积雪草苷对肾缺血再灌注损伤模型大鼠的保护作用

doi:10.12307/2022.657

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (23): 3609-3614.doi: 10.12307/2022.657

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积雪草苷对肾缺血再灌注损伤模型大鼠的保护作用

朱时玉1，胡彦1，王锁刚2，卢鹏2，王帝2，翟琼瑶2，王光策2

1河南中医药大学第一临床医学院，河南省郑州市 450046；2河南中医药大学第一附属医院泌尿外科肾移植科，河南省郑州市 450000

收稿日期:2021-04-09 接受日期:2021-05-26 出版日期:2022-08-18 发布日期:2022-02-15
通讯作者: 王光策，主任医师，河南中医药大学第一附属医院泌尿外科肾移植科，河南省郑州市 450000
作者简介:朱时玉，男，1994年生，河南省义马市人，汉族，2021年河南中医药大学毕业，硕士，医师，主要从事泌尿系结石及肿瘤、肾移植方面的研究。
基金资助:
河南省中医药科学研究专项课题(20-21ZY2188)，项目负责人：王锁刚

Asiaticoside protects the kidney from ischemia-reperfusion injury in a rat model by activating nuclear factor E2-related factor 2/hemeoxygenase-1 pathway

Zhu Shiyu1, Hu Yan1, Wang Suogang2, Lu Peng2, Wang Di2, Zhai Qiongyao2, Wang Guangce2

1The First Clinical Medical College of Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, Henan Province, China; 2Kidney Transplant Department of Urological Surgery, the First Affiliated Hospital of Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, Henan Province, China

Received:2021-04-09 Accepted:2021-05-26 Online:2022-08-18 Published:2022-02-15
Contact: Wang Guangce, Chief physician, Kidney Transplant Department of Urological Surgery, the First Affiliated Hospital of Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, Henan Province, China
About author:Zhu Shiyu, Master, Physician, the First Clinical Medical College of Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, Henan Province, China
Supported by:
the Special Research Project of Traditional Chinese Medicine in Henan Province, No. 20-21ZY2188 (to WSG)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
肾缺血再灌注损伤：是指肾脏经过急性缺血后恢复供血的阶段，缺氧的过程启动了肾脏中的一系列炎症反应，缺氧造成低能量状态，再灌注后会出现一系列的坏死和凋亡，肾小管上皮细胞周围微环境发生改变，肾小管上皮细胞、肾间质细胞等释放大量趋化因子，诱发炎症风暴。由缺血再灌注损伤导致的急性肾损伤和慢性肾脏病已成为全世界范围内的医疗负担。
积雪草苷：是中药积雪草的提取物，其中以积雪草苷、羟基积雪草苷的含量最高、活性最强，具有抗氧化应激、促进组织愈合改善微循环、增强认知和保护神经、抗肿瘤、抗焦虑、抗炎、抗糖尿病、抗缺血再灌注损伤等作用。

背景：预防或减少肾缺血再灌注损伤可提高肾移植手术移植物的存活率，因此需要寻找更为安全、有效、廉价的科学药物来预防或治疗肾缺血再灌注损伤。
目的：探讨积雪草苷对肾缺血再灌注损伤模型大鼠的保护作用及相关机制。
方法：将40只SD大鼠随机分为4组，分别为假手术组、模型组、积雪草苷组及积雪草苷+鸦胆子苦醇组，每组10只，后3组夹闭肾蒂45 min建立大鼠肾缺血再灌注损伤模型。积雪草苷组、积雪草苷+鸦胆子苦醇组预先给予大鼠积雪草苷混悬液灌胃4周，积雪草苷+鸦胆子苦醇组于造模前5 d连续腹腔注射核因子E2相关因子2特异性抑制剂鸦胆子苦醇。检测各组大鼠血清中肌酐和尿素氮水平，酶联免疫吸附实验法检测尿液中肾损伤分子1的表达，测定肾组织中超氧化物歧化酶和丙二醛表达水平，苏木精-伊红染色观察肝组织病理改变，免疫组化检测肾组织内核因子E2相关因子2蛋白的表达，蛋白质印迹法检测肾组织细胞内核因子E2相关因子2和血红素加氧酶1蛋白的表达。
结果与结论：①与模型组比较，积雪草苷组血清肌酐和尿素氮水平明显降低(P < 0.05)，尿液中肾损伤分子1表达明显降低(P < 0.05)，肾组织中超氧化物歧化酶表达明显升高(P < 0.05)，而丙二醛表达明显降低(P < 0.05)，肾组织病理改变也明显改善；②与积雪草苷组比较，积雪草苷+鸦胆子苦醇组血清肌酐和尿素氮水平增加(P < 0.05)，尿液中肾损伤分子1表达增加(P < 0.05)，肾组织超氧化物歧化酶降低(P < 0.05)，而丙二醛增加(P < 0.05)；③同时积雪草苷能显著诱导核因子E2相关因子2的表达水平和核内移位，增加血红素加氧酶1的表达水平；④提示积雪草苷对肾缺血再灌注损伤有保护作用，其机制与激活核因子E2相关因子2/血红素加氧酶1通路有关。
缩略语：核因子E2相关因子2：NF-E2-related factor2，Nrf2；血红素加氧酶1：hemeoxygenase-1，HO-1

https://orcid.org/0000-0003-1339-0987 (朱时玉)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 积雪草苷, 肾, 缺血再灌注损伤, 鸦胆子苦醇, Nrf2/HO-1通路

Abstract: BACKGROUND: Prevention or reduction of kidney ischemia-reperfusion injury can improve the livability of kidney transplant. Therefore, it is necessary to develop safer, cheaper and more effective drugs to prevent or treat kidney ischemia-reperfusion injury.
OBJECTIVE: To investigate the protective effect of asiaticoside on kideny ischemia-reperfusion injury in a rat model and its relevant mechanism.
METHODS: A total of 40 Sprague-Dawley rats were randomly divided into four groups: sham surgery group, model group, asiaticoside group, and asiaticoside+brusatol group, with 10 rats in each group. The kidney pedicles were clamped for 45 minutes in the latter three groups to establish the rat kidney ischemia-reperfusion injury model. The rats in the asiaticoside and asiaticoside+brusatol groups were given asiaticoside suspension by gavage for 4 weeks in advance. Before modeling, the asiaticoside+brusatol group was given brusatol, a nuclear factor E2-related factor 2-specific inhibitor, by intraperitoneal injection for 5 continuous days. The levels of serum creatinine and urea nitrogen were detected. The expression of kidney injury molecule-1 in urine was detected by enzyme-linked immunosorbent assay. The expression levels of superoxide dismutase and malondialdehyde in kidney tissue were measured. Hematoxylin-eosin staining was used to observe the pathological changes of liver tissue. The protein expression of nuclear factor E2-related factor 2 protein in kidney tissue was detected by immunohistochemistry. The protein expression of nuclear factor E2-related factor 2 and hemeoxygenase-1 protein in kidney tissue cells was detected by western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the model group, the levels of serum creatinine and urea nitrogen and urinary kidney injury molecule 1 were significantly reduced in the asiaticoside group (all P < 0.05). Asiaticoside could also significantly increase the expression of superoxide dismutase (P < 0.05), decrease the expression of malondialdehyde in kidney tissue (P < 0.05), and improve the pathological changes of kidney tissue. Compared with the asiaticoside group, the combined use of asiaticoside and bruceol could increase the levels of serum creatinine and urea nitrogen, urinary kidney injury molecule 1, and malondialdehyde in the kidney tissue, while decrease the level of superoxide dismutase in the kidney tissue (all P < 0.05). Meanwhile, asiaticoside could significantly induce the translocation of nuclear factor E2-related factor 2, and increased the expression level of hemeoxygenase-1. Overall, these findings indicate that asiaticoside can protect against kidney ischemia-reperfusion injury by activating nuclear factor E2-related factor 2/hemeoxygenase-1 pathway.

Key words: asiaticoside, kidney, ischemia-reperfusion injury, brusatol, Nrf2/HO-1 pathway

中图分类号:

朱时玉, 胡彦, 王锁刚, 卢鹏, 王帝, 翟琼瑶, 王光策. 积雪草苷对肾缺血再灌注损伤模型大鼠的保护作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(23): 3609-3614.

Zhu Shiyu, Hu Yan, Wang Suogang, Lu Peng, Wang Di, Zhai Qiongyao, Wang Guangce. Asiaticoside protects the kidney from ischemia-reperfusion injury in a rat model by activating nuclear factor E2-related factor 2/hemeoxygenase-1 pathway[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(23): 3609-3614.

图/表（结果） 8

2.1 实验动物数量分析纳入实验动物数量40只，共4组，进入结果分析39只，积雪草苷+鸦胆子苦醇组于第26天死亡1只，死因为腹腔感染。
2.2 肾功能指标与假手术组相比，肾缺血再灌注损伤组血清中肌酐和尿素氮浓度显著增高，组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)，与肾缺血再灌注损伤组相比，积雪草苷组血清中肌酐和尿素氮浓度均降低，两组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)；抑制剂干预的积雪草苷+鸦胆子苦醇组相对于积雪草苷组，血清中肌酐和尿素氮浓度增高，组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见图1。

2.3 尿液中肾损伤分子1表达与假手术组相比，肾缺血再灌注损伤组尿液中肾损伤分子1表达水平显著增高，组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)；与肾缺血再灌注损伤组相比，积雪草苷组尿液中肾损伤分子1表达水平降低，组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)；抑制剂干预的积雪草苷+鸦胆子苦醇组相对于积雪草苷组，尿液中肾损伤分子1表达水平增加，组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见图2。

2.4 苏木精-伊红染色病理结果及肾损伤评分假手术组大鼠肾小球结构完好，肾小管管腔无扩张，肾小管上皮细胞形态饱满，无变性及坏死情况；与假手术组相比，肾缺血再灌注损伤组大鼠肾小球病变不明显，肾小管管腔扩张，肾小管上皮细胞形态扁平，刷状缘消失，偶见出血及细胞脱落，病变呈弥漫性改变；与肾缺血再灌注损伤组相比，积雪草苷组大鼠肾小球无明显病变，肾小管管腔部分扩张，肾小管上皮细胞部分出现形态扁平及刷状缘消失，病变呈局灶性改变；加用Nrf2抑制剂鸦胆子苦醇的积雪草苷+鸦胆子苦醇组相比于积雪草苷组，肾小管结构损伤加重，肾小管上皮细胞变性更加明显，损伤面积增加，见图3，4。

2.5 免疫组化法检测Nrf2的蛋白表达及分布假手术组肾组织免疫组化切片中Nrf2的表达呈强阳性，均表达于胞质中，轻微核染；相比于假手术组，肾缺血再灌注损伤组肾组织免疫组化切片中Nrf2的表达水平较低，无明显核染；相比于肾缺血再灌注损伤组，积雪草苷组肾组织免疫组化切片中Nrf2的表达水平明显升高，伴明显核染；经过鸦胆子苦醇处理后，相对于积雪草苷组，积雪草苷+鸦胆子苦醇组Nrf2在胞质内的表达明显受到抑制，且向核内的转位也被减弱，说明积雪草苷能促进Nrf2的核内移位，见图5，6。

2.6 超氧化物歧化酶和丙二醛表达水平与假手术组相比，肾缺血再灌注损伤组肾组织匀浆中超氧化物歧化酶表达水平显著降低，组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)；与肾缺血再灌注损伤组相比，积雪草苷组肾组织匀浆中超氧化物歧化酶表达水平升高，组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)；抑制剂干预的积雪草苷+鸦胆子苦醇组相对于积雪草苷组，肾组织匀浆中超氧化物歧化酶表达水平降低，组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)；与假手术组相比，肾缺血再灌注损伤组肾组织匀浆中丙二醛含量显著增高，组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)，与肾缺血再灌注损伤组相比，积雪草苷组肾组织匀浆中丙二醛含量降低，组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)；抑制剂干预的积雪草苷+鸦胆子苦醇组相对于积雪草苷组，肾组织匀浆中丙二醛含量增加，组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见图7。

2.7 Western blot检测肾组织中Nrf2及HO-1的蛋白表达水平与假手术组相比，肾缺血再灌注损伤组肾组织中Nrf2及HO-1的蛋白表达水平明显下降；与肾缺血再灌注损伤组相比，积雪草苷组肾组织中Nrf2及HO-1的蛋白表达水平明显升高；相对于积雪草苷组和肾缺血再灌注损伤组，积雪草苷+鸦胆子苦醇组肾组织中Nrf2及HO-1的蛋白表达水平下降，即在使用Nrf2特异性抑制剂鸦胆子苦醇后，积雪草苷+鸦胆子苦醇组肾组织中积雪草苷上调肾组织中Nrf2及HO-1蛋白表达水平的作用被逆转，见图8。

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引言

肾缺血再灌注损伤是肾脏在遭受缺血缺氧、休克、弥散性血管内凝血、全身炎症反应综合征等病理损害时的急性损伤，常见于肾脏移植、严重创伤、部分肾切除、肾动脉血栓栓塞和败血症等[1]。肾移植术中的肾缺血再灌注损伤仍然是亟待攻克的难题。早期临床表现为急性肾损伤，受损的肾小管上皮细胞通常会导致代谢物异常蓄积，水电解质紊乱，出现水肿、高血压以及出血等临床症状[2]；缺血再灌注损伤若不能及时恢复将导致慢性炎症反应和缺氧，随后出现上皮细胞间充质转化，细胞外基质异常沉积最终导致肾纤维化。此次实验通过经背入式暴露肾蒂后无创动脉夹夹闭双侧肾蒂45 min的方法建立动物肾缺血再灌注损伤模型[3]。核因子E2相关因子2(NF-E2-related factor2，Nrf2)是一种基本的亮氨酸拉链蛋白，可以调节下游抗氧化蛋白的表达，从而预防物理和炎症引起的氧化损伤[4-5]。在正常情况下，Nrf2通过与Kelch样环氧化物相关蛋白1保留在细胞质中[6-7]。氧化应激或亲电应激会破坏Kelch样环氧化物相关蛋白1中的关键半胱氨酸残基，从而将Nrf2转运到细胞核中，其中Nrf2与许多抗氧化基因上游启动子区域的抗氧化反应元件结合并启动其转录[8]。Nrf2的激活可以诱导许多细胞保护性蛋白，例如血红素加氧酶1(hemeoxygenase-1，HO-1)，该酶催化血红素降解成抗氧化剂抗炎剂一氧化碳和亚铁[9]，因此Nrf2/HO-1通路激活对缺血再灌注损伤有重要的保护作用，已成为肾脏疾病治疗和预防肾脏移植过程中肾脏损伤的重要潜在靶点[10-11]。
中药积雪草是伞形科植物积雪草的干燥全草，积雪草苷是从中药积雪草中提取的有效提取物，具有促进创伤愈合的作用，常用于治疗外伤、手术创伤、烧伤、瘢痕疙瘩及硬皮病等[12-13]。鸦胆子苦醇作为Nrf2的特异性抑制剂，能有效阻止Nrf2与Kelch样环氧化物相关蛋白1在细胞质中的解耦联而使Nrf2的表达减少[14]。指标选择方面，作者选择了可以直接反映肾小管损伤严重程度的肾损伤分子1，以及能反映肾组织氧化应激水平的超氧化物歧化酶和丙二醛，其中超氧化物歧化酶活性与肾组织的损伤严重程度呈负相关；丙二醛参与鼠肾缺血再灌注损伤的早期发展，与肾组织的损伤严重程度呈正相关。此次实验通过肾缺血再灌注损伤大鼠模型研究积雪草苷对缺血再灌注损伤的保护作用，探究其是否通过Nrf2/HO-1通路发挥作用。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计完全随机设计，多组比较的动物实验，组间差异比较采用t检验；多组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，组间两两比较采用多重比较LSD检验。
1.2 时间及地点实验于2020年8-12月在河南省中医院中心实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 SPF级SD大鼠40只，6-8周龄，均为雄性，体质量(200±30) g，购于郑州市华兴实验动物养殖场，许可证号：SYXK(豫)2016-0002。标准SPF级饲料饲养，自由饮水，饲养条件为室温20-25 ℃，相对湿度45%-70%，保持通风。此次研究经河南省中医院实验动物福利伦理委员会批准同意，批准文号：PZ-HNSZYY-2019-015，且实验研究操作严格遵循3R原则。
1.3.2 药品与试剂积雪草苷片购于上海现代制药股份有限公司(6 mg/片，国药准字：Z20054146)；戊巴比妥钠(20 mg/kg，上海新亚洲制药有限公司，国药准字：H31020375)；肌酐、尿素氮、丙二醛测定试剂盒均购于南京建成生物工程研究所；肾损伤分子1、超氧化物歧化酶ELISA试剂盒均购于江苏酶免实业有限公司；鸦胆子苦醇、苏木精-伊红染色试剂盒、乙二胺四乙酸抗原修复液、封闭山羊血清、DAB显色试剂盒、RIPA高效组织/细胞裂解液均购于北京索莱宝科技有限公司；BCA蛋白定量试剂盒购于杭州碧云天生物科技有限公司；蛋白电泳凝胶制备试剂盒购于陕西中晖赫彩生物医药科技有限公司；兔抗鼠Nrf2 antibody、兔抗鼠HO-1 antibody、兔抗鼠β-actin antibody均购于美国GeneTex公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔抗体购于美国Bioworld Technology公司。
1.3.3 仪器 HD-300型生物组织智能脱水机、HD-310型生物组织自动包埋机、HD-330摊片烤片机、HD-330型生物切片机，湖北慧达仪器有限公司；1645050型Western Blot电泳仪、Mini TransBlot 17型Western Blot 转膜仪、Mini PROTEAN型SDSPAGE 凝胶系统、ChemiDoc XRS+型Western Blot 成像系统，美国Bio-Rad公司。
1.4 实验方法
1.4.1 动物分组、给药根据随机数字表法将40只大鼠分为4组，分别为假手术组、肾缺血再灌注损伤组、积雪草苷组及积雪草苷+鸦胆子苦醇组，每组10只。适应性饲养1周后，行预防性连续灌胃28 d，每日将53.3片积雪草苷研磨后溶于生理盐水中配制成40 mL质量浓度为8 g/L的积雪草苷混悬液，积雪草苷组和积雪草苷+鸦胆子苦醇组大鼠灌胃量为10 mL/kg积雪草苷混悬液即80 mg/kg积雪草苷片，每天灌胃1次，其浓度及等效剂量按人和动物间体表面积比值表折算；假手术组和肾缺血再灌注损伤组灌胃等量生理盐水。积雪草苷+鸦胆子苦醇组在灌胃第24天开始连续腹腔注射5 d配制好的鸦胆子苦醇混悬液2 mg/(kg•d)。
1.4.2 动物模型建立及取材积雪草苷灌胃28 d后造模，大鼠完全麻醉(1%戊巴比妥钠腹腔注射，5 mL/kg)后，以俯卧位用橡皮筋将大鼠四肢固定于鼠板四角，用小型动物脱毛器备皮，消毒后铺巾，皮层取腰背部正中切口，肌层则选择肋缘下距脊柱1 cm处双侧切口，切口长约1.5 cm，一手托起左肾区，向上挤出左肾至背部切口处，游离左侧肾蒂，右侧同左侧操作；假手术组以假手术代替肾缺血再灌注损伤，只行手术后分离肾蒂，不对其进行夹闭处理；肾缺血再灌注损伤组、积雪草苷组、积雪草苷+鸦胆子苦醇组术中使用无创动脉夹夹闭双侧肾蒂，肾脏由鲜红色变为暗红色，提示肾脏缺血成功，过程中要注意保暖，计时45 min后取下无创动脉夹，完成缺血再灌注损伤模型建立。再灌注后置于代谢笼中，24 h后麻醉(1%戊巴比妥钠腹腔注射，5 mL/kg)取材。
1.5 主要观察指标
1.5.1 血清生化指标的检测取大鼠下腔静脉血静置1 h后3 000 r/min离心15 min，取上层血清，分装存储于-80 ℃备用。肌酐采取肌氨酸氧化酶法按试剂盒说明书步骤操作测定；尿素氮采取脲酶法按试剂盒说明书步骤操作测定。
1.5.2 尿液生化指标的检测于缺血再灌注损伤24 h后，将代谢笼中收集的大鼠尿液转移入2 mL无菌离心管中，置于离心机中以3 000 r/min离心20 min。大鼠尿液中肾损伤分子1按ELISA试剂盒说明书步骤操作测定。

1.5.3 肾组织病理检查将含有肾组织切片的玻片架依次放入二甲苯(Ⅰ)、二甲苯(Ⅱ)、无水乙醇中浸泡；擦干切片上组织周围的水分，吸取苏木精染液约50 μL滴加于每张切片的组织上，保证染色15 min后自来水冲掉；分化液分化30 s，置于50 ℃温水中浸泡5 min；吸取伊红染液约50 μL滴加于每张切片的组织上染色45 s，自来水冲掉，然后在自来水中浸泡5 min；脱水透明；滴加中性树胶到组织上，盖盖玻片时从一侧放下，避免气泡产生，吹风过夜，显微镜下观察。找3名病理专业实验员对每张病理切片进行盲审评分：正常肾脏记0分；仅有少量组织受损(损伤面积范围<5%)记1分；轻度损伤(损伤面积范围5%-25%)记2分；中度损伤(损伤面积范围25%-75%)记3分；重度损伤(损伤面积范围>75%)记4分。

1.5.4 免疫组织化学(SP法)检测肾组织中Nrf2的表达肾组织石蜡切片经常规脱蜡、水化，体积分数3%的H2O2灭活内源性过氧化酶，加入乙二胺四乙酸并煮沸法进行修复抗原，血清封闭后依次加入一抗、辣根过氧化酶标记的二抗。DAB显色，苏木精复染。在高倍镜下，细胞质或胞核内出现棕褐色颗粒为阳性信号，利用Image J软件检测每张图片的平均吸光度值并进行统计分析。
1.5.5 肾组织生化指标检测称取适量的肾组织，加入9倍(质量体积比)冰冷的生理盐水，剪碎，冰上研磨匀浆，12 000 r/min低温离心10 min，制成10%的肾组织匀浆。丙二醛采用硫代巴比妥酸法按试剂盒说明书步骤操作测定，根据ELISA试剂盒操作步骤测定超氧化物歧化酶活性。
1.5.6 Western blot检测肾组织中Nrf2及HO-1的蛋白表达水平取约50 mg肾组织，加入约200 μL RIPA蛋白裂解液后于组织研磨器中研磨，后于冰上裂解，BCA法测定蛋白浓度后将浓度配平。每份样本取约50 μg蛋白进行Western-blot 检测，将蛋白样本加入SDS-聚丙烯酰胺凝胶的点样槽内，进行垂直电泳、电转膜后蛋白质转移至PVDF膜上，剪取所需条带范围，室温下摇床封闭(TBST+5%脱脂奶粉)2 h，加入一抗(兔抗鼠Nrf2抗体1∶500稀释；兔抗鼠HO-1抗体1∶500稀释)4 ℃过夜，洗膜后加入辣根过氧化物酶二抗(1∶1 000稀释)室温孵育2 h，再次洗膜后ECL显影，在凝胶成像系统下曝光拍照；对各组条带灰度值进行分析。
1.6 统计学分析采用SPSS 21.0版统计软件分析，计量资料以x±s表示，经正态性检验符合正态分布后，两组间差异比较采用t检验；多组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，组间两两比较采用多重比较LSD检验，以P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

此次研究证实了缺血再灌注损伤使Nrf2和HO-1的表达水平降低，有研究证实正常肾脏灌注中稳定的层流血液能激活Nrf2的表达，而肾缺血过程中该稳定的层流血液条件消失，且恢复血流后肾组织间血管因损伤而未能恢复层流，该机制可能为Nrf2、HO-1以及其下游抗氧化蛋白超氧化物歧化酶表达水平下降的主要原因[15]，在使用积雪草苷进行预干预后上述蛋白表达水平均升高。积雪草苷+鸦胆子苦醇组为积雪草苷联合使用Nrf2抑制剂鸦胆子苦醇，发现鸦胆子苦醇能逆转积雪草苷升高的Nrf2/HO-1和超氧化物歧化酶表达水平及肾功能和尿液中肾损伤分子1的表达水平也证明了这一点。同时，在此次实验造模成功的基础上，苏木精-伊红染色病理切片中可以观察到积雪草苷组的病理损伤程度相对于肾缺血再灌注损伤组也明显减轻；应用了抑制剂的积雪草苷+鸦胆子苦醇组相对于积雪草苷组的病理损伤程度有一定程度的加重，验证了该通路对缺血再灌注损伤有着明确的保护作用；在免疫组化切片中积雪草苷组的Nrf2蛋白表达水平明显升高，而且出现了Nrf2的核内移位表达；Nrf2抑制剂鸦胆子苦醇的使用也减少了胞质中Nrf2的表达和核内移位。
Nrf2进入细胞核后与抗氧化反应元件结合，主要诱导的抗氧化酶即为HO-1，哺乳动物体内血红素代谢也主要依靠HO-1，经过HO-1代谢后的血红素可以产生游离铁、一氧化碳和胆绿素等多种物质，它们的主要作用包括提高细胞存活率、保证细胞的正常物质代谢及调节细胞免疫功能[16]；其中游离铁和胆绿素具有清除自由基、抑制细胞凋亡的能力，一氧化碳能抑制血小板聚集和白细胞黏附、促进血流、增加肾小球滤过率。此外，Nrf2的激活还可以应对各种有害攻击，增加下游抗氧化剂包括超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽和谷胱甘肽过氧化物酶的表达，使细胞微环境保持稳定[17]。孙光涛等[18]对癫痫模型大鼠的研究发现，己酮可可碱能提升大鼠脑组织内Nrf2、HO-1和磷酸酰胺腺嘌呤二核苷酸醌氧化还原酶1的蛋白表达水平，减轻氧化应激指标水平和癫痫发作频率。另有研究表明，Nrf2和HO-1在肝缺血再灌注损伤中也起着至关重要的作用，诱导Nrf2和HO-1的激活能明显上调抗氧化酶的表达，下调肝脏在缺血再灌注损伤过程中的细胞氧化应激标志物[19]；且有证据支持HO-1的缺乏会导致全身炎症反应综合征、自身免疫性溶血和急性肾小管间质性肾炎等疾病[20]。缺血、缺氧、脂多糖注射和预缺血处理等均可以激活肾脏中HO-1的表达，被激活的HO-1能有效发挥作用并防止肾脏再受到进一步伤害，这意味着HO-1的激活可能是预防肾缺血再灌注损伤的一项潜在分子治疗靶点[21]。黄新宇等[22]的研究发现白藜芦醇预处理对大鼠缺血再灌注损伤具有保护作用，能够显著改善大鼠心脏功能，降低心肌梗死面积，增加超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶表达，降低丙二醛表达，机制可能与Nrf2/HO-1信号通路的激活有关。基础研究表明，氧化应激是慢性肾脏疾病及其相关并发症的主要致病和加重因素。近年来，一些天然化合物被证明通过激活Nrf2和增加下游抗氧化剂的表达，而具有对抗氧化应激的保护作用[23-29]。
此次研究证实，积雪草苷可以通过激活Nrf2/HO-1信号通路，并调节下游抗氧化酶超氧化物歧化酶来对抗细胞氧化应激损伤，进而发挥对肾缺血再灌注损伤的保护作用，机体表现为改善肾功能、降低尿液中肾损伤分子1的表达、改善肾脏病理、增加Nrf2和HO-1的表达及Nrf2的核内移位，此次实验为临床防治缺血再灌注损伤提供了新的依据和治疗靶点。作者所在课题组前期研究发现在肾缺血再灌注损伤中，积雪草颗粒能通过PI3K/AKT/mTOR信号通路发挥改善肾功能、抑制肾脏细胞凋亡的作用；同期研究还发现积雪草苷能通过调节SIRT1/FOXO3/PINK1-Parkin信号通路改善肾缺血再灌注损伤模型大鼠的线粒体自噬情况；研究证实积雪草及其制剂、提取物等可以通过以上通路发挥作用，但其具体的上下游机制以及是否还有其他途径，仍需要进一步研究探查。下一步将通过SIRT3/核因子κB/NLRP3信号通路，应用嗜中性粒细胞染色、检测炎症因子等方面来检验积雪草苷在抑制炎症反应过程中的作用，以便从炎症、氧化应激、自噬和凋亡等多方面论证积雪草苷在保护肾脏免受缺血再灌注损伤中具体发挥的功效以及作用机制。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

积雪草苷对肾缺血再灌注损伤模型大鼠的保护作用

Asiaticoside protects the kidney from ischemia-reperfusion injury in a rat model by activating nuclear factor E2-related factor 2/hemeoxygenase-1 pathway

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