVE: To investigate the effect of Yanghe Decoction on the pain and synovial inflammation in a rabbit model of early knee osteoarthritis, and to further clarify the efficacy and mechanism of Yanghe Decoction in the treatment of early osteoarthritis.
METHODS: Twenty-four 4-month-old New Zealand rabbits were randomly divided into blank control group, model group, Yanghe Decoction group and positive control group, with six rabbits in each group. Except for the blank control group, the rabbits in the other groups were injected with papain into the joint cavity for modeling. Two weeks after modeling, the blank control and model groups were given the same amount of normal saline by gavage, the Yanghe Decoction group was given 6 g/kg/d Yanghe Decoction, and the positive control group was given 24 mg/kg/d Celebrex. Administration in each group lasted for 2 weeks. At 4 hours after final administration, the knee joint skin temperature and circumference were measured, and Lequesne MG score was used to evaluate knee joint function. At 2 days after final intragastric administration, ELISA was used to detect the levels of interleukin-1β, tumor necrosis factor-α, cyclooxygenase-2, and prostaglandin E2 in the synovial fluid. Synovial tissue morphology was observed using hematoxylin-eosin staining. Immunohistochemical detection was conducted to detect the expression of interleukin-1β, tumor necrosis factor-α, cyclooxygenase-2 proteins in synovial tissue.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the blank control group, the knee joint circumference in the model group was widened (P < 0.05), and the local skin temperature, Lequesne MG score, and the levels of interleukin-1β, tumor necrosis factor-α, cyclooxygenase-2, and prostaglandin E2 in the synovial fluid were all increased (P < 0.05), synovial membrane morphology and inflammatory changes were obvious, and the expressions of interleukin-1β, tumor necrosis factor-α, cyclooxygenase-2 proteins in synovial tissue were all increased (P < 0.05). Compared with the model group, the knee joint circumference in the Yanghe Decoction group and positive control group decreased (P < 0.05), local skin temperature, Lequesne MG score, and the levels of interleukin-1β, tumor necrosis factor-α, cyclooxygenase-2, and prostaglandin E2 in the synovial fluid were all decreased (P < 0.05), synovial membrane morphology and inflammatory changes were alleviated, and the expressions of interleukin-1β, tumor necrosis factor-α, cyclooxygenase-2 proteins in synovial tissue were all downregulated (P < 0.05). In conclusion, Yanghe Decoction can inhibit the expression of interleukin-1β, tumor necrosis factor-α, cyclooxygenase-2, and prostaglandin E2, reduce synovial inflammation, and improve joint function, thereby delaying the progression of knee osteoarthritis.

Key words: Yanghe Decoction, early knee osteoarthritis, synovium, pain, inflammation, mechanism of action, New Zealand rabbit

中图分类号:

何俊君, 黄泽灵, 洪振强. 阳和汤对早期膝骨关节炎模型兔滑膜炎症的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 694-699.

He Junjun, Huang Zeling, Hong Zhenqiang. Interventional effect of Yanghe Decoction on synovial inflammation in a rabbit model of early knee osteoarthritis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(5): 694-699.

图/表（结果） 8

2.1 动物一般情况及膝关节功能评估 24只兔全部纳入结果分析。与空白对照组比较，模型组兔出现患处压痛，患肢参与行走，但有明显跛行，患肢膝关节活动范围变小，轻度肿胀，骨性标记变浅。与模型组比较，阳和汤组及阳性对照组兔患处压痛刺激反应减小，膝关节肿胀度、跛行、膝关节活动范围及骨性标记触及情况均有所改善。各组Lequesne评分见表1。与空白对照组比较，模型组Lequesne评分升高(P < 0.05)；与模型组比较，阳和汤组及阳性对照组Lequesne评分均降低(P < 0.05)；与阳性对照组比较，阳和汤组评分较高(P < 0.05)。

2.2 各组兔膝关节周径、局部皮温与空白对照组比较，模型组兔膝关节周径增大(P < 0.05)，局部皮温升高(P < 0.05)；与模型组比较，阳和汤组和阳性对照组兔膝关节周径减小 (P < 0.05)，局部皮温降低(P < 0.05)；与阳性对照组比较，阳和汤组关节周径较宽(P < 0.05)，局部皮温无显著变化，见表2。

2.3 各组兔膝关节液中白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、环氧化酶2、前列腺素E2水平与空白对照组比较，模型组关节液中白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、环氧化酶2、前列腺素E2水平升高(P < 0.05)；与模型组比较，阳和汤组和阳性对照组关节液中白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、环氧化酶2、前列腺素E2水平降低(P < 0.05)；与阳性对照组比较，阳和汤组关节液中白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、环氧化酶2水平较高，但差异无显著性意义(P > 0.05)，阳和汤组关节液中前列腺素E2水平较高，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表3。

2.4 滑膜组织形态空白对照组滑膜表层分布平整，滑膜内衬层细胞层数为单层，细胞分布均匀，序列整齐，层次清晰可见，无血管增生，无纤维组织增生，无或偶见淋巴细胞；模型组可见表层细胞分布不平整，滑膜内衬层细胞层数增生明显，可达5-7层，细胞排列紊乱，可见较多单核巨噬细胞、淋巴细胞浸润和少量的中性粒细胞，有血管增生，纤维组织增生明显；阳和汤组可见滑膜表层分布略不平整，滑膜内衬层细胞层数少量增生，滑膜细胞少量增生排列紊乱，可见少数血管和纤维组织生成，偶见单核巨噬细胞、淋巴细胞；阳性对照组可见滑膜表层分布略不平整，滑膜内衬层细胞层数少量增生，滑膜细胞少量增生排列紊乱，血管生成较多。见图1。

2.5 各组兔滑膜组织中白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、环氧化酶2表达及积分吸光度值比较与空白对照组比较，模型组滑膜组织中白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、环氧化酶2表达增加，积分吸光度值升高(P < 0.05)；与模型组比较，阳和汤组和阳性对照组滑膜组织中白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、环氧化酶2表达减少，积分吸光度值降低(P < 0.05)；与阳性对照组比较，阳和汤组滑膜组织中白细胞介素1β表达较少，积分吸光度值较低(P < 0.05)，阳和汤组和阳性对照组滑膜组织中肿瘤坏死因子α、环氧化酶2表达差异无显著性意义(P > 0.05)，见表4，图2-4。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2018年1月至2019年2月在福建中医药大学完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 4月龄健康新西兰兔24只，雌雄各半，体质量(2.0±0.5) kg，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物生产许可证号[SCXK(沪)2012-0002]，委托福建中医药大学实验动物中心代购并饲养，实验单位使用许可证编号[SYXK(闽)2014-0006]。
1.3.2 实验药物阳和汤原方组成：熟地黄30 g、肉桂3 g、麻黄2 g、鹿角胶9 g、白芥子6 g、姜炭2 g、生甘草3 g，购于福建省第三人民医院；阳和汤药液的制备：全方中药先用500 mL冷水浸泡30 min，然后用煎药壶煎煮30 min，倒出第一次煎好的药液；再次向煎药壶中加水300 mL，第二次再煎煮30 min，将2次所煎得的药液混合，利用旋转蒸发仪浓缩成含生药1 g/mL的药液，于4 ℃冰箱中储存备用。
塞来昔布药物(国药准字：J20140072，辉瑞制药有限公司)购于福建省第三人民医院。
1.3.3 实验主要试剂及仪器木瓜蛋白酶(美国Sigma公司)；苏木精-伊红染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；即用型免疫组化试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司)；DAB显色试剂盒(博士德生物工程有限公司)；ELISA检测试剂盒(上海西唐生物科技有限公司)；自动脱水机、组织包埋机、光学显微镜(Leica公司)；酶标仪DENLEY DRAGON Wellscan MK 3(芬兰Thermo公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 动物分组与造模将24只4月龄健康新西兰兔按照随机数字表法分成空白对照组、模型组、阳和汤组和阳性对照组，每组6只。骨关节炎模型制备方法[15-18]：行腹腔注射20%乌拉坦(5 mL/kg)麻醉，仰卧位固定，在实验开始的第1，4，7天膝关节腔内注射4%木瓜蛋白酶0.1 mL。除空白对照组外，其余各组新西兰兔均进行造模。模型鉴定：首次注射药物2周后进行膝关节Lequesne评分[19]，总分≥4分表示造模成功，可纳入进行药物干预。
1.4.2 药物干预模型鉴定成功第2天开始进行药物干预，按成人体表面积与家兔体表面积换算[20]，阳和汤组给予 6 g/(kg•d)阳和汤灌胃，阳性对照组给予24 mg/(kg•d)塞来昔布药物灌胃，空白对照组、模型组给予等量生理盐水灌胃，1次/d，连续灌胃2周。
1.4.3 标本采集与制备最后一次灌胃结束后第2天取材，标本采集前12 h动物禁食不禁水，腹腔注射乌拉坦麻醉后，仰卧固定在手术台上，屈曲膝关节，行髌骨上缘横向切口，逐层分离至关节囊，缓慢屈伸膝关节并轻轻挤压膝关节内外侧，使关节液集中于胫骨平台周围，用注射器抽取关节液存入Ep管中并迅速投入液氮中保存。关节囊内面即滑膜，用有齿镊夹住髌骨轻轻向下翻，在胫骨平台下方的位置用手术刀切断组织(保留韧带)，用生理盐水漂洗后放入装有多聚甲醛的Ep管中固定，待固定结束后再分离滑膜。
1.5 主要观察指标 ①干预前后采用游标卡尺测量膝关节周径，红外线测温枪测量局部皮温，Lequesne评分评估干预前后膝关节功能[19]，主要从膝关节局部疼痛、步态、关节活动范围度及肿胀程度评估，总分11分，评分越高，膝关节功能越差；②ELISA检测关节液中白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、环氧化酶2、前列腺素E2水平，使用酶标仪检测 450 nm波长处吸光度值；③滑膜组织固定后进行常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片，苏木精-伊红染色观察滑膜组织病理形态；④免疫组化染色观察滑膜组织中白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、环氧化酶2蛋白表达。切片常规脱蜡至水后，于100 ℃的柠檬酸钠修复液中修复10 min，自然冷却至室温，PBS洗3次，将玻片放入湿盒中，在组织上滴加体积分数为3%过氧化氢去离子水室温孵育5-10 min以消除内源性过氧化物酶活性，PBS洗3次，将BSA封闭液滴到组织上，37 ℃孵育30 min，封闭结束后不需要清洗，直接滴加一抗，4 ℃孵育过夜，次日PBS洗3遍后滴加聚合HRP标记抗兔/鼠IgG，室温孵育10 min，PBS洗3遍，滴加提前避光配制的DAB显色液，约1 min后放入水中终止显色，苏木精复染细胞核，常规晾片、封固。各组织切片选取6个互不重叠的视野，采用Leica光学显微镜采集图像。以Motic Med 6.0光镜图像采集分析系统进行免疫组化染色结果分析，测定阳性颗粒积分吸光度。

1.6 统计学分析采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，以x±s表示，符合正态分布采用单因素方差分析，若方差齐，使用LSD法进行组间比较，若方差不齐，则采用Games-Howell法进行组间比较；非正态分布数据组间比较采用多样本秩和检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

以往骨关节炎被认为是非炎症性关节病，研究重点也集中在软骨的破坏机制方面。随着对此病研究的逐步深入，认识到膝骨关节炎病变也涉及其他组织(如滑膜、软骨下骨)，且越来越多的证据表明膝骨关节炎与滑膜炎症有关[21]。膝骨关节炎属中医“痹证”范畴，《中医病症诊断疗效标准》将其分为肾虚髓亏、阳虚寒凝、瘀血阻滞3个类型，其中阳虚寒凝型是临床膝骨关节炎患者常见的证型[22-25]，多因先天体质禀赋不足或年老素体阳虚，筋脉失温，寒从中生；或复感风寒湿邪，邪气结、聚于经筋组织(肌肉、韧带、滑膜等)，不通则痛，导致气血、阳气无法布达四肢，肢体关节失于濡养，经络筋脉收缩而挛急、屈伸不利[26-28]。阳和汤主治阳虚寒凝证，具有温阳补血、散寒通滞之功。阳和汤重用熟地以温补营血，配伍鹿角胶以养血壮阳、强壮筋骨，两药合用既养血，又补阳，以治其本。姜炭乃苦温之品，入血分，温经散寒。肉桂辛甘大热，功擅补火助阳散寒，两药合用，温通经脉，破阴回阳。麻黄散寒宣通，发越阳气，开腠祛邪，白芥子消痰散结，二药可助姜、桂以散寒凝。麻、芥、姜、桂诸温药合用，又可制熟地、鹿角胶之滋腻，使补而不滞，滋而不腻；加生甘草则解毒和药，实为治痹良方。研究表明，阳和汤可通过缓解疼痛，疏利关节来治疗膝骨关节炎，在临床可单独运用或作为辅助疗法，与关节腔注射玻璃酸钠、口服解热镇痛抗炎类药物等方法联合运用，长期疗效好。姜水现[8]用阳和汤治疗80例痛痹患者，结果显示总有效率达92.5%；汤俊等[9]采用阳和汤与口服盐酸氨基葡萄糖片对照治疗轻中度膝骨关节炎，疗程4周，发现阳和汤组疼痛、僵硬、活动功能评分均优于对照组(P < 0.05)；丑钢等[10]选择108例膝骨关节炎患者，随机分为对照组54例和治疗组54例，对照组给予膝关节腔内注射玻璃酸钠，治疗组在对照组治疗的基础上给予阳和汤，共治疗5周，结果显示口服阳和汤配合玻璃酸钠注射治疗膝骨关节炎的疗效比单纯玻璃酸钠注射更佳，膝关节症状改善更明显。
膝骨关节炎的疼痛机制与滑膜病变、神经递质及细胞因子释放等有关[29-30]。张华伟等[31]对80例膝骨关节炎患者行MRI检查，并对疼痛进行评定，结果发现MRI显示的滑膜炎与膝负重疼痛独立相关。膝骨关节炎滑膜炎症的特征主要是免疫细胞浸润和炎症递质、细胞因子的产生，其中炎症递质在启动和持续膝骨关节炎过程中发挥关键作用[32]。在生理状态下，环氧化酶2与诱导型一氧化氮合酶含量极低，当膝骨关节炎滑膜发生炎症时会分泌大量的白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α，诱导环氧化酶2的表达迅速增加，各因子之间存在的交叉性作用导致了疼痛的产生及膝骨关节炎的进展[33]。白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α是导致膝骨关节炎发生的重要细胞因子，直接参与滑膜炎性病变，而肿瘤坏死因子α还可促进胶原酶和前列腺素E2的产生[34-35]。前列腺素E2是有强烈致痛作用的炎症因子，它能直接激活滑膜组织中的痛觉感受器或软骨下骨内的感觉神经纤维[36]，增强外周神经的敏感性，而环氧化酶2的合成与表达量增加也会进一步诱导产生大量前列腺素E2，导致疼痛加重。
该研究采用关节腔内注射木瓜蛋白酶建立早期膝骨关节炎模型，以局部皮温、膝关节周径与动物行为学相结合对模型进行评价，结果显示：与空白对照组比较，模型组出现活动减少，局部皮温升高，关节周径变宽，患处压痛，患肢参与行走，但有明显跛行，患肢膝关节活动范围变小，轻度肿胀，骨性标记变浅；Lequense评分升高，滑膜炎症明显，符合早期膝骨关节炎症状。给予药物干预后，阳和汤组和阳性对照组关节周径均减小，局部皮温均降低，跛行及关节活动范围改善。阳和汤组与阳性对照组Lequense评分均有所降低，而二者差异无显著性意义，说明阳和汤和塞来昔布药物均能有效改善兔膝骨关节炎模型的局部疼痛刺激、步态、关节活动范围及滑膜组织炎症，且二者疗效相当。关节液及滑膜组织炎症因子检测结果显示，阳和汤组和阳性对照组关节液中白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、环氧化酶2、前列腺素E2水平降低，滑膜组织中白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、环氧化酶2蛋白表达减少，说明阳和汤和塞来昔布药物均能降低早期膝骨关节炎关节液和滑膜组织中白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、环氧化酶2、前列腺素E2的表达。
综上所述，阳和汤能有效改善早期膝骨关节炎模型兔膝关节局部疼痛反应及关节功能，其机制可能与抑制滑膜炎症，减少膝骨关节炎早期关节液和滑膜组织中白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、环氧化酶2、前列腺素E2等炎症因子表达有关。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

阳和汤对早期膝骨关节炎模型兔滑膜炎症的影响

Interventional effect of Yanghe Decoction on synovial inflammation in a rabbit model of early knee osteoarthritis

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