2.1   HPe6DF纳米粒子的理化性能   采用透析法制备纳米粒子内核Pe6D，Pe6D加载全氟化碳并包裹透明质酸后得到HPe6DF纳米粒子，并使用动态光散射仪和透射电镜等对其粒径、电位和形貌等进行表征。  
图1A、B是不同纳米粒子的粒径、电位测试结果，Pe6DF纳米粒子的粒径约为90 nm，电位约为+45 mV；HPe6DF纳米粒子的粒径增大到150 nm，电位降低到-20 mV。图1C、D的透射电镜图像展示了包裹透明质酸前后纳米粒子的形貌，包裹透明质酸前的Pe6DF纳米粒子呈大小均一的球形，包裹透明质酸后的HPe6DF纳米粒子粒径增大并具有核壳结构。



图2A、B为HPe6DF纳米粒子与透明质酸酶(100-250 U/mL)共同孵育不同时间的粒径和电位变化图，从图中可以看出，随着时间的增加，HPe6DF纳米粒子的粒径和电位均逐渐增加，表明其具有一定的透明质酸酶响应性。图2C是HPe6DF纳米粒子孵育在体积分数10%血清和5%葡萄糖溶液中粒径随时间的变化曲线，从图中可以看出，随着培养时间的延长，HPe6DF纳米粒子在体积分数10%血清和5%葡萄糖溶液中孵育时粒径几乎未发生变化，电位测试结果也保持正常波动。图2D是不同样品中的溶解氧含量随时间变化，从图中可以看出，在加载氧气前各组氧气浓度基本相同，在加载氧气后各组氧气浓度均明显上升，且HPe6DF组氧气浓度最高。由紫外和高效液相色谱分别检测了二氢卟吩e6和NLG8189的载药量，二者的载药量分别为11.84%和5.41%。



图3是HPe6D和HPe6DF纳米粒子在溶液中产生活性氧能力评估实验的结果，由图中可以看出，在光照相同时间的条件下，与HPe6D组相比，HPe6DF组荧光强度增加更为明显，表明其活性氧产量更高。



2.2   肿瘤细胞对HPe6DF纳米粒子的摄取   图4，5分别是细胞对HPe6DF纳米粒子摄取的激光共聚焦图像和流式检测结果，可以看出随孵育时间的增长，细胞中代表二氢卟吩e6的红色荧光逐渐增强；并且在纳米粒子浓度和孵育时间相同的条件下，透明质酸预孵育组红色荧光较弱；流式定量结果中荧光强度变化与激光共聚焦结果一致。







2.3   肿瘤细胞胞内活性氧产生    图6A、B分别为不同处理条件下细胞内的活性氧产生情况的激光共聚焦显微镜图片和流式结果图，与对照组相比，光照后的HPe6D组和HPe6DF组均出现了明显绿色荧光，且HPe6DF组荧光最强。流式定量结果与激光共聚焦显微镜图像结果一致。



2.4   HPe6DF纳米粒子的细胞毒性和对细胞凋亡的影响   图7A、B显示了不同纳米粒子处理下在有无光照时的细胞存活率，在不光照条件下，各组均无明显毒性；光照后，细胞毒性以剂量依赖的方式增加，其中HPe6DF处理组细胞存活率最低，表明其最低毒性最大，且透明质酸预孵育处理组细胞存活率明显更高。图7C展示了细胞经过不同处理后的凋亡情况，无光照的条件下，HPe6D组凋亡比例与生理盐水组几乎相同；光照后，HPe6D组和HPe6DF组的晚期凋亡比例分别达到22.2%和37.8%。



2.5    HPe6DF纳米粒子诱导免疫原性细胞死亡的检测   图8、9分别是钙网蛋白和高迁移率蛋白1染色的激光共聚焦显微镜图像及胞外三磷酸腺苷含量测试的结果，与对照组相比，在光照后，HPe6D组和HPe6DF组均出现了分别代表钙网蛋白和高迁移率蛋白1的绿色荧光，并且胞外三磷酸腺苷浓度上升，其中HPe6DF组变化最为明显。







2.6   HPe6DF纳米粒子对吲哚胺-2，3-双加氧酶的抑制   如图10所示，与对照组相比，经过γ-干扰素处理后细胞上清液中的色氨酸含量明显降低，说明γ-干扰素可诱导吲哚胺-2，3-双加氧酶高表达，从而促进色氨酸代谢为犬尿氨酸；而加入γ-干扰素的同时，加入NLG8189和HPe6DF纳米粒子共孵育后，细胞上清液中的色氨酸含量明显上升，说明NLG8189和HPe6DF纳米粒子有利于抑制吲哚胺-2，3-双加氧酶的活性。NLG8189组的色氨酸浓度略高于HPe6DF组的原因可能是，HPe6DF纳米粒子中的NLG8189二聚体需要裂解后才能发挥作用。

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光动力治疗因其非侵入性、局部靶向、与其他治疗方法兼容性强等优点成为了目前肿瘤治疗研究的热点[1-3]。通常在特定的激光照射下，光动力疗法中的光敏剂可以吸收激光的能量，发生一系列化学反应后产生细胞毒性活性氧，导致肿瘤细胞凋亡和坏死，进而抑制肿瘤的生长[4-5]。然而，由于光动力疗法对氧气的依赖性，肿瘤缺氧的微环境使得光动力疗效严重受限，在实体瘤中这一现象更为明显[6-8]。同时，光动力疗法也通过产生活性氧消耗氧气，从而加剧肿瘤缺氧，导致光动力疗法无法充分发挥治疗效果。
迄今为止，研究人员已经开发出了多种缓解肿瘤缺氧的策略，例如在临床试验中已使用高压氧吸入来改善氧气水平，然而气压伤和高氧损伤等不良反应妨碍了其在临床上进一步的应用。此外，也有研究者利用过氧化氢酶和二氧化锰等催化肿瘤内过氧化氢分解原位产生氧气，但这种方法受到肿瘤细胞内过氧化氢浓度的限制[9-10]。全氟化碳因其化学和生物惰性、可靠的生物安全性及对氧气的高溶解度被选为运输氧气的载体，为改善肿瘤缺氧微环境提供了一种新策略[11-13]。
光动力疗法除了可以通过诱导凋亡或坏死杀死肿瘤细胞外，还会引起急性炎症激活抗肿瘤免疫反应[14-15]。已有研究证实，光动力疗法在治疗中会引起肿瘤免疫原性细胞死亡，并释放出相关抗原，促进树突状细胞成熟与抗原递呈，进而导致效应T细胞的增殖和激活。然而，在肿瘤微环境中的免疫逃避机制会通过调节相关因子的表达，如上调吲哚胺-2，3-双加氧酶的表达，进而严重损害光动力诱导的免疫反应[16-18]。目前，已有多种免疫检查点抑制剂，如程序性死亡受体1抑制剂等已被用于增强光动力疗法介导的免疫反应，以实现高效的联合抗肿瘤效果[19-21]。
此外，吲哚胺-2，3-双加氧酶作为一种免疫检查点在多种类型的实体瘤中高表达，且它可被一些小分子药物针对性抑制。吲哚胺-2，3-双加氧酶可催化色氨酸代谢为犬尿氨酸，从而抑制效应T细胞的分化和增殖功能，帮助形成免疫抑制微环境[22-24]。抑制吲哚胺-2，3-双加氧酶的活性有利于缓解肿瘤部位免疫抑制微环境。
综上，缓解肿瘤细胞内缺氧可提高光动力疗效，同时结合吲哚胺-2，3-双加氧酶抑制剂抑制肿瘤免疫抑制微环境，可增强光动力诱发的免疫应答能力，从而进一步增强肿瘤治疗效果。基于此，实验设计了以光敏剂二氢卟吩e6修饰的两亲性功能化聚赖氨酸为载体材料，负载NLG8189的二聚体药物和全氟己烷作为内核，静电复合透明质酸为外壳的HPe6DF纳米粒子，从而增强光动力疗法诱导的免疫治疗疗效[21，25-26]。  中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

1.1   设计   材料制备和表征以及细胞学实验，两组间比较进行T-test分析，多组间比较进行单因素完全随机方差分析。
1.2   时间及地点   于2019年10月至2021年4月在四川大学国家生物医学材料工程技术研究中心实验室完成。
1.3   材料
1.3.1   主要细胞与试剂  鼠源乳腺癌细胞4T1购自中科院上海细胞研究所；二氢卟吩-e6、胱胺二盐酸盐、N-苄氧羰基-L-赖氨酸、二环己基碳二亚胺、羟基丁二酰亚胺(天津希恩斯生化科技有限公司)；透明质酸(Mw=40 000，华熙生物科技有限公司)；小分子吲哚胺-2，3-双加氧酶抑制剂NLG8189(美国Selleck公司)；全氟己烷(九鼎化学科技有限公司)；氢溴酸(Adamas-beta)； 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT，上海安吉耐化学)、绿色单线态氧探针(大连美伦生物技术有限公司)；活性氧检测试剂盒、三磷酸腺苷检测试剂盒和Annexin V/PI细胞凋亡检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；RMPI 1640培养基、胎牛血清(美国Hyclone公司)；胰蛋白消化酶(0.25%)和青霉素-链霉素(美国Gibco公司)；γ-干扰素(近岸蛋白质科技有限公司)；Alexa Fluor 488-钙网蛋白、Alexa Fluor 488-高迁移率蛋白1抗体(北京博奥森生物技术有限公司)；乙醚、二氯甲烷、四氢呋喃、正己烷、二甲亚砜等(成都科龙化工试剂)。
1.3.2   主要设备与仪器   1H核磁共振波谱仪(美国 Bruker，AV-400)；质谱仪(日本岛津，LCMS-IT-TOF)；动态光散射仪(英国Malvern，Zetasizer Nano ZS)；紫外分光光度计(美国Perkin Elmer，L650)；透射电子显微镜(日本JEOL，JEM-2100)；便携式溶氧仪(上海仪电)；酶标仪(美国Biorad，Model-550)；高效液相色谱(HPLC，美国Aligent)；激光共聚焦显微镜(德国Leica，TCP SP5)；流式细胞仪FCM (美国BD，Accuri C6)。
1.4   实验方法   
1.4.1   两亲性功能化聚赖氨酸的合成   首先，将N-苄氧羰基-L-赖氨酸和三光气按摩尔比1∶1.3加入到重蒸后四氢呋喃溶剂中，50 ℃油浴下反应至溶液变澄清。将上述溶液旋浓后，使用大量无水正己烷反复沉淀清洗后得到赖氨酸内羧酸酐。然后，将脱盐酸后的胱胺和赖氨酸内羧酸酐按1∶20的摩尔比投入无水二氯甲烷中，反应48 h后将溶液浓缩，加入大量乙醚沉淀。将过滤后得到的沉淀溶于三氟乙酸，并加入溴化氢的醋酸溶液反应3 h，用乙醚沉淀后，将沉淀溶于水中透析4 d后冻干得到聚赖氨酸。接着，将二氢卟吩e6、二环己基碳二亚胺和羟基丁二酰亚胺按摩尔比1∶1.21∶10投入10 mL二甲亚砜中活化2 h后，按聚赖氨酸和二氢卟吩e6摩尔比为1∶1.1的比例加入聚赖氨酸，反应48 h后，用二甲亚砜透析除去未反应的二氢卟吩e6，再用水透析后冻干得到两亲性功能化聚赖氨酸。
合成材料采用1H核磁共振波谱仪进行了结构表征，结果显示：聚赖氨酸主链上的质子(δ=4.33 ppm)；胱胺上的两种亚甲基上的质子(δ=2.78，3.87 ppm)；聚赖氨酸侧链上的4个亚甲基上的质子(δ=2.78，1.60，1.36，1.25 ppm)以及δ=7.4-8.5 ppm处代表二氢卟吩e6的质子峰均在核磁氢谱中出现，证明成功合成了两亲性功能化聚赖氨酸。
1.4.2   NLG8189小分子二聚体的合成   用上述合成赖氨酸内羧酸酐的方法合成NLG8189内羧酸酐后，将胱胺和NLG8189内羧酸酐按摩尔比1∶2加入到无水二氯甲烷中反应48 h，用乙醚沉淀并过滤后得到最终产物NLG8189小分子二聚体。用核磁和质谱分别进行了表征，核磁氢谱结果显示：苯环上4个氢(δ=7.00，7.12，7.35，7.55 ppm)、与氮相连的甲基
(δ=3.72 ppm)、NLG8189亚甲基上2个氢δ=3.05，3.60 ppm)、与氨基相连的碳上的质子(δ=4.18 ppm)及胱胺上两种亚甲基质子(δ=3.65，2.67 ppm)均出现在核磁氢谱中，证明成功合成了NLG8189小分子二聚体。高分辨率质谱中NLG8189小分子二聚体显示的分子量为552.76 g/mol，与理论分子量相同，表明NLG8189小分子二聚体的结构与预期相同。
1.4.3   纳米粒子的制备   将500 μL含有5 mg 两亲性功能化聚赖氨酸和1 mg的NLG8189小分子二聚体的二甲亚砜溶液缓慢滴加到9 mL水中，搅拌过夜，透析除去二甲亚砜后得到Pe6D纳米粒子。在超声下将5 μL全氟己烷滴加到1 mL Pe6D纳米粒子中，5 000 r/min离心后得到Pe6DF纳米粒子。然后将Pe6DF纳米粒子和10 g/L的透明质酸按体积比5∶1混合，涡旋1 min 后得到HPe6DF纳米粒子。将透析的Pe6D纳米粒子和10 g/L的透明质酸按体积比5∶1混合，涡旋1 min 后得到HPe6D纳米粒子。
1.4.4   纳米粒子的理化性能表征
粒径和电位：Pe6D、Pe6DF、HPe6DF纳米粒子的粒径和电位通过动态光散射来表征。通过检测HPe6DF纳米粒子在透明质酸酶孵育下的粒径和电位随时间变化，评估其酶响应特性；通过检测HPe6DF纳米粒子在体积分数10%血清溶液和5%葡萄糖溶液中的粒径和电位随时间变化，评估其稳定性。
载药量：用紫外分光光度计测定二氢卟吩e6含量，配制不同浓度的二氢卟吩e6溶液做标准曲线，测量其在
660 nm处的吸光度值，并绘制浓度-吸光度值曲线，计算样品中的二氢卟吩e6含量。使用高效液相色谱测定NLG8189的载药量，配制不同浓度的NLG8189溶液做标准曲线，高效液相色谱测定，以峰面积对浓度进行线性回归，做标准曲线并计算样品中NLG8189含量。其中色谱柱为C18柱(Eclipse XDB-C 184.6 mm×150 mm，5 μm，Aligent)，流动相为乙腈∶水=10∶90(均含0.1%三氟乙酸)，流速为0.5 mL/min。载药量=A/(A+B)×100%，其中A为纳米粒子中药物质量，B为纳米粒子中载体材料质量。
形貌表征：使用透射电子显微镜观察Pe6DF、HPe6DF纳米颗粒的形貌。
氧气负载能力：将2 mL的HPe6D、HPe6DF纳米粒子分别装在10 mL离心管中，用氧气瓶向溶液中鼓氧，每秒一个气泡的频率鼓氧1 min后，使用便携式溶氧仪检测其在15 min内的溶解氧含量。
活性氧产生能力：使用激光(660 nm，0.5 W/cm2)照射含有50 μmol/L 绿色单线态氧探针的HPe6D、HPe6DF纳米粒子溶液，然后测量其在504 nm激发下514-580 nm的发射曲线。
1.4.5   细胞实验
细胞培养：将鼠源乳腺癌细胞4T1以5×105/皿的浓度接种于直径10 cm的培养皿，并添加含有体积分数10%血清和1%双抗(青霉素和链霉素)的RPMI 1640培养基，在体积分数5%二氧化碳环境下于37 ℃细胞培养箱中进行培养，当细胞生长至70%-80%时进行传代，每2 d传代一次。
细胞摄取：将4T1细胞以5×104/皿的密度接种在玻底皿中，待细胞贴壁后，加入含HPe6DF纳米粒子(二氢卟吩e6的质量浓度为4 mg/L)和透明质酸+HPe6DF纳米粒子(提前加入质量浓度10 g/L的透明质酸预孵育2 h)的培养基分别继续培养细胞1，2，4 h。孵育结束后，用Hoechst 33342
(10 mg /L)染色15 min，通过激光共聚焦显微镜观察纳米粒子入胞情况。对于细胞摄取效率的定量分析，在纳米粒子与细胞孵育1，2，4 h后，消化并收集细胞，制成单细胞悬液后用流式细胞仪FCM定量检测二氢卟吩e6的荧光强度。
胞内活性氧产生：将4T1细胞以5×104/皿的密度接种在玻底皿中，待细胞贴壁后，分别加入HPe6D和HPe6DF纳米粒子(二氢卟吩e6的质量浓度为2 mg/L)孵育4 h。孵育完成后先移除培养基，再加入500 μL浓度为10 μmol/L的活性氧检测探针DCFH-DA孵育30 min。使用660 nm的激光灯
(1 W/cm2)照射1 min后加入Hoechst 33342溶液染核，最后用激光共聚焦显微镜获取荧光图像。对于流式定量分析，在光照后直接消化收集细胞上机检测。对照组为单纯培养的4T1细胞，不进行光照处理，在与活性氧检测探针DCFH-DA探针孵育后直接进行分析。
细胞毒性：将4T1细胞按5×103/孔的密度接种到96孔板中孵育24 h，再将HPe6D、HPe6DF和HA+HPe6DF纳米粒子按二氢卟吩e6浓度为0.5，1，2，4，6 mg/L分别加入孔板中。孵育4 h后移除上清液，并更换新鲜培养基，用660 nm的激光灯(1 W/cm2)照射1 min，再孵育20 h后，吸出培养基加入0.5 g/L MTT溶液孵育4 h，加入二甲亚砜震荡3 min，用酶标仪检测490 nm处吸光度值，计算细胞存活率。
细胞凋亡：将4T1细胞按1×105/孔的密度接种到6孔板中，孵育24 h后，分别加入二氢卟吩e6质量浓度为4 mg/L的HPe6D和HPe6DF纳米粒子。孵育4 h后更换新鲜培养基，再用660 nm的激光灯(1 W/cm2)照射1 min，再孵育4 h。最后消化收集细胞，经细胞凋亡检测试剂盒染色后，用流式细胞仪检测。
免疫原性细胞死亡相关因子检测：将4T1细胞按5×104个/皿的密度接种到玻底皿中，孵育24 h后，分别加入二氢卟吩e6质量浓度为2 mg/L的HPe6D和HPe6DF纳米粒子。对照组为单纯培养的4T1细胞，不进行光照处理。孵育4 h后，移除上清液更换新鲜培养基，用660 nm的激光灯(1 W/cm2)照射1 min，再孵育4 h后，分别加入稀释300倍的Alexa Fluor 488-钙网蛋白和Alexa Fluor 488-高迁移率蛋白1抗体(500 μL)孵育1 h，最后用激光共聚焦显微镜观察。对于三磷酸腺苷的检测，在光照完孵育4 h后取上清液离心，采用三磷酸腺苷检测试剂盒检测上清液中三磷酸腺苷的浓度。
胞内吲哚胺-2，3-双加氧酶活性的抑制检测：将4T1细胞按5×103孔的密度接种到96孔板中，并加入终质量浓度为50 µg/L的γ-干扰素孵育24 h，然后分别加入NLG8189和HPe6DF纳米粒子孵育48 h。对照组为单纯培养的4T1细胞，不进行任何处理。最后每孔取150 μL上清液到新的96孔板中，再分别加入75 μL 30%三氯乙酸沉淀蛋白质，50 ℃孵育30 min后，5 000 r/min离心8 min，取150 μL上清液加入75 μL含有2%对二甲氨基苯甲醛的冰醋酸溶液，测定其在490 nm处的吸光度值。
1.5   主要观察指标   HPe6DF纳米粒子的理化性能及体外抗肿瘤效果。
1.6   统计学分析   实验数据的统计结果均以x±s表示，两组之比较进行T-test分析，多组间比较进行单因素完全随机方差分析(ANOVA)，P < 0.05为差异有显著性意义。

近年来，纳米药物载体的发展一定程度上解决了光动力疗法中光敏剂的疏水性及靶向性差等问题[27-29]，这极大地推动了光动力疗法的发展，然而肿瘤缺氧仍是影响光动力疗法效果的一大难题。同时，光动力疗法通过诱导肿瘤细胞免疫原性死亡激活机体免疫应答的作用也被肿瘤部位免疫抑制微环境严重限制。因此，通过缓解缺氧增强光动力效果，并且联合免疫治疗改善肿瘤免疫抑制微环境限制成为了研究的重点。基于此，实验设计并构建了一种新型纳米粒子。首先针对光动力疗法中光敏剂的疏水性及靶向性差等问题，设计并合成了一种两亲性功能化聚氨基酸。聚氨基酸具有良好的可降解性和生物相容性，常被用作抗菌剂和基因治疗载体[30-31]，并且聚赖氨酸侧链上的大量氨基为聚赖氨酸的改性修饰提供了可能。
实验将二氢卟吩e6化学键合在聚赖氨酸侧链，一方面利用二氢卟吩e6的疏水性使亲水性赖氨酸转变成两亲性聚合物，另一方面可以提高二氢卟吩e6载药量，且避免二氢卟吩e6泄露的风险。其次，针对肿瘤缺氧限制光动力疗法疗效的问题，因全氟己烷具有氧溶解度高、生物安全性好及常温下呈液态便于包载等优点[11]，采用全氟己烷作为氧气载体用于缓解肿瘤缺氧并增强光动力疗效。有研究表明，吲哚胺-2，3-双加氧酶在肿瘤部位高表达，催化色氨酸/犬尿氨酸代谢，形成免疫抑制微环境[22-24]。而NLG8189作为一种色氨酸衍生物可以有效抑制吲哚胺-2，3-双加氧酶的活性，降低色氨酸代谢，改善免疫抑制微环境。因此，实验采用NLG8189作为免疫治疗药物，并将其改性为二聚体分子以提高载药量。实验结果表明，以两亲性功能化聚氨基酸为载体包载全氟己烷和NLG8189二聚体分子可自组装成大小均一的球形纳米粒子。
然而，以聚赖氨酸为载体的纳米粒子因大量氨基的存在而带有正电，带正电的粒子极易在血液循环中被清除。透明质酸作为一种带负电的大分子具有良好的生物相容性，常被用于纳米载体的修饰，且它可与肿瘤细胞膜上高表达的跨膜糖蛋白CD44相结合，促进纳米粒子入胞[32]。因此，实验在纳米粒子表面静电复合带负电的透明质酸，最终构建了复合纳米粒子HPe6DF，其粒径约150 nm、电位约-20 mV，呈大小均一的球形且具有核壳结构，因而可以在体积分数10%血清和5%葡萄糖溶液中稳定存在。此外，HPe6DF纳米粒子在透明质酸酶溶液中孵育时的粒径和电位均明显提高，表现出一定的透明质酸酶响应性。氧气负载量和活性氧产生能力测试结果表明，与不含全氟己烷的HPe6D纳米粒子相比，HPe6DF纳米粒子具有更优异的氧气负载能力及活性氧产生能力，为缓解缺氧增强光动力疗法提供了有利保证。
此外，实验以4T1细胞做为模型细胞，对HPe6DF纳米粒子的体外抗肿瘤效果进行评价。首先，细胞对纳米粒子的有效摄取是胞内活性氧产生的前提，使用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪分别对纳米粒子的细胞摄取进行了定性和定量分析，结果表明，HPe6DF纳米粒子以时间依赖的方式在胞内累积，并且在其余条件相同时，透明质酸预孵育组的荧光强度明显弱于无透明质酸预孵育组，这证明HPe6DF纳米粒子可通过跨膜糖蛋白CD44介导的方式加速入胞，与WANG等[32]的研究结果一致。
光动力疗法通过产生细胞毒性活性氧诱导细胞凋亡和坏死，从而杀死肿瘤细胞[33-35]，其中活性氧的产生是重中之重。CHEN等[11]的研究已经证实，全氟化碳可有效缓解缺氧，提高活性氧产率并增强抗肿瘤效果。此次实验对HPe6DF纳米粒子的胞内活性氧产生和体外抗肿瘤效果等进行了验证，结果表明，经过携带外源性氧气HPe6DF纳米粒子处理的肿瘤细胞胞内活性氧的荧光强度明显高于HPe6D处理组，说明全氟己烷的存在为光动力疗法提供了更多的氧气，导致了更多的活性氧产生。进一步检测不同处理条件对肿瘤细胞存活率的影响，实验结果表明，在无光照条件下，各组细胞的存活率均在85%以上，说明不光照时各组基本无细胞毒性；在光照后，HPe6DF处理组细胞存活率最低。
另外，透明质酸预处理组的细胞活性略高于无透明质酸预处理组，这是由于透明质酸预孵育阻塞了跨膜糖蛋白CD44，导致细胞对纳米粒子摄取减少导致的。细胞凋亡检测结果与细胞毒性实验结果相同。以上结果说明，通过全氟碳化物缓解缺氧可有效增强光动力疗效。光动力疗法可以通过诱导细胞凋亡引发免疫原性细胞死亡，这是光动力疗法激活机体免疫应答的前提[36-40]，因为细胞免疫原性死亡可以分泌多种细胞因子，包括钙网蛋白、高迁移率蛋白1和三磷酸腺苷，这些因子可以促进树突状细胞的成熟及抗原递呈，从而激活免疫应答。上述3种免疫原性死亡特征的检测结果表明，HPe6DF纳米粒子处理组中的钙网蛋白和高迁移率蛋白1荧光最强，胞外三磷酸腺苷含量最高，说明搭载了全氟己烷的HPe6DF纳米粒子提高了光动力疗效的同时，诱导了更多的免疫原性细胞死亡。而免疫原性细胞死亡激活的免疫应答常被免疫抑制微环境所限制，GAO等[25]采用光动力疗法和免疫治疗联合的方式有效激活了机体免疫应答，并取得了更好的治疗效果。在此次实验中，为了改善肿瘤部位的免疫抑制微环境，使用NLG8189对吲哚胺-2，3-双加氧酶这一靶点进行了抑制，实验结果表明，HPe6DF纳米粒子显著抑制了吲哚胺-2，3-双加氧酶的活性，上调了色氨酸的含量，表明光动力疗法与吲哚胺-2，3-双加氧酶抑制剂联用存在缓解肿瘤部位免疫抑制微环境、放大光动力疗法免疫激活效应的潜力。
综上所述，实验设计并制备了一种通过缓解缺氧增强光动力疗法并减轻免疫抑制的纳米载体HPe6DF，通过实验证明了它既可以通过缓解缺氧提高光动力效率、增强肿瘤细胞的免疫原性，还可以有效抑制吲哚胺-2，3-双加氧酶活性，逆转肿瘤部位免疫抑制微环境，为肿瘤治疗打开了新的思路，具备广阔的发展前景。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

文题释义：
光动力疗法：是一种毒副作用小、可重复光照治疗及创伤轻微的癌症治疗方法，其原理是在特定波长激光的照射下，光敏剂可以吸收激光的能量，发生一系列化学反应生成具有细胞毒性的活性氧，从而杀死肿瘤细胞。
NLG8189：是一种吲哚胺-2，3-双加氧酶的小分子抑制剂，它通过抑制肿瘤细胞内吲哚胺-2，3-双加氧酶的活性，减少色氨酸向犬尿氨酸的代谢，从而促进T细胞的增殖分化，改善免疫抑制微环境。#br#

实验通过全氟化碳供氧缓解肿瘤缺氧，增强光动力疗效，显著提高了抗肿瘤效果，同时增强光动力疗法诱发的免疫原性细胞死亡，提高肿瘤细胞免疫原性。与此同时联合吲哚胺-2，3-双加氧酶抑制剂抑制色氨酸代谢，改善免疫抑制微环境，进一步激活机体免疫应答，以实现优异的联合抗肿瘤效果。该研究为设计具有增强光动力疗法疗效进而诱导免疫治疗的载体系统提供了新的思路和方法。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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