原花青素可抑制高糖诱导兔髓核细胞的凋亡

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1747

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (21): 3426-3431.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1747

• 干细胞基础实验 basic experiments of stem cells • 上一篇下一篇

原花青素可抑制高糖诱导兔髓核细胞的凋亡

徐庆¹，房好林²，刘阳³，张存鑫⁴，田宝方²

济宁市第一人民医院，¹麻醉手术部，²急诊创伤外科，⁴脊柱外科，山东省济宁市 272000；³诸城市人民医院关节外科，山东省诸城市 262200

修回日期:2019-03-04 出版日期:2019-07-28 发布日期:2019-07-28
通讯作者: 房好林，硕士，主治医师，济宁市第一人民医院急诊创伤外科，山东省济宁市 272000
作者简介:徐庆，女，1987年生，山东省邹城市人，汉族，2013年山东大学毕业，护师，主要从事脊髓损伤护理的研究。
基金资助:
山东省保健科技协会科学技术课题(SDBJKT20180131)，项目负责人：房好林

Proanthocyanidins inhibit high glucose-induced apoptosis in nucleus pulposus cells in a rabbit

Xu Qing¹, Fang Haolin², Liu Yang³, Zhang Cunxin⁴, Tian Baofang²

¹Department of Anesthesia, ²Department of Traumatology, ⁴Department of Spine Surgery, Jining No. 1 People’s Hospital, Jining 272000, Shandong Province, China; ³Department of Joint Surgery, Zhu Cheng People’s Hospital, Zhucheng 262200, Shandong Province, China

Revised:2019-03-04 Online:2019-07-28 Published:2019-07-28
Contact: Fang Haolin, Master, Attending physician, Department of Traumatology, Jining No. 1 People’s Hospital, Jining 272000, Shandong Province, China
About author:Xu Qing, Senior nurse, Department of Anesthesia, Jining No. 1 People’s Hospital, Jining 272000, Shandong Province, China
Supported by:
the Scientific and Technical Project of Shandong Health Science and Technology Association, No. SDBJKT20180131 (to FHL)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
原花青素(简称PC)：是一种有着特殊分子结构的生物类黄酮混合物，其低聚物——低聚原花青素(OPC)是目前国际上公认的清除人体内自由基有效的天然抗氧化剂。一般为红棕色粉末，气微、味涩，溶于水和大多有机溶剂。研究表明蓝莓叶提取物原花青素可阻止丙肝病毒复制，是一种有着特殊分子结构的生物类黄酮，能清除人体内自由基有效的天然抗氧化剂，具有很强的体内活性，一般为葡萄籽提取物或法国海岸松树皮提取物。
血红素氧合酶(heme oxygenase，HO)：血红素氧合酶是血红素降解的限速酶，将血红素转变为胆绿素IX，CO和铁，胆绿素随即被还原为胆红素。已知血红素氧合酶有3种同工酶，HO-1、HO-2和HO-3。HO-2和HO-3呈组成型大量表达，它们可能作为正常细胞内的血红素结合而分别发挥其功能。HO-1属诱导型，广泛分布于哺乳动物多种组织细胞中。HO-1可由多种刺激因子诱导表达，如氧化应激、热休克、紫外线照射、缺血再灌注、重金属、细菌脂多糖、细胞因子和NO以及其底物血红素。血红素氧合酶具有抗氧化、抗炎、抗凋亡、信号传导和免疫调节以及抑制黏附分子表达活性等作用。HO-1对各种刺激因子强大的适应性反应，在阻止炎症过程和氧化性组织损伤中具有重要的作用。

摘要
背景：原花青素因其高效的抗氧化活性成为目前国际上公认的人体活性氧自由基清除剂。
目的：探讨原花青素是否对高糖诱导髓核细胞凋亡具有显著抑制作用，并分析其具体分子机制。
方法：健康2月龄新西兰大白兔，由山东康大生物科技有限公司提供，实验方案经山东省保健科技协会批准。体外培养兔髓核细胞，传至5代。取第3代髓核细胞(细胞浓度至1×10⁸ L^-1)，分别接种在6个4孔培养板中，分别加入不同浓度原花青素(0，10，20，30，40，50，60 µmol/L)，采用CCK-8试剂盒检测细胞的增殖活性，以确定合适的原花青素浓度。实验分为4组：①对照组：无高浓度葡萄糖和原花青素；②高糖组：培养液中含有100 mmol/L葡萄糖，无原花青素；③原花青素组：培养液中含有40 µmol/L原花青素，无高浓度葡萄糖；④高糖+原花青素组：40 µmol/L原花青素预处理6 h后再加入100 mmol/L高浓度葡萄糖。采用倒置显微镜观察髓核细胞形态、绘制细胞生长曲线；检测细胞凋亡率、细胞内总活性氧、血红素氧合酶的表达情况。
结果与结论：①兔髓核细胞呈多角形、短梭形，随着传代次数增加，细胞伸出伪足，胞体逐渐变细长；②细胞呈“S”型曲线生长。传代后第1天，细胞生长缓慢，从第2-5天细胞生长迅速，随着细胞传代次数的增加，细胞的生长活性逐渐降低；③通过筛选发现，原花青素浓度为40 µmol/L时为较适宜浓度；④流式细胞仪检测发现，高糖组髓核细胞凋亡率显著增加，原花青素预处理髓核细胞后，与高糖组比较，细胞凋亡率显著降低(P < 0.05)；⑤Western blot检测显示，原花青素可显著增加血红素氧合酶1的表达，且血红素氧合酶1的表达量与细胞凋亡率、活性氧自由基积聚程度和细胞增殖活性趋势相反；⑤结果说明，原花青素可通过上调血红素氧合酶1的表达，抑制高糖诱导的髓核细胞凋亡增加、细胞内活性氧积聚和增殖活性下降。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-2908-5290(徐庆)

关键词: 组织构建, 软骨细胞, 髓核细胞, 细胞凋亡, 细胞增殖, 活性氧自由基, 椎间盘, 原花青素, 血红素氧合酶1, 葡萄糖

Abstract:

BACKGROUND: Proanthocyanidins are an internationally recognized active oxygen free radical scavenger in the human body due to their high antioxidant activity.
OBJECTIVE: To investigate whether proanthocyanidins has a significant inhibitory effect on high glucose-induced apoptosis in nucleus pulposus cells and to investigate its molecular mechanism.
METHODS: Healthy 2-month-old New Zealand white rabbits were provided by Shandong Kond Biotechnology Co., Ltd., and the study protocol was approved by Health Care Technology Association of Shandong Province, China. Nucleus pulposus cells were isolated, cultured and passaged to the 5 generation in vitro. Passage 3 nucleus pulposus cells at a concentration of 1×10⁸/L were inoculated into six 4-well culture plates and cultured in proanthocyanidins at different concentrations (0, 10, 20, 30, 40, 50, 60 µmol/L). Cell proliferation was detected using cell counting kit-8, to determine the proper concentration of proanthocyanidins. Cells were divided into four groups and cultured normally, in the medium containing 100 mmol/L glucose, in the medium containing 40 µmol/L proanthocyanidins, and in the medium containing 40 µmol/L proanthocyanidins and 100 mmol/L glucose (combination group, in which 100 mmol/L glucose was added after 6-hour pretreatment with 40 µmol/L proanthocyanidins), respectively. The morphology of nucleus pulposus cells was observed by inverted microscope, and the cell growth curve was drawn. The apoptotic rate, intracellular reactive oxygen species and expression of heme oxygenase in the cells were detected.
RESULTS AND CONCLUSION: Nucleus pulposus cells from rats showed polygonal and short spindle shapes and cellular pseudopod appeared gradually and then became slim with increasing passage numbers. The cells grew in an “S”-shaped curve. The cells grew slowly on day 1 after passage, and grew rapidly from day 2 to day 5. As the number of passages increased, the cell viability gradually decreased. It was found that the proper concentration of proanthocyanidins was 40 μmol/L. Flow cytometry results showed that the apoptosis rate of nucleus pulposus cells in the high glucose group was significantly increased. Pretreatment with proanthocyanidins significantly decreased the apoptosis rate as compared to the high glucose group (P < 0.05). Results of western blot assay showed that proanthocyanidins significantly increased the expression of heme oxygenase-1, and moreover, the expression of heme oxygenase 1 was negatively correlated with the apoptotic rate, active oxygen free radical accumulation and cell proliferation activity. All the findings indicate that proanthocyanidins could inhibit the apoptosis of nucleus pulposus cells induced by high glucose, and decrease intracellular reactive oxygen species accumulation and proliferation activity by up-regulating the expression of heme oxygenase 1.

Key words: tissue construction, chondrocytes, nucleus pulposus cells, apoptosis, cell proliferation, reactive oxide species, intervertebral disc, proanthocyanidin, heme oxygenase-1, glucose

中图分类号:

R453
R318

徐庆，房好林，刘阳，张存鑫，田宝方. 原花青素可抑制高糖诱导兔髓核细胞的凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(21): 3426-3431.

Xu Qing, Fang Haolin, Liu Yang, Zhang Cunxin, Tian Baofang. Proanthocyanidins inhibit high glucose-induced apoptosis in nucleus pulposus cells in a rabbit[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(21): 3426-3431.

图/表（结果） 3

2.1 兔髓核细胞形态学观察 原代髓核细胞镜下细胞呈球形，大小基本均一，可吸附在培养瓶底，或悬浮在培养液中，见图1A；培养1周后开始贴壁。贴壁后的髓核细胞变扁并伸出伪足，呈三角形、短棒形或短梭形。细胞核较大，部分细胞可见双核，见图1B；约2周后，髓核细胞完全贴壁，并伸出的伪足相互连接成片。未贴壁的细胞为死亡细胞，呈球形漂浮于培养液中，见图1C；培养约3周时，原代髓核细胞连接成片，可占据培养瓶底80%以上面积，见图1D。

2.2 髓核细胞生长曲线变化 通过对1-5代髓核细胞计数观察发现，细胞呈“S”型曲线生长。传代后第1天，细胞生长缓慢，从第2-5天细胞生长迅速，随着细胞传代次数的增加，细胞的生长活性逐渐降低。第1-3代细胞生长活性较强，细胞形态相对维持不变。第4代髓核细胞开始发生退变，为细胞形态和功能从正常到退变的过渡期。第5代之后，细胞生长增殖能力显著减退，细胞形态发生变化，由多角形、短梭形逐渐变成长梭形，逐渐向成纤维细胞演变，见图2。

2.3 髓核细胞凋亡、细胞内活性氧和增殖活性检测结果 通过筛选发现，原花青素浓度为40 µmol/L时为较适宜浓度，见图3A；使用CCK-8试剂盒检测发现高浓度葡萄糖可显著抑制髓核细胞的增殖活性，见图3B；使用原花青素预处理6 h可显著拮抗高浓度葡萄糖所致的细胞毒性。这种变化趋势同样发现在细胞内总活性氧的检测结果中，见图3C；流式细胞仪检测发现，高糖组髓核细胞凋亡率显著增加，见图3D；原花青素预处理髓核细胞后，与高糖组比较，细胞凋亡率显著降低(P < 0.05)。Western blot技术用来分析血红素氧合酶1表达变化，使用β-actin作为内参。灰度分析发现，原花青素可显著增加血红素氧合酶1的表达，且血红素氧合酶1的表达量与细胞凋亡率、活性氧自由基积聚程度和细胞增殖活性趋势相反,见图3E和图3F。进一步说明原花青素通过上调血红素氧合酶1的表达抑制高糖的细胞毒性。

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引言

糖尿病是一种全身代谢性疾病，其靶器官遍布全身，包括心脏、肾脏、大小血管、视网膜等^[1]。研究发现，糖尿病患者椎间盘中聚集了大量的未硫酸化糖胺聚糖，附带正电荷的未硫酸化糖胺聚糖中和了椎间盘髓核组织内的负电荷，使髓核组织趋于电荷平和，失去了对水分子的维持能力，从而导致椎间盘内水分减少，引起椎间盘的退变^[2]。因此，糖尿病也是椎间盘退变的危险因素之一。

研究发现，细胞在分解利用葡萄糖过程中可产生大量活性氧自由基。Liu等^[3]发现，在脊髓星形细胞中，高浓度葡萄糖可以通过激活PERK通路生产并积聚过量的活性氧自由基，同时这些过量的活性氧自由基又可抑制NF-kB的激活，阻碍细胞的自我保护作用的发挥。Liu等^[4]研究同样发现，高糖在海马神经元细胞代谢中亦可产生及积累大量的活性氧自由基，引起海马神经元细胞凋亡。研究发现，活性氧自由基可以通过中和生物膜上的电子使细胞膜或细胞器膜失去功能，引起细胞水肿，或进入细胞核中直接攻击DNA分子，引起细胞凋亡，导致各种疾病的产生^[5-6]。因此抑制细胞内活性氧自由基的产生及积累，对预防细胞衰老、凋亡或死亡所致的各种疾病具有重要意义。

目前在医疗和食品领域中使用的抗氧化剂大多是化学合成抗氧化剂，研究表明这些化学合成的抗氧化剂如BHA、BHT等对人体有潜在的毒副作用，如致癌、致畸等^{[7- 8]}。因此从自然界中寻找高效、低毒的天然抗氧化剂具有广阔的市场前景，故而中国丰富的中草药资源成为众多学者的研究热点。Zhang等^[9]发现CDDO-EA可通过Nrf2/ ARE通路上调血红素氧合酶1的表达，抑制高糖诱导的髓核细胞凋亡。Wang等^[10]发现羊栖菜提取物(一种纤维素酶)具有抵抗氧化应激所致的细胞凋亡无论是在体内或体外。

原花青素因其高效的抗氧化活性被认为是目前国际上公认的人体活性氧自由基清除剂^[11-12]。实验证明，低聚原花青素的抗自由基氧化能力是维生素E的50倍，维生素C的20倍，并吸收迅速完全，不良反应低^[13-14]。Sun等^[11]研究发现，原花青素可以通过Nrf2/ARE信号传导通路上调血红素氧合酶1、NQO-1及NADPH等抗氧化酶的表达，抑制TXNRD1的表达来抵抗H₂O₂诱导的A549细胞氧化应激损伤。Hu等^[15]研究发现，在心肌细胞中，原花青素可以通过PI3K/Akt/ GSK-3β通路开放mitoKATP通道，使蛋白激酶B (Akt)和丝氨酸/苏氨酸激酶(GSK-3β)磷酸化，从而发挥抗氧化应激功能。Nazima等^[12]研究发现，原花青素可以通过Nrf2/Keap1信号传导通路抑制诱导型一氧化氮合酶、NF-κB、肿瘤坏死因子α、caspase-3和Bax等蛋白的表达，上调Bcl-2的表达来抵抗金属镉对肾脏的毒性。Jiang等^[16]研究发现，原花青素可以通过JNK/ERK、MAPK和PI3K/Akt信号传导通路发挥其抗氧化应激损伤的作用。原花青素其全面、高效的抗氧化性，使得它成为世界公认的天然抗氧化剂。

中草药活性成分具有抗氧化、抗癌、抗细胞凋亡等作用，且这些天然活性成分安全、高效，因此研究这些活性成分的药效及分子机制，对治疗和干预退行性疾病具有重要意义。课题旨在研究原花青素是否对高糖诱导髓核细胞凋亡具有显著抑制作用，并研究其具体分子机制，为临床开发抑制髓核细胞凋亡及椎间盘退变的药物提供一定的理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 分组对照细胞学实验。

1.2 时间及地点 实验于2018年6月至2019年2月在济宁医学院实验室完成。

1.3 材料 健康2月龄新西兰大白兔6只，雌雄不限，体质量1.0-1.5 kg。动物由山东康大生物科技有限公司提供，许可证号：SCXK(鲁)20120005。动物实验符合《Ethical issues in animal experimentation》伦理学标准。实验方案经山东省保健科技协会批准。

1.4 实验方法

1.4.1 兔髓核细胞体外分离培养 新西兰大白兔麻醉后，耳缘静脉注射空气栓塞猝死。无菌条件下取出腰椎。切开纤维环，刮取凝胶状髓核组织，无菌剪刀将髓核组织切剪成1 mm×1 mm×1 mm的小块，转移至离心管，0.25%胰蛋白酶消化20 min。加入胎牛血清终止消化后，离心去上清，Ⅱ型胶原酶消化60 min，加入胎牛血清终止消化。200目滤网过滤后，将滤液离心弃上清后重新加入DMEM/F-12培养液混悬。调整细胞浓度为(3-5)×10⁸ L^-1后，接种到培养瓶中，置于细胞培养箱中培养。原代细胞接种3 d后首次半量换液，以后每隔三四天全量换液。待细胞汇合85%以后，胰酶消化传代。

1.4.2 绘制细胞生长曲线 取第1-5代髓核细胞经0.25%胰蛋白酶胰消化后重新调整细胞浓度至1×10⁸ L^-1，分别接种到5个24孔培养板中，置于细胞培养箱中培养。每天从各培养板取出3孔细胞，将每孔细胞混匀成等体积，用细胞计数仪对每孔细胞悬液计数，取平均值，以时间(d)为横坐标，细胞数量(L^-1)为纵坐标，绘制细胞生长曲线。

1.4.3 原花青素浓度筛选 将第3代髓核细胞培养汇合至80%时，胰酶消化后调整细胞浓度至1×10⁸ L^-1，分别接种在6个4孔培养板中培养，调整每个培养板中培养基原花青素浓度分别为0，10，20，30，40，50，60 µmol/L。细胞培养箱中培育24 h后，采用CCK-8试剂盒检测每板细胞的增殖活性，以确定合适的原花青素浓度。

1.4.4 实验分组 将第3代髓核细胞胰酶消化后，调整细胞浓度为1×10⁸ L^-1，随机接种到4个4孔培养板中，分为4组。①对照组：无高浓度葡萄糖和原花青素；②高糖组：培养液中含有100 mmol/L葡萄糖，无原花青素；③原花青素组：培养液中含有40 µmol/L原花青素，无高浓度葡萄糖；④高糖+原花青素组：40 µmol/L原花青素预处理6 h后再加入100 mmol/L高浓度葡萄糖。于细胞培养箱中培养6 h后检测各组细胞增殖活性、凋亡率、活性氧自由基及血红素氧合酶1表达情况。

1.4.5 细胞增殖活性检测 取第3代指数增长期的髓核细胞，消化、混悬，调整细胞浓度为1×10⁸ L^-1后接种到96孔板，置于培养箱中培养，待细胞汇合70%时，按照实验分组，更换含有不同成分的培养基。置于培养箱中培养6 h后弃掉原液，DMEM/F-12培养液洗涤2次后，每孔重新加入DMEM/F-12培养液100 µL及10 µL CCK-8溶液，培养箱中孵育2 h后，采用多功能孔板测读仪检测各孔在450 nm处的A值。

髓核细胞增殖活力(%)=[A(实验组)-A₍空白组)]/[A(对照组)-A(空白组)]×100%

A(加药)：髓核细胞、CCK-8溶液和培养基的孔的A值；

A(空白)：培养基和CCK-8溶液，不含髓核细胞的孔的A值；

A(对照)：髓核细胞、CCK-8溶液的孔的A值。

1.4.6 细胞内总活性氧检测 将髓核细胞按照实验分组及处理条件完成实验干预后，消化收集细胞备用。用DMEM/ F-12培养液稀释DCFH-DA，调整浓度为10 µmol/L后，重新混悬备用髓核细胞，置于培养箱中20 min后。PBS洗涤去除培养液中的DCFH-DA，调整细胞浓度为1×10⁸ L^-1后接种到黑色96孔酶标板中，每孔100 µL，每组设定5孔。活性氧阳性对照试剂为Rosup。调整多功能孔板测读仪激发波长488 nm、发射波长525 nm，检测各组细胞荧光强度。

1.4.7 细胞凋亡率检测 将髓核细胞按照实验分组及处理条件完成实验干预后，消化收集细胞，使用4 ℃预冷PBS重新混悬，再次离心去上清；加入300 µL的1×Binding Buffer和5 µL的Annexin V-FITC重新混匀后，避光孵育15 min；上机前5 min再补加入5 µL的PI染液和200 µL的1×Binding Buffer，混匀后流式细胞仪检测各组凋亡率。每组设3个重复，取平均值。

细胞凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。

1.4.8 血红素氧合酶1表达检查 使用Western-blot技术分析血红素氧合酶1的表达情况。各组细胞按不同实验条件处理后提取总蛋白。使用BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)检测各组蛋白样品的浓度。将等量的蛋白样品加样后，电泳、转膜后，取出 PVDF膜加入二抗，室温孵育1.5 h后，经Bio-rad凝胶成像系统显影后采集图像。

1.5 主要观察指标 ①兔髓核细胞形态学观察；②髓核细胞生长曲线变化；③检测细胞凋亡率、细胞内总活性氧、血红素氧合酶蛋白的表达。

1.6 统计学分析 实验结果采用19.0 SPSS统计学软件分析，计量资料以x(_)±s表示，两样本均数比较采用t 检验，以P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

实验成功实现了兔髓核细胞的体外培养，通过培养发现，髓核细胞呈多角形、短梭形等不规则形状，且原代髓核细胞生长缓慢，第1-3代髓核细胞生长迅速，细胞增殖活性较高，细胞功能、形态维持较好。从第4代开始，细胞生长逐渐缓慢，细胞形态由多角形、短梭形逐渐演变成长梭型，逐渐向成纤维细胞演变，至第5代髓核细胞已经失去原有形态，变成巨大、长梭、扁平状，紧紧贴附于培养瓶底，且生长季度缓慢，胞质中散在各种碎片装杂质，不在具备髓核细胞的功能特性。因此，建议使用第3代髓核细胞作为研究对象。另外，通过使用原花青素预处理髓核细胞后发现，原花青素可以通过上调血红素氧合酶1的表达，抑制高浓度葡萄糖所致的细胞毒性。

在课题组的既往研究中，采用胰酶联合Ⅱ型胶原酶的方法，较好的实现了兔髓核细胞的体外培养，并对细胞进行鉴定，确认培养的细胞为髓核细胞^[17]。此次实验采用了相同的髓核细胞培养方法。椎间盘组织中主要的结构成分包括Ⅱ型胶原蛋白、聚集蛋白多糖的基质成分，细胞成分则是髓核细胞，因此从髓核组织中培养出来的，能够合成Ⅱ型胶原蛋白、聚集蛋白多糖等成分的软骨细胞，默认为髓核细胞^[18-19]。因此作者认为，此次实验中所培养的细胞为髓核细胞，与Ouyang等^[20]、Li等^[21]、李树文等^[22]的研究基本一致。因此，建议在关于椎间盘髓核细胞的研究中，最好采用第3代髓核细胞作为研究对象。3代之前的髓核细胞虽然各方面都更接近体内情况，但未发生退变的髓核组织取材困难，原代培养的数量较少，即便是传代至第2代，细胞数量仍显不足，细胞相对比较珍贵。而4代及之后的髓核细胞虽然经历多次传代后细胞数量较多，但是细胞已经开始退变，不再适宜研究髓核细胞的各项功能机制。此外，传代后的髓核细胞大致经历潜伏期、对数生长期和停滞期，生长曲线大致呈“S”型。传代后第1天为潜伏期，细胞贴壁、生长缓慢；第2-5进入对数生长期，此期细胞快速生长及分裂活跃，镜下可见多个核分裂象；第6天之后基本处于停滞期，细胞数量基本不再增加。所以传代后第2-5天(对数生长期)的髓核细胞增殖活性较高，是比较理想的实验阶段。

多种理化因素可通过氧化应激损伤诱导髓核细胞凋亡及椎间盘退变，这些因素包括高龄^[23]、营养缺乏^[24]、机械负荷^[25]、物理化学因素及高浓度葡萄糖等^[26-27]。高糖应激产生的活性氧自由基广泛参与了髓核细胞凋亡及椎间盘退变^[28]。活性氧自由基可通过抑制Ⅱ型胶原蛋白、蛋白聚集多糖等细胞基质蛋白合成，破坏相关蛋白酶活性，导致细胞外基质退化，引起椎间盘退变。活性氧自由基可激活细胞的线粒体凋亡途径，也叫内源性凋亡途径，其特点是线粒体膜的通透性发生改变，细胞色素C释放到胞浆中，激活细胞凋亡的级联反应，最终导致基因组DNA的降解。因此抑制和减少活性氧自由基的产生及积聚对抑制或治疗椎间盘退变具有重要意义^[29-30]。

原花青素是一种有着特殊活性的生物类黄酮混合物，因其高效的抗氧化活性被认为是目前国际上公认的人体活性氧自由基清除剂^[11^，^31]。原花青素主要提取自葡萄籽或法国海岸松树皮。葡萄籽提取物是一种新型高效的抗氧化剂，具有很强的体内活性。实验证明，低聚原花青素的抗自由基氧化能力是维生素E的50倍，维生素C的20倍，并吸收迅速完全，不良反应低^[13-14]。因此推断，在椎间盘髓核细胞中，原花青素同样可以清除细胞内活性氧自由基的产生及积累，抵抗高糖诱导的氧化应激损伤。

在此次实验中，发现原花青素组髓核细胞中血红素氧合酶1表达显著增加，细胞增殖活性、细胞凋亡率及活性氧自由基产生量变化不明显。高糖+原花青素组中血红素氧合酶1表达显著增加，细胞增殖活性、细胞凋亡率及活性氧自由基产生量较对照组显著增加，但与高糖组比较确显著减少。因此，作者认为，在髓核细胞中，原花青素可上调血红素氧合酶1的表达，抑制高糖诱导的氧化应激损伤。此外，此次实验并没有继续研究原花青素上调血红素氧合酶1的分子通路。通过阅读国内外相关文献，了解到原花青素作为一种天然高效的抗氧化剂，可通过多种信号传导通路(如Nrf2/ARE通路、PI3K/Akt/GSK-3β通路、JNK/ERK通路和MAPK通路等)，激活各种抗氧化酶的表达，清除活性氧自由基，发挥其抗氧化损伤的作用。细胞内信号传导通路网络错综复杂，从如此庞大的网络中筛选某一条通路并不容易，受课题经费及研究时间有限，没有进一步分析原花青素在髓核细胞中上调血红素氧合酶1的分子通路。另外，原花青素可以上调多种抗氧化酶(如NQO-1、NADPH、蛋白激酶B、丝氨酸/苏氨酸激酶等)的表达。在此次实验仅仅检测了血红素氧合酶1的表达情况，根据相关文献报道，推测其他抗氧化酶也同样会增加表达。因此，血红素氧合酶1不是唯一发挥作用的抗氧化酶。

综上所述，原花青素作为一种安全、高效的活性氧自由基清除剂，在髓核细胞中可以通过上调血红素氧合酶1的表达，抑制高浓度葡萄糖诱导的细胞毒性。因此，原花青素在椎间盘退变性疾病的预防和治疗中，具有巨大潜力。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

原花青素可抑制高糖诱导兔髓核细胞的凋亡

Proanthocyanidins inhibit high glucose-induced apoptosis in nucleus pulposus cells in a rabbit

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