含3-硝基-N-甲基水杨酰胺的新型保护液对冷缺血保存离体大鼠心脏的保护

doi:10.12307/2022.223

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (8): 1194-1201.doi: 10.12307/2022.223

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含3-硝基-N-甲基水杨酰胺的新型保护液对冷缺血保存离体大鼠心脏的保护

王硕，刘文英，吕超凡，李佳聪，耿燚，赵云罡

天津体育学院运动与健康研究院，天津市运动生理学与运动医学重点实验室，天津市 301617

收稿日期:2021-04-06 修回日期:2021-04-10 接受日期:2021-05-16 出版日期:2022-03-18 发布日期:2021-11-02
通讯作者: 赵云罡，博士，副教授，天津体育学院运动与健康研究院，天津市运动生理学与运动医学重点实验室，天津市 301617
作者简介:王硕，男，1993年生，河北省保定市人，汉族，2019年天津体育学院毕业，硕士，助理实验师，主要从事分子运动生理学、线粒体生物学相关研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(31971100)，项目负责人：赵云罡

Cardioprotective effect of 3-nitro-N-methyl salicylamide on the isolated rat heart under cold ischemia preservation

Wang Shuo, Liu Wenying, Lü Chaofan, Li Jiacong, Geng Yi, Zhao Yungang

Tianjin Key Laboratory of Exercise Physiology and Sports Medicine, Institute of Sports and Health, Tianjin University of Sport, Tianjin 301617, China

Received:2021-04-06 Revised:2021-04-10 Accepted:2021-05-16 Online:2022-03-18 Published:2021-11-02
Contact: Zhao Yungang, PhD, Associate professor, Tianjin Key Laboratory of Exercise Physiology and Sports Medicine, Institute of Sports and Health, Tianjin University of Sport, Tianjin 301617, China
About author:Wang Shuo, Master, Assistant experimentalist, Tianjin Key Laboratory of Exercise Physiology and Sports Medicine, Institute of Sports and Health, Tianjin University of Sport, Tianjin 301617, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 31971100 (to ZYG)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
冷缺血保存：在器官移植手术过程中，对供体器官进行低温缺血保存是一种维持器官活性的简单而又经济的有效手段，并且为复杂的移植手术的开展争取了时间。但是，目前心脏低温保存的有效时间仍然只有4-6 h，保存时间越长，术后缺血再灌注损伤越严重，对心脏功能恢复的影响也就越大，甚至会导致原发性移植失败。
3-硝基-N-甲基水杨酰胺：是线粒体电子传递链复合体Ⅲ的半抑制剂，具有与抗霉素A相似的芳香环结构，但与其他抑制剂的作用部位和性质均不同，其作用机制是抑制复合体Ⅲ的电子传递速率而且不影响复合体酶活性，抑制效果也是可逆非竞争性的。有研究表明其可以有效减轻大鼠局部脑缺血组织的蛋白质氧化损伤和脂质过氧化。
背景：缺血组织再灌注期间，活性氧过量产生造成的氧化应激损伤是缺血再灌注损伤发生的主要因素。线粒体电子传递链是细胞活性氧的主要来源，因此通过靶向降低线粒体复合体的电子传递速度，将有效减轻因活性氧爆发造成的心肌缺血再灌注损伤。3-硝基-N-甲基水杨酰胺是呼吸链复合体Ⅲ的半抑制剂，可以有效降低电子传递速度，具有心脏保存的潜在应用价值，但目前尚无明确的研究和临床应用。
目的：探讨以3-硝基-N-甲基水杨酰胺为主要成分的新型心脏保护液对8 h离体冷缺血保存大鼠心脏的保护效果。
方法：取雄性健康Wistar大鼠心脏，稳定灌注30 min后，用不同心脏保护液停跳并低温静置保存8 h，根据所用心脏保存液分为对照组(不保存)、3-NNMS新型保护液组、Celsior保护液组、3-NNMS+Celsior保护液组。各组心脏采用Powerlab生物信号采集系统检测心脏血流动力学指标；提取心肌线粒体检测线粒体力能学指标；采用ELISA法检测心肌损伤标志物心肌肌钙蛋白T、肌酸激酶同工酶MB、乳酸脱氢酶；组织切片法检测心脏形态学变化；采用荧光显微镜检测心肌组织活性氧水平。
结果与结论：①3-硝基-N-甲基水杨酰胺可显著促进心率恢复水平(P < 0.05)，并减少外周灌流液上清中心肌损伤相关蛋白心肌肌钙蛋白T、肌酸激酶同工酶MB表达水平(P < 0.05)；②3-硝基-N-甲基水杨酰胺可显著提高线粒体膜电位水平(P < 0.05)，有效维持线粒膜结构；③3-硝基-N-甲基水杨酰胺可显著提高超氧化物歧化酶活性(P < 0.05)，增强心肌抗氧化功能，降低氧化损伤；④提高3-硝基-N-甲基水杨酰胺使用浓度，对心肌细胞培养不会产生毒性作用，表明其不存在使用剂量安全性问题；⑤结果表明，3-硝基-N-甲基水杨酰胺可通过提高抗氧化酶活性、促进心肌活性氧清除、达到降低氧化应激及其诱导的心肌损伤的效果；同时3-硝基-N-甲基水杨酰胺可有效促进再灌注期大鼠心脏心率恢复水平，维持线粒体膜完整性。

https://orcid.org/0000-0002-7069-7216 (王硕) ；https://orcid.org/0000-0001-5309-1346 (赵云罡)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 3-硝基-N-甲基水杨酰胺, 心肌缺血再灌注损伤, 线粒体抑制剂, 心脏保护液, 离体心脏保存, 活性氧

Abstract: BACKGROUND: During reperfusion, increased reactive oxygen species will cause oxidative stress injury in ischemic organs, which is the critical factor for ischemia and reperfusion injury. Cellular reactive oxygen species are mainly originated from mitochondrial electron transport chain. Therefore, it is an effective strategy to reduce myocardial ischemia/reperfusion injury due to elevated reactive oxygen species by inhibiting electron transport at mitochondrial electron transport chain. 3-Nitro-N-methyl-salicylamide (3-NNMS) is a semi-inhibitor for electron transport chain complex III, which can slow down the electron transport rate. 3-NNMS has potential applications for cardiac preservation; nevertheless, no related definite research or clinical practice has been reported.
OBJECTIVE: To investigate the protective effect of a new cardioplegic solution with 3-NNMS as the main component on isolated rat heart preservation for 8 hours.
METHODS: Heart specimens were taken from healthy male Wistar rats, perfused stably for 30 minutes, and then preserved in different cardioplegic solutions at low temperature for 8 hours. According to different cardioplegic solutions used, rat heart specimens were divided into a control group (no preservation), a 3-NNMS cardioplegic solution group, a Celsior cardioplegic group, and a 3-NNMS+Celsior cardioplegic solution group. The hemodynamic changes of the heart were detected by Powerlab instruments. The mitochondrial function in the preserved myocardium was measured by Oxygraph-2k High-resolution respirometry and chemiluminescence apparatus. Myocardial injury was assessed by detecting the expression of cardiac troponin T, creatine kinase isoenzyme MB, and lactate dehydrogenase using ELISA. The morphological changes of the heart were histologically observed. And the myocardial reactive oxygen species level was tested by inverted fluorescence microscope.
RESULTS AND CONCLUSION: The 3-NNMS cardioplegic solution could improve the heart rate recovery compared with the Celsior (P < 0.05), and decrease the levels of cardiac troponin T, creatine kinase isoenzyme MB, and lactate dehydrogenase in perfusate supernatant (P < 0.05). 3-NNMS could remarkably elevate mitochondria membrane potential, and maintain mitochondrial membrane structure effectively (P < 0.05). 3-NNMS could significantly increase the activity of superoxide dismutase (P < 0.05), ameliorate myocardial antioxidant function, and alleviate oxidative damage. It was nontoxic for cell culture with 3-NNMS, which can be used regardless of the concentration. To conclude, 3-NNMS can reduce oxidative stress-induced myocardial injury via increasing superoxide dismutase activity and promoting myocardial active oxygen clearance. Besides, 3-NNMS can improve heart rate recovery and keep mitochondrial membrane integrity during the reperfusion period.

Key words: 3-nitro-N-methyl-salicylamide, myocardial ischemia/reperfusion injury, mitochondrial inhibitor, heart preservation solution, isolated heart preservation, reactive oxygen

中图分类号:

王硕, 刘文英, 吕超凡, 李佳聪, 耿燚, 赵云罡. 含3-硝基-N-甲基水杨酰胺的新型保护液对冷缺血保存离体大鼠心脏的保护[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1194-1201.

Wang Shuo, Liu Wenying, Lü Chaofan, Li Jiacong, Geng Yi, Zhao Yungang. Cardioprotective effect of 3-nitro-N-methyl salicylamide on the isolated rat heart under cold ischemia preservation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(8): 1194-1201.

图/表（结果） 8

2.1 实验动物数量分析实验采用36只大鼠进行心脏离体保存和再灌注，分为4组，实验过程中部分心脏复灌失败，筛选得到20只再灌成功且心脏血流动力学检测数据稳定的大鼠心脏，每组5只，排除16只失败心脏。
2.2 3-NNMS量效关系测定结果使用不同质量浓度梯度的3-NNMS抑制提纯心肌线粒体呼吸，当3-NNMS使用质量浓度达到20 mg/L时，对线粒体呼吸控制率的抑制效果达51.29%；之后增加3-NNMS质量浓度直至45 mg/L，线粒体呼吸控制率始终在原始水平的50%上下，未见进一步抑制效果，见图1。证实了3-NNMS对线粒体呼吸链的半抑制效果，并确定动物实验使用质量浓度为25 mg/L。

2.3 心肌线粒体相关指标检测结果与对照组相比，3-NNMS新型保护液组、Celsior保护液组、3-NNMS+Celsior保护液组心肌线粒体呼吸控制率、线粒体活性氧生成速率和线粒体ATP含量均无显著变化；3-NNMS新型保护液组和Celsior保护液组、Celsior保护液组和3-NNMS+Celsior保护液组组间线粒体呼吸控制率、活性氧生成速率和ATP含量比较差异也无显著性意义；但与对照组相比，3-NNMS新型保护液组心肌线粒体膜电位水平显著升高(P < 0.05)；与Celsior保护液组、3-NNMS+Celsior保护液组相比，3-NNMS新型保护液组线粒体膜电位水平也显著升高(P < 0.05)，见图2。膜电位的稳定对于维持线粒体正常生理功能至关重要，膜电位升高，有利于促进能量产生和能量转换，抑制凋亡发生。

.4 各组大鼠心肌氧化和抗氧化水平结果 3-NNMS新型保护液组心肌线粒体超氧化物歧化酶活性显著高于对照组和3-NNMS+Celsior保护液组(P < 0.05)，且显著高于Celsior保护液组(P < 0.01)；但脂质过氧化产物丙二醛检测结果显示，与对照组相比，3-NNMS新型保护液组、Celsior保护液组、3-NNMS+Celsior保护液组未见显著性差异，3-NNMS新型保护液组、3-NNMS+Celsior保护液组与Celsior保护液组相比也未见显著性差异。而各组左室心肌冰冻切片活性氧荧光染色结果显示，与对照组相比，3-NNMS新型保护液组、Celsior保护液组、3-NNMS+Celsior保护液组活性氧荧光强度未见显著性差异；与Celsior保护液组相比，3-NNMS新型保护液组和3-NNMS+Celsior保护液组也未见显著性差异，见图3。以上提示，3-NNMS可提高抗氧化酶活性，促进活性氧的清除，从而减轻过量活性氧导致的脂质过氧化。

2.5 各组大鼠心脏灌流液上清和左室心肌中心肌损伤标志物结果各组心脏灌流液上清中心肌损伤标志物结果显示，与对照组相比，3-NNMS新型保护液组、Celsior保护液组、3-NNMS+Celsior保护液组心脏灌流液上清中心肌肌钙蛋白T和乳酸脱氢酶浓度均未见显著性差异，3-NNMS新型保护液组与Celsior保护液组相比，Celsior保护液组与3-NNMS+Celsior保护液组相比，也未见显著性差异，见图4A，B；由于上清液中肌酸激酶同工酶MB浓度过低，未能检测到有效数值，故缺少该指标数据。各组左心室组织水平损伤标志物比较结果见图4C-E，3-NNMS新型保护液组和3-NNMS+Celsior保护液组心肌肌钙蛋白T浓度均显著高于对照组和Celsior保护液组(P < 0.05)；3-NNMS+Celsior保护液组心肌肌酸激酶同工酶MB水平显著高于3-NNMS新型保护液组和Celsior保护液组 (P < 0.01)。各组间乳酸脱氢酶浓度比较无显著性差异。在正常生理条件下，心肌肌钙蛋白T、肌酸激酶同工酶MB、乳酸脱氢酶主要存在于组织中，当发生心肌损伤或坏死时则释放入血，使血清中相关蛋白浓度上升，因而，此次研究结果显示灌流液上清中心肌损伤标志物水平明显减少，组织水平得到有效保持，提示3-NNMS可有效减轻心肌损伤。

2.6 各组大鼠心脏收缩功能及结构变化结果血流动力学检测结果显示，与对照组相比，3-NNMS新型保护液组大鼠心脏再灌注时心率显著降低(P < 0.05)，Celsior保护液组心脏心率也显著降低(P < 0.01)；与Celsior保护液组相比，3-NNMS新型保护液组和3-NNMS+Celsior保护液组大鼠心率均显著升高(P < 0.05)，而且3-NNMS+Celsior保护液组心率显著高于3-NNMS新型保护液组(P < 0.05)，见图5，表明3-NNMS可有效促进再灌注时冷缺血保存心脏心率的恢复。各组心脏左心室形成压、心功指数、+dp/dtmax和-dp/dtmax比较差异均无显著性意义，提示经过8 h冷缺血保存后，各组心脏收缩功能基本一致。显微镜下观察苏木精-伊红染色心肌石蜡切片，各冷缺血保存组心脏形态均未见明显结构性变化，见图6。

2.7 3-NNMS对H9C2细胞呼吸氧耗速率和细胞活力的影响在不同质量浓度3-NNMS处理下，H9C2细胞氧耗速率与3-NNMS质量浓度呈现负相关关系；当3-NNMS质量浓度达100 mg/L时，其对H9C2细胞氧耗速率抑制效率达到47.76%，接近半抑制效果；继续增加3-NNMS质量浓度，细胞呼吸氧耗速率被严重抑制(P < 0.01)，见图7。而通过MTT实验检测显示，当3-NNMS质量浓度达到500 mg/L时，才对细胞活力造成显著性影响(P < 0.01)，且与500 mmol/L的二甲基亚砜干预结果一致，见图8。因此，高质量浓度3-NNMS对细胞活性的影响是由二甲基亚砜造成而非3-NNMS造成，即3-NNMS在细胞培养和呼吸抑制效果上不存在剂量相关安全性问题。

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引言

缺血再灌注损伤是心脏移植手术中普遍存在的问题，缺血保存的供体组织在恢复血液供应后会引发一系列不良后果，比如不可逆的损伤、细胞坏死、肿胀等，以及由于再灌注血液不均而导致的血管内皮细胞和线粒体功能障碍等，造成组织结构和功能损伤而影响器官功能恢复[1]。缺血再灌注损伤的发生既有局部病理变化因素，也有系统病变因素。在缺血期，主要因素是能量缺失，再灌注期则是氧化应激、微循环应激、炎症和凋亡等因素的综合作用结果[1]。缺血细胞如果不能及时得到血液供应便会坏死，而再灌注本身在恢复血液供应的同时，也会触发缺血再灌注损伤[2]。
心肌缺血再灌注损伤的主要因素是缺氧时氧化磷酸化水平下降和再灌注时活性氧过量产生造成的氧化应激损伤[3]。机体内主要的有害活性氧形式包括超氧阴离子(O2•-)、羟自由基(•OH-)和过氧化氢(H2O2)。在正常生理情况下，超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶等抗氧化酶系统可以抵御体内活性氧的细胞毒性作用，维持机体氧化还原平衡[4]。当机体内活性氧产生和抗氧化防御系统之间出现失衡时，氧化应激随之发生并造成一系列影响。过量产生的活性氧主要产生于内皮细胞黄嘌呤氧化酶激活、心肌细胞线粒体电子传递链反应及炎症细胞中NADPH氧化酶[5]。再灌注时首先发生的就是线粒体活性氧爆发造成的氧化损伤[2]。线粒体活性氧刺激不仅会造成急性损伤，还会在再灌注后期长时间影响组织病理变化[6]。这一氧化损伤首先影响线粒体正常功能，扰乱ATP生成，同时又与细胞内Ca2+增多导致的钙超载一起，诱发线粒体膜通透性转换孔开放，造成线粒体功能障碍，最终导致细胞凋亡和坏死[7]。线粒体活性氧还可以通过激活炎症小体触发固有免疫反应[8]。
作为供能细胞器，线粒体的任何损伤都会导致细胞发生由于能量代谢改变引起的病理变化[5]。传统方法一般是通过添加抗氧化剂或氧化清除剂的方式抑制和减少缺血再灌时活性氧的产生，减轻氧化损伤，并保护线粒体和细胞功能。研究表明，对心绞痛患者进行维生素C经皮冠脉介入治疗，其受损的心肌微循环再灌注得到有效恢复[9]。在动物或细胞实验中，使用乙醇脱氢酶2、米诺环素、褪黑素、超氧化物歧化酶、N-乙酰半胱氨酸等抗氧化剂也都取得了良好的减轻氧化应激的效果[10-14]。活性氧清除剂依达拉奉可以通过减轻氧化应激明显减少心梗面积及再灌后的心律失常[15]。
线粒体是活性氧的主要来源，线粒体活性氧主要源自复合体Ⅰ和复合体Ⅲ。缺血时，由于氧气的匮乏，电子传递链的各组分将处于高还原状态；再灌注期间，由于氧气充沛，电子传递速度猛增，高还原状态的电子传递体将在复合体Ⅰ和复合体Ⅲ处进行单电子传递，产生超氧自由基，因此，抑制再灌注期间的电子流速，降低单电子传递速度，可以从根本上降低活性氧的产生。但通过抑制线粒体电子传递速度的方法降低氧化应激损伤在离体组织保护领域尚未引起人们关注。徐建兴等[16]曾合成一种线粒体复合体Ⅲ半抑制剂，即3-硝基-N-甲基水杨酰胺(3-Nitro-N-Methyl salicylamide， 3-NNMS)，其可抑制复合体Ⅲ活性，降低电子传递速率，同时又不会造成呼吸链的完全终止。沈明等[17]曾证实，3-NNMS可以减轻大鼠局灶脑缺血再灌注引起的脂质过氧化和蛋白质氧化损伤。此次研究以3-NNMS为主要成分，自行研究配制了一种新型心脏保护液，并探究其在大鼠心脏冷缺血保存再灌注中对氧化应激引发的心肌损伤的保护效果。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计完全随机对照动物实验，多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，组间两两比较采用最小显著性差异法(LSD法)。
1.2 时间及地点于2020年3-10月在天津体育学院天津市运动生理学与运动医学重点实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 SPF级Wistar雄性大鼠36只，八九周龄，体质量310-350 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2016-0006。光照时间12 h，室温保持22-25 ℃，空气湿度40%-60%，每笼两三只，自由饮水进食饲养。
1.3.2 实验试剂及配方 3-NNMS由徐州医科大学谷小珂教授合成并赠送；H9C2心肌细胞系购自上海中桥新舟生物科技有限公司；二磷酸腺苷、DCFH-DA、肝素钠购自 Sigma-Aldrich；ATP检测试剂盒购自Promega；线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)、脂质过氧化(丙二醛)检测试剂盒、超氧化物歧化酶活性检测试剂盒(WST-8法)购自上海碧云天生物技术有限公司；GENMED冰冻切片活性氧荧光染色试剂盒购自上海杰美基因医药科技有限公司；大鼠肌酸激酶同工酶MB ELISA试剂盒、大鼠心肌肌钙蛋白TELISA试剂盒、大鼠L-乳酸脱氢酶ELISA试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司；MTT、苏木精、伊红染液购自北京索莱宝科技有限公司；Seahorse细胞培养板购自安捷伦科技有限公司。
新型心脏保护液配方(作者所在课题组自行研制)：3-NNMS 25 mg/L，K2HPO4•3H2O 42.4 mmol/L，NaHCO3 10.0 mmol/L，KCl 14.0 mmol/L，KH2PO4 15.0 mmol/L，MgSO4•7H2O 5.0 mmol/L，CaCl2 0.025 mmol/L，Glucose 139.0 mmol/L，pH 7.4。
Celsior保护液配方：Mannitol 60.0 mmol/L，Lactobionic Acid 80.0 mmol/L，Glutamic Acid 20 mmol/L，Histidine 30.0 mmol/L，CaCl2•H2O 0.25 mmol/L，KCl 15.0 mmol/L，MgCl2•6H2O 13.0 mmol/L，NaOH 100.0 mmol/L，Reduced Glutathione 3.0 mmol/L，pH 7.3(2-8 ℃)。
含3-NNMS的Celsior保护液按照新型保护液配方中3-NNMS的浓度，在成品Celsior保护液中补充加入了同等浓度的3-NNMS试剂。
心肌线粒体提取介质配方：Sucrose 0.25 mol/L，HEPES 3.0 mmol/L，EDTA-Na2 0.5 mmol/L，pH 7.4。心肌线粒体保存介质配方：KCl 130 mmol/L，HEPES 3.0 mmol/L，EDTA-Na2 0.5 mmol/L，KH2PO4 2.0 mmol/L，BSA 1 g/L，pH 7.4。心肌线粒体呼吸测定介质配方：KCl 130 mmol/L，HEPES 3.0 mmol/L，
EDTA-Na2 0.5 mmol/L，KH2PO4 2.0 mmol/L，BSA 1 g/L， pH 7.4。
1.4 实验方法
1.4.1 动物分组选取36只Wistar大鼠，按随机数字表法分成4组，即对照组(不保存)、3-NNMS新型保护液组、Celsior保护液组、3-NNMS+Celsior保护液组，每组9只。

1.4.2 心脏冷缺血离体保存-再灌注参照WÖLKART等[18]和KWAN等[19]的实验方案，并进行了细微调整。大鼠以20 mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，开胸暴露出心脏，按1 000 U/kg注射肝素抗凝。取出心脏，用预冷的Krebs-Henseleit(K-H)灌注液快速清洗，以动脉夹固定于改良Langendorff灌流装置上，K-H液(用体积分数95%O2-5%CO2混合气饱和)经主动脉顺行恒流灌注，灌注流速4.5-5 mL/min(相当于灌注压55-70 mmHg，1 mmHg=0.133 kPa)。灌注期间通过恒温水浴箱使灌注液温度保持在37 ℃，灌注15 min后，对于心脏离体保存组，用各种预冷的心脏保护液灌注停跳，然后浸泡在保护液中，密封后低温静置保存8 h。
对于对照组，切开左心耳，将连有压力传感器的球囊经二尖瓣插入左心室，插入后向球囊内充入生理盐水，调整球囊内生理盐水体积使左心室舒张末期压力维持在8-12 mmHg，采集心率、左心室形成压、左心室收缩期压力最大上升速率(time derivatives of pressure during contraction，+dp/dtmax)和左心室舒张期压力最大下降速率(time derivatives of pressure during relaxation，-dp/dtmax)等血流动力学指标，按照心功指数=左心室形成压×心率公式计算心功指数，用于评定心脏收缩功能。离体保存组心脏经低温保存8 h后，重新固定，复灌1 h，收集复灌开始后前5 min的灌流液，4 ℃，5 000×g离心10 min后取上清，用于生化指标检测。复灌15 min后，按前述操作连接压力传感器，监测血流动力学指标，复灌1 h后，停止灌注，提取心肌线粒体。
1.4.3 3-NNMS量效关系测定及线粒体呼吸功能测定取实验大鼠左室心肌，加入适量线粒体提取介质，冰浴条件下匀浆。组织匀浆于4 ℃，1 000×g离心10 min，取上清液；上清液于4 ℃，10 000×g离心10 min，取沉淀；用线粒体保存介质重悬沉淀，即得粗制线粒体。测定蛋白浓度后，加入 300 μg蛋白的线粒体悬液到Oxygraph-2K高分辨率细胞呼吸测量仪反应仓内，根据实验流程依次加入0.5 mmol/L苹果酸与1 mmol/L谷氨酸混合液和2.5-45 mg/L不同质量浓度的3-NNMS，测定线粒体态Ⅲ和态Ⅳ呼吸，计算不同质量浓度3-NNMS处理后线粒体呼吸控制率，确定使用浓度。
取实验鼠左室心肌100 mg，按前述方法提取心肌线粒体后加入反应仓内，呼吸速率曲线平稳后加入0.5 mmol/L苹果酸、1 mmol/L谷氨酸，再次平稳后加入5 mmol/L二磷酸腺苷，测定出线粒体态Ⅲ呼吸速率，待呼吸速率曲线平稳后得态Ⅳ呼吸速率，按照呼吸控制率=态Ⅲ呼吸速率÷态Ⅳ呼吸速率公式，计算呼吸控制率。在线粒体力能学研究中，根据线粒体氧化呼吸链工作状态，将二磷酸腺苷存在时的呼吸称为态Ⅲ呼吸，将二磷酸腺苷消耗完后的呼吸称为态Ⅳ呼吸，正常情况下，随着呼吸链电子传递和ATP合成的不断循环，态Ⅲ和态Ⅳ呼吸是不断交替进行的，根据二者的比值水平来评价线粒体呼吸功能。
1.4.4 线粒体功能相关指标检测按照说明书要求，采用发光检测仪测定心肌线粒体中ATP含量；采用荧光分光光度计检测JC-1聚合物、单体两种荧光强度，根据红绿荧光的变化之比代表线粒体去极化的比例，表示线粒体膜电位变化水平。
1.4.5 抗氧化酶活性和脂质过氧化产物检测按试剂盒说明书要求，采用酶标仪检测线粒体超氧化物岐化酶活性和心肌脂质过氧化产物丙二醛浓度。
1.4.6 心肌损伤标志物检测取实验组和对照组心脏灌注期间收集的灌流液，于4 ℃，3 000 r/min离心10 min后取上清；取各组心脏左室心肌组织100 mg，匀浆裂解后离心取上清液，按照试剂盒说明书要求，采用ELISA法分别测定灌流液上清和心肌组织匀浆上清中的肌酸激酶同工酶MB、乳酸脱氢酶、心肌肌钙蛋白T浓度，比较各组心肌的损伤水平。
1.4.7 心肌组织苏木精-伊红染色取左室心肌，40 g/L多聚甲醛溶液固定24 h以上，石蜡包埋后纵切组织，切片厚 4 μm，烤片2 h后脱蜡水化处理；苏木精染液浸染15 min后自来水冲洗，分化液分化10 s后自来水浸泡15 min；伊红染液浸染1 min，自来水冲洗后浸泡4 min，切片脱水、透明、中性树胶封固。用Tissue Gnostics的Tissue slide分析系统进行切片扫描，观察心肌组织形态变化。
1.4.8 心肌线粒体和组织水平活性氧检测制备粗提心肌线粒体后，在3 mL比色皿中加入2 mL线粒体呼吸测定介质、 5 μL DCFH探针(50 mmol/L)和20 μL线粒体悬液，读数2 min后，加入10 μL苹果酸/谷氨酸混合溶液为底物。继续读数2 min后停止，可获得线粒体活性氧生成曲线。计算加入底物前后的曲线斜率差值进行数据统计分析。对于组织，取左室心肌，OCT包埋剂包埋后，冰冻切片机切片，切片厚8 μm。按照说明书要求，依次滴加GENMED清理液，移除清理液，滴加染色工作液37 ℃湿润孵育20 min，移除工作液，清洗，抗荧光衰减封固剂封固。用Tissue Gnostics的HistoQuest组织定量分析系统进行切片扫描并进行活性氧荧光强度定量检测分析。
1.4.9 H9C2细胞呼吸氧耗速率测定采用Seahorse XF24 extracellular flux analyzer(Agilent，USA)进行细胞呼吸氧耗速率测定。设置检测程序，加入活化液到检测细胞板中，于37 ℃培养箱中过夜活化探针，并将细胞种于培养板中，细胞数7×104个/孔，常规CO2培养箱过夜培养；次日更换培养液为测定介质，37 ℃无CO2培养箱培养1 h；配制50，100，200，500 mg/L的3-NNMS，加入探针板，机器校准后放入细胞培养板，经16次重复检测细胞氧耗变化，分析细胞呼吸结果。
1.4.10 MTT细胞活力检测收集对数期H9C2细胞，分7组种于96孔板中，每组5个复孔，每孔接种细胞8 000个，贴壁培养6 h后，除对照组外其余6组按浓度梯度分别在各组培养基中加入50，100，200，500 mg/L 3-NNMS(二甲基亚砜稀释)和200，500 mmol/L二甲基亚砜，过夜培养，次日吸去上清，加入90 μL新鲜培养基和10 μL MTT继续培养4 h，吸去上清，每孔加入110 μL二甲基亚砜，振荡5 min后酶标仪490 nm处测量各孔吸光度值。
1.5 主要观察指标 ①3-NNMS对线粒体呼吸控制率的量效关系；②不同心脏保护液缺血保存大鼠离体心脏后再灌期心脏收缩功能相关指标心率、左心室形成压、心功指数、+dp/dtmax、-dp/dtmax；③灌流液和组织水平心肌损伤标志物心肌肌钙蛋白T、肌酸激酶同工酶MB、乳酸脱氢酶的水平；④心肌形态学变化及心肌组织活性氧水平；⑤心肌线粒体功能相关指标：呼吸控制率、ATP含量、膜电位、活性氧生成速率；⑥超氧化物歧化酶活性和脂质过氧化产物丙二醛浓度；⑦3-NNMS对H9C2心肌细胞呼吸的抑制效果及细胞活性。
1.6 统计学分析实验数据采用SPSS 22.0和Graphpad Prism 7进行统计分析，数据均采用x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，组间两两比较采用最小显著性差异法(LSD法)。P < 0.05为差异有显著性意义，P < 0.01为差异有非常显著性意义。

讨论

心脏移植手术中，离体心脏保存时间大多在6 h以下，大部分为2-4 h，心脏离体保存4 h以内的比例占到了90%以上[20]。器官离体保存时间的限制也严重制约了移植手术的发展，制约器官保存时间的原因主要是缺血再灌注损伤造成的器官功能障碍，而缺血再灌注损伤主要是由再灌注过程中组织氧气供应得到恢复而导致活性氧短时间过量产生引发的氧化损伤、细胞死亡及过度的免疫反应等问题导致的组织功能损伤。因此，如何有效抑制活性氧增多来减轻缺血再灌注损伤多年来始终是相关研究的热点。
线粒体活性氧的产生则主要源于线粒体复合体Ⅰ和复合体Ⅲ，复合体Ⅰ产生的超氧自由基主要释放到基质中，而复合体Ⅲ产生的超氧自由基则在基质和线粒体内膜间隙都存在[21]。因此，寻找更安全有效的线粒体靶向抑制剂，特别是针对复合体Ⅲ的抑制剂，可以通过抑制复合体酶活性或电子传递速度达到减少活性氧产生、进而减轻氧化损伤的目的。尽管已有研究通过应用靶向线粒体及其电子传递链复合体的抑制剂，取得良好的心肌保护效果，如异戊巴比妥、 SNO-MPG、MitoSNO、二甲双胍等复合体Ⅰ的抑制剂[22-25]，可通过抑制复合体Ⅰ位点的电子传递而减少过氧化物产生，来减轻氧化损伤；使用丙二酸盐[26]、氯尼达明[27]、MitoQ则可通过抑制复合体Ⅱ减少氧化应激[8]。但对复合体Ⅲ的相关研究一直较少，仅见VANDEN HOEK等[28]曾证实，一种名为“粘噻唑”的线粒体复合体Ⅲ的抑制剂可以在缺氧预处理时，通过作用于泛鲲氧化中心的Q0位点抑制活性氧的产生，但在较高浓度下会完全抑制复合体Ⅲ处电子传递，进而影响线粒体正常呼吸功能。
此次研究中所用的3-NNMS是一种新型人工合成试剂，它在结构上与抗霉素A分子的芳香环部分相似，可以抑制由CoQ到细胞色素C的电子传递，通过降低电子传递速率达到抑制复合体Ⅲ位点活性氧产生的效果。量效关系研究显示，在高剂量的情况下，它也仅能达到50%的抑制效果。如前所述，该抑制剂合成后仅在大鼠局灶脑缺血再灌注损伤中进行了实验研究，证明了其良好的减轻氧化损伤功能，但未见有其他研究进一步报道。因此，作者首次将其应用于8 h大鼠心脏冷缺血保存研究中。尽管活性氧指标检测显示，3-NNMS并未显著降低心肌线粒体水平和组织水平活性氧产生，但通过抗氧化酶超氧化物歧化酶检测结果可以看出，3-NNMS新型保护液组心肌线粒体超氧化物歧化酶活性显著升高。与此对应的是，各组心肌脂质过氧化产物丙二醛水平差异无显著性意义，表明3-NNMS可能通过提高抗氧化酶活性，有效促进线粒体中超氧自由基的清除，从而避免了氧化应激导致的脂质过氧化损伤和心肌损伤的发生，所以3-NNMS新型保护液组与Celsior保护液组、对照组相比，灌流液上清中心肌损伤相关蛋白浓度变化无统计学差异；同时，由于抗氧化酶系统的作用，再灌注期间由于底物和氧气供给恢复而造成的线粒体活性氧爆发得到了有效缓解，因此，3-NNMS新型保护液组和对照组、Celsior保护液组相比，线粒体和组织水平活性氧含量也未表现出统计学差异。
心肌是对缺血或灌注不足最为敏感的组织，心肌需要大量ATP以维持心脏正常收缩功能，在整个心肌细胞中，线粒体的总体积占细胞体积的30%-40%，因此心肌细胞对氧气的需求非常旺盛[29-30]，以维持细胞正常的能量和代谢水平。供体器官在低温环境下保存时，由于缺血缺氧，线粒体电子传递链活动受抑制导致ATP缺失，造成细胞膜紊乱和心肌水肿，再灌注时，大量Ca2+进入细胞，形成钙超载，导致线粒体膜通透性增加，最终造成细胞死亡和心肌收缩障碍，而ATP主要来源就是线粒体，所以维持线粒体结构完整和功能正常至关重要[31]。同时，缺血保存期由于氧气不足，细胞以无氧代谢为主，糖原通过酵解反应产生乳酸，长时间缺血缺氧则会导致细胞内乳酸堆积，pH值降低，进一步抑制ATP的产生[29，32]。在此次研究中，3-NNMS显著提高了线粒体膜电位水平，线粒体膜电位是由于线粒体内膜两侧的质子等离子分布不对称而产生，线粒体膜电位产生的质子跨膜电位是ATP合成的关键，膜电位越高，线粒体内膜电势能越高，预示着ATP合成能力越强[33]。但是，此次研究结果显示，冷缺血保存组之间心肌线粒体ATP浓度比较差异无显著性意义，但从检测结果可看出，冷缺血保存组心肌线粒体ATP水平相比对照组均降低，考虑此次研究所用灌注液为Krebs-Henseleit缓冲液，其中并无充足的线粒体呼吸底物，所以再灌注期间尽管心肌氧气供应充足，但氧化磷酸化产能并不明显，造成线粒体ATP浓度差异不显著。
经过低温保存的心脏在再灌注期收缩功能恢复一般较差，因此，很多研究致力于通过不断完善保护液组成来促进心脏收缩功能恢复，比如在Celsior保护液中添加钙增敏剂左西孟旦[34]。3-NNMS虽然曾被证实可减轻大鼠脑缺血再灌注时的氧化损伤，但未见在心肌缺血再灌注和心脏离体保存中的相关研究。此次研究结果显示，相比临床使用的Celsior保护液，以3-NNMS为基础新配制的新型心脏保护液可以明显促进8 h冷缺血保存后心脏心率的恢复，虽未表现出明显的促进心脏收缩功能的效果，但其应用显著促进了低温保存 8 h的大鼠心脏的心率恢复水平，也证实了其在促进心脏功能恢复中的有效性。
再灌注初期活性氧的爆发是引发细胞早期急性损伤的重要因素[18]，而且在再灌注恢复后长时间内可能引发一系列病理变化[6]。由此次研究结果可知，3-NNMS可通过提升抗氧化酶活性，减轻氧化应激及氧化应激诱导的心肌损伤，考虑到该结果并不十分直观和明确，作者计划后期在细胞水平进行进一步详细研究。在这里作者仅探究了不同质量浓度3-NNMS处理对细胞呼吸氧耗的影响，发现随着3-NNMS质量浓度的增加，细胞呼吸抑制效果逐渐加强，当3-NNMS质量浓度达到100 mg/L时，才表现出对细胞呼吸的半抑制效果，考虑到心脏组织相对于细胞环境更为复杂，药物吸收效果较差，作者认为，如果提高动物实验中使用3-NNMS的质量浓度，对于活性氧和心肌损伤相关蛋白变化的影响可能会更显著。
结论：综上所述，此次研究首次证实了3-NNMS在大鼠心脏冷缺血保存条件下的心肌保护作用。3-NNMS可提高心肌抗氧化酶活性，促进再灌注期间活性氧的清除，达到减轻氧化应激及其诱导的心肌损伤的效果；同时3-NNMS可良好维持线粒体膜完整性，提高再灌注时大鼠心率的恢复水平。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

含3-硝基-N-甲基水杨酰胺的新型保护液对冷缺血保存离体大鼠心脏的保护

Cardioprotective effect of 3-nitro-N-methyl salicylamide on the isolated rat heart under cold ischemia preservation

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