灸法预处理脑缺血再灌注模型大鼠自噬及NLRP3炎症小体的表达

doi:10.12307/2022.658

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (23): 3615-3619.doi: 10.12307/2022.658

• 组织构建实验造模 experimental modeling in tissue construction • 上一篇下一篇

灸法预处理脑缺血再灌注模型大鼠自噬及NLRP3炎症小体的表达

蒋洁1，2，赵百孝2，陈立彬1，文丽1，张珊珊1，马杰1，赵华1

1新疆医科大学中医学院，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054；2北京中医药大学针灸推拿学院，北京市 102488

收稿日期:2021-07-17 接受日期:2021-10-11 出版日期:2022-08-18 发布日期:2022-02-15
通讯作者: 赵华，教授，新疆医科大学中医学院，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054
作者简介:蒋洁，女，1981年生，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市人，汉族，硕士，讲师，主要从事针灸作用机制的研究。
基金资助:
新疆维吾尔自治区自然科学基金(2019D01C203)，项目负责人：蒋洁；国家自然科学基金(81460741)，项目负责人：赵华；新疆维吾尔自治区高校科研计划(XJEDU2021Y025)，项目负责人：蒋洁

Effect of moxibustion pretreatment on autophagy and NLRP3 inflammasome expression in cerebral ischemia-reperfusion model rats

Jiang Jie1, 2, Zhao Baixiao2, Chen Libin1, Wen Li1, Zhang Shanshan1, Ma Jie1, Zhao Hua1

1Xinjiang Medical University College of Traditional Chinese Medicine, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 2School of Acupuncture and Tuina, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 102488, China

Received:2021-07-17 Accepted:2021-10-11 Online:2022-08-18 Published:2022-02-15
Contact: Zhao Hua, Professor, Xinjiang Medical University College of Traditional Chinese Medicine, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Jiang Jie, Master, Lecturer, Xinjiang Medical University College of Traditional Chinese Medicine, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; School of Acupuncture and Tuina, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 102488, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81460741 (to ZH); the Natural Science Foundation of Xinjiang Uygur Autonomous Region, No. 2019D01C203 (to JJ); Xinjiang Uygur Autonomous Region University Scientific Research Program, No. XJEDU2021Y025 (to JJ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
灸法预处理：艾灸预处理属于中医治未病的范畴，在前驱症状出现时给予艾灸预处理在多种疾病发病过程中可明显减轻发病症状，延缓发病进程。
自噬：是维持细胞生理功能平衡的重要调节机制，在急性缺血、损伤等应激状态下，自噬功能的正常维持可对机体起到良性的双向调节作用。

背景：灸法作为中医学疗法之一在防治脑卒中方面显示出明显的临床疗效。
目的：探讨灸法预处理对脑缺血再灌注模型大鼠自噬及NLRP3炎症小体表达的影响。
方法：采用随机数字表法将36只SD大鼠分为假手术组、模型组、灸法预处理组，每组12只。灸法预处理组在造模前给予百会、大椎、足三里麦粒灸3壮/穴，1次/d，共治疗7 d。灸法预处理组末次艾灸30 min后，模型组和灸法预处理组大鼠采用大脑中动脉线栓法制备大脑中动脉阻塞模型，脑缺血处理2 h后拔除中动脉线栓进行再灌注；假手术组仅给予颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉剥离，而并不插入线栓。再灌注12 h后，对3组大鼠进行进行神经功能缺损评分，采用TTC染色法计算大鼠脑梗死体积，Western-blot法检测大脑皮质缺血区中自噬相关蛋白Beclin1、p62及NLRP3炎症小体的蛋白表达。
结果与结论：①模型组大鼠神经功能缺损评分高于假手术组(P < 0.01)，灸法预处理组大鼠神经功能缺损评分低于模型组(P < 0.01)；②TTC染色显示，假手术组大鼠脑组织未见明显梗死灶，模型组、灸法预处理组大鼠右侧脑组织可见明显缺血灶，其中灸法预处理组大鼠右侧脑梗死体积小于模型组(P < 0.01)；③Western-blot检测显示，与假手术组比较，模型组、灸法预处理组Beclin1、NLRP3蛋白表达升高(P < 0.01)，p62蛋白表达降低(P < 0.01)；与模型组比较，灸法预处理组Beclin1蛋白表达升高(P < 0.05)，p62及NLRP3蛋白表达降低(P < 0.01)；④结果表明，灸法预处理可显著改善缺血再灌注后大鼠的神经功能，其机制可能与激活自噬抑制炎症因子表达有关。

https://orcid.org/0000-0001-6517-8617 (蒋洁)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 灸法预处理, 缺血再灌注, 自噬, Beclin1, p62, NLRP3炎症小体

Abstract: BACKGROUND: Moxibustion as one of the Chinese medicine therapies has shown significant clinical efficacy in the prevention and treatment of stroke.
OBJECTIVE: To explore the effect of moxibustion pretreatment on autophagy and NLRP3 inflammasome expression in rats with cerebral ischemia reperfusion.
METHODS: Thirty-six Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham operation group, model group, and moxibustion pretreatment group, with 12 rats in each group. The moxibustion pretreatment group was given moxibustion at Baihui, Dazhui, and Zusanli before modeling. Each acupoint was given moxibustion for 3 strengths, once a day for 7 days. In the model and moxibustion pretreatment groups, the rat model of middle cerebral artery occlusion was made by suturing of the middle cerebral artery 30 minutes after the last moxibustion. After 2 hours of cerebral ischemia, the middle artery suture was removed and the rats were reperfused for 12 hours. In the sham operation group, only the common carotid artery, internal carotid artery, and external carotid artery were dissected without suturing the middle cerebral artery. The neurological deficit score was assessed, the cerebral infarct volume was calculated using 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride staining, and the expression levels of autophagy-related proteins Beclin1, p62 and NLRP3 inflammasome in cerebral cortex ischemic area were detected using western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: The neurological deficit score in the model group was significantly higher than that in the sham operation group (P < 0.01), and the neurological deficit score of the moxibustion pretreatment group was significantly lower than that of the model group (P < 0.01). 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride staining results showed that there were no obvious infarcts in the brain tissue of rats in the sham operation group, and obvious ischemic lesions were detected in the right brain tissue of rats in the model and moxibustion pretreatment groups. The infarct volume in the moxibustion pretreatment group was significantly less than that in the model group (P < 0.01). Western blot results showed that compared with the sham operation group, the protein expression of Beclin1 and NLRP3 was significantly increased in the model and moxibustion pretreatment groups (P < 0.01), while the expression of p62 protein decreased (P < 0.01). Compared with the model group, the expression of Beclin1 protein was significantly increased (P < 0.05), and the expression of p62 and NLRP3 proteins was significantly decreased in the moxibustion pretreatment group (P < 0.01). To conclude, moxibustion pretreatment can significantly improve the neurological function of rats after cerebral ischemia-reperfusion, and its mechanism may be related to the activation of autophagy and inhibition of the expression of inflammatory factors.

Key words: moxibustion pretreatment, ischemia-reperfusion, autophagy, Beclin1, p62, NLRP3 inflammasome

中图分类号:

蒋洁, 赵百孝, 陈立彬, 文丽, 张珊珊, 马杰, 赵华. 灸法预处理脑缺血再灌注模型大鼠自噬及NLRP3炎症小体的表达[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(23): 3615-3619.

Jiang Jie, Zhao Baixiao, Chen Libin, Wen Li, Zhang Shanshan, Ma Jie, Zhao Hua. Effect of moxibustion pretreatment on autophagy and NLRP3 inflammasome expression in cerebral ischemia-reperfusion model rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(23): 3615-3619.

图/表（结果） 3

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)与LSD-t检验。
1.2 时间及地点实验于2019年7月至2021年1月在新疆医科大学完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物及分组 8周龄健康雄性SD大鼠36只，SPF级，体质量(250±5) g，由新疆医科大学实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK(新)2011-0004。分笼饲养，饲养环境模拟自然昼夜条件，明暗周期12 h，温度(21±2)℃，湿度40%-50%，自由饮水，适应性饲养7 d。7 d后，采用随机数字表法分为假手术组、模型组、灸法预处理组，每组12只。动物的使用符合科技部《关于善待实验动物的指导性意见》相关规定。动物实验获得新疆医科大学伦理委员会批准。
1.3.2 主要仪器和试剂大脑中动脉阻塞线栓(北京默沙东生物技术有限公司)；BX43显微镜(日本OLYMPUS公司)；戊巴比妥钠(阿拉丁试剂有限公司)；Beclin1、p62、NLRP3及GAPDH抗体(Abcam公司)。
1.4 实验方法

1.4.1 造模方法造模方法参照LONGA等[7]改良后的大脑中动脉线栓法，具体方法如下：取模型组、灸法预处理组大鼠，腹腔注射戊巴比妥钠进行麻醉，从大鼠右侧颈部剪开切口，仔细分离并暴露右侧颈总动脉、颈内动脉及颈外动脉。结扎颈总动脉近心端和颈外动脉，然后用微动脉夹夹闭远端颈内动脉。在颈总动脉上近分叉3.0-4.0 mm处剪一“V”型切口，将备好的线栓经颈总动脉插入颈内动脉，当感觉到有少许阻力感时，表明已阻断大脑中动脉入口处，插入18-20 mm，之后结扎颈内动脉，常规行手术缝合，预留部分线栓在皮肤外。在缺血2 h后，拔除线栓到颈总动脉主干分叉处，使血流再灌注24 h。假手术组仅给予颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉剥离，而并不插入线栓。3组在缺血再灌注12 h后麻醉处死，进行同步取材。

待大鼠自然苏醒后，采用LONGA等[7]的5分制评分法对所有大鼠进行神经功能缺损评定，以评估造模成功与否，具体标准见表1。评分处于1-3分之间视为造模成功，纳入实验。其余评分的造模大鼠均剔除，若在手术过程中大鼠死亡，则重新选取大鼠进行造模并补充到相应组中。

1.4.2 干预方法灸法预处理组在正式造模前7 d开始给予艾灸预处理，假手术组和模型组不进行灸法治疗，操作者以艾灸状将大鼠轻固定于操作台上。灸法治疗方法如下：选取大鼠百会、大椎、足三里，穴位定位标准参照《实验针灸学》[8]常用实验动物穴位图谱。以麦粒型艾炷(南阳汉医艾绒有限责任公司，质量约10 mg/壮)在大鼠百会、大椎、足三里穴行麦粒灸3壮，每天每穴治疗1次，共治疗7 d。末次艾灸30 min后造模。
1.5 主要观察指标对3组大鼠进行神经功能缺损评分。
TTC染色测定大鼠脑死体积：每组均随机选取6只大鼠麻醉后处死取脑，-20 ℃冰箱冷藏后置于脑槽内沿冠状面进行切片，切片厚度为2-2.5 mm；将切好的薄片放置在2%TTC溶液中，用锡箔纸包好后放入37 ℃温箱处理20 min，中间不断上下翻动切片，以保证脑组织可以均匀沾染染色液；用40 g/L多聚甲醛固定2 h后进行拍照，采用 Image J软件测量大鼠脑梗死体积。梗死脑体积百分比=梗死区体积/整个大脑体积×100%。
Western-blot检测自噬相关蛋白表达：每组均随机选取6只大鼠麻醉后处死取脑，随机取等量缺血区脑组织(100 mg)放入1.5 mL EP管中，加入1 mL预冷的组织蛋白裂解液，用匀浆机研磨均匀，放置于冰上裂解20 min，然后，于4 ℃、14 000×g离心10 min，取上清液，采用BCA蛋白定量试剂盒测定总蛋白浓度。取裂解蛋白50 μg，80 V电泳至浓缩胶与分离胶分界线处，然后换为100 V电泳70 min，以肉眼观察溴酚蓝的条带距胶底1 cm左右停止电泳，换100 V电转70 min，5%的脱脂奶粉封闭2 h，一抗(Beclin1抗体、p62抗体、NLRP3抗体、GAPDH抗体，1∶1 000)4 ℃孵育过夜，辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶1 000)孵育1 h，洗膜后加入显影试剂，化学发光、显影。Alpha Innotech® Fluor Chem FC2凝胶成像系统采集图像，用Image J软件对条带计算蛋白表达的灰度值。以目的蛋白/GAPDH表示蛋白相对表达。
1.6 统计学分析应用SPSS 21.0统计软件进行统计学处理，各组数据以x±s表示。结果采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，服从正态分布且方差齐的数据组间比较采用LSD-t检验法，方差不齐时采用Welch检验。以P < 0.05为差异有显著性意义，P < 0.01为差异有非常显著性意义。

讨论

脑卒中目前已经逐渐成为中国乃治全世界导致人类死亡和致残的首要病因，其中缺血性脑卒中所占比重较大，有研究显示缺血性脑卒中在中国脑卒中发病人群中所占比例占到了77.8%[9]，其发病风险约是出血性脑卒中的2倍[10]。溶栓治疗目前仍是符合溶栓窗患者的首选治疗方案，溶栓后血管再通对缺血脑组织造成的缺血再灌注二次损伤可能会加重局部的功能损伤，如何避免或者减轻缺血再灌注损伤是防治缺血性脑卒中神经功能障碍的重要切入点。
灸法作为中医药疗法中的重要一员，自古至今已被临床医生证明了其在预防脑卒中发作中的重要价值。杨继洲早在《针灸大成》中便提及：“凡觉手足麻痹，或疼痛良久，此风邪入腑之候，宜灸此七穴(百会、耳上发际、肩髃、曲池、风市、足三里、悬钟)。病在左灸右，病在右灸左，候风气减轻为度。” 赵宇辉等[11]临床研究也发现，艾灸预处理对患者血压、血脂、血液流变学均有明显的调节作用，可作为有效预防手段来预防脑卒中发生，有效降低脑卒中复发率。此次实验选择百会、大椎、足三里3个穴位作为干预穴位，百会穴、大椎穴属督脉穴位，督脉循行“上至风府，入属于脑，上巅，循额，至鼻柱，属阳脉之海”，且百会穴为手足三阳经的交会穴，具有振奋阳气、醒脑开窍的作用。《灵枢·口问》：“故上气不足，脑为之不满，耳为之苦聋，头为之苦倾，目为之眩。”足三里为足阳明经之穴位，具有明确的补气功效，气足则脑清。
此次实验结果发现，灸法预处理可显著降低大鼠的神经功能缺损评分，减少缺血再灌注后的脑组织梗死体积，增加Beclin1蛋白表达，降低p62、NLRP3蛋白表达，说明灸法预处理可显著改善缺血再灌注后大鼠的神经功能，其机制可能与激活自噬抑制炎症因子表达有关，该结论与前人部分研究结果类似[12-13]。神经功能缺损评分评估能直观地反映大鼠缺血再灌注的损伤程度，此次实验发现灸法预处理可明显减轻大鼠的神经功能损伤。模型组TTC染色表明大鼠脑缺血再灌注损伤模型成功，灸法预处理后可显著降低脑组织梗死体积。自噬是维持细胞生理功能平衡的重要调节机制，在急性缺血、损伤等应激状态下，自噬功能的正常维持可对机体起到良性的双向调节作用。有研究发现，自噬在维持大脑神经元稳态方面不可或缺，自噬在各种应激状态下可首先被激活[14-18]。然而，自噬需要保持在适度状态，适度有效的自噬方能保护神经细胞免受损伤，适度的自噬主要是指自噬体的形成与自噬通量(指自噬溶酶体的形成与降解过程)相等，既不会因自噬不足而无法完成清除代谢受损、老化的细胞器，也不会因过度自噬而形成自噬体的堆积，加重损伤[19]。炎症反应是缺血性脑卒中后局部脑组织的明显病理改变，有研究发现，抑制血清中炎症因子的表达可减轻动脉粥样硬化导致的脑卒中症状[20-24]，说明缺血性脑卒中与炎症反应密切相关。目前，关于自噬在脑缺血后再灌注中的机制存在不同的观点，部分观点认为缺血再灌注后脑组织中自噬蛋白表达出现明显升高，因此抑制自噬的表达有利于脑细胞的存活；亦有观点认为自噬在神经元死亡过程中发挥有利或不利作用取决于损伤阶段和自噬程度，自噬的激活在脑缺血后再灌注阶段发挥保护性作用，然而在氧糖剥夺的原代培养神经元模型及大脑中动脉阻塞大鼠模型中，应用这两种自噬抑制剂表现出相反的结果，说明自噬的激活在脑缺血期发挥损伤性作用[25]。此次实验结果支持上述结论。
Beclin-1是酵母自噬相关基因Atg6的哺乳动物同源基因，在自噬体形成过程中起到关键的调控作用[26-30]。有研究发现脑组织缺血后Beclin-1的表达可显著升高，Beclin-1的升高可有效促进自噬体的形成，同时通过增加自噬关键蛋白在Beclin-1-Vps34复合物上的积累来启动自噬[31]。p62是由SQSTM1基因编码的衔接子，其在自噬过程中被降解，表达水平与自噬激活程度呈反比。NLRP3是一种炎症因子，在缺血再灌注损伤中发挥有明显作用，NLRP3激活导致白细胞介素1β、白细胞介素18、Caspase-1等炎症因子的级联释放，加重神经细胞损伤[32-36]。炎症和自噬在缺血性脑卒中发病过程中相互作用，交叉调节。有研究在缺血性脑卒中模型中通过诱导自噬激活发现，肿瘤坏死因子α、白细胞介素1、白细胞介素16等炎症因子的表达可显著降低，抑制自噬表达后炎症因子水平表达增加，炎症反应加重[37]。此外，有部分研究发现，自噬与炎症除拮抗作用外还可表现出一定的协同作用，如在脑出血损伤实验中，白细胞介素17A促进了小胶质细胞的自噬和炎症；而在用自噬基因(ATG5和ATG7)的RNA干扰抑制自噬时可以减少小胶质细胞的自噬和炎症，两者在此实验中显现出协同作用[38]。
综上所述，此次实验认为灸法预处理可显著改善缺血再灌注后大鼠的神经功能，其机制可能与激活自噬抑制炎症因子表达有关。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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灸法预处理脑缺血再灌注模型大鼠自噬及NLRP3炎症小体的表达

Effect of moxibustion pretreatment on autophagy and NLRP3 inflammasome expression in cerebral ischemia-reperfusion model rats

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