凋亡相关斑点样蛋白寡聚阻断剂对小鼠脊髓损伤急性期局部基因转录表达影响的转录组分析

doi:10.12307/2022.659

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (23): 3620-3632.doi: 10.12307/2022.659

• 组织构建细胞学实验 cytology experiments in tissue construction • 上一篇下一篇

凋亡相关斑点样蛋白寡聚阻断剂对小鼠脊髓损伤急性期局部基因转录表达影响的转录组分析

李璟璐1，2，王赛男1，2，3，王阳阳1，2，3，付贵强1，2，3，王颖2，胡建国1，2，唐洁1，3，吕合作1，2，3

1蚌埠医学院第一附属医院检验科，安徽省蚌埠市 233004；2蚌埠医学院组织移植安徽省重点实验室，安徽省蚌埠市 233000；3蚌埠医学院免疫学教研室，安徽省蚌埠市 233000

收稿日期:2021-05-20 接受日期:2021-07-21 出版日期:2022-08-18 发布日期:2022-02-15
通讯作者: 吕合作，博士，硕士生导师，蚌埠医学院第一附属医院检验科，安徽省蚌埠市 233004；蚌埠医学组院织移植安徽省重点实验室，安徽省蚌埠市 233000；蚌埠医学院免疫学教研室，安徽省蚌埠市 233000
作者简介:李璟璐，女，1994年生，江苏省丰县人，汉族，蚌埠医学院在读硕士，主要从事脊髓损伤的研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81772321)，项目负责人：吕合作；蚌埠医学院首批“512人才培养计划”项目(51201109)，项目负责人：吕合作

CRID3, a blocker of apoptosis-associated speck-like protein containing a card, influences local gene transcription in mice with acute spinal cord injury: a transcriptomic analysis

Li Jinglu1, 2, Wang Sainan1, 2, 3, Wang Yangyang1, 2, 3, Fu Guiqiang1, 2, 3, Wang Ying2, Hu Jianguo1, 2, Tang Jie1, 3, Lyu Hezuo1, 2, 3

1Clinical Laboratory, the First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College, Bengbu 233004, Anhui Province, China; 2Key Laboratory of Tissue Transplantation, 3Department of Immunology, Bengbu Medical College, Bengbu 233000, Anhui Province, China

Received:2021-05-20 Accepted:2021-07-21 Online:2022-08-18 Published:2022-02-15
Contact: Lyu Hezuo, MD, Master candidate, Clinical Laboratory, the First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College, Bengbu 233004, Anhui Province, China; Key Laboratory of Tissue Transplantation, Bengbu Medical College, Bengbu 233000, Anhui Province, China; Department of Immunology, Bengbu Medical College, Bengbu 233000, Anhui Province, China
About author:Li Jinglu, Master candidate, Clinical Laboratory, the First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College, Bengbu 233004, Anhui Province, China; Key Laboratory of Tissue Transplantation, Bengbu Medical College, Bengbu 233000, Anhui Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81772321(to LHZ); the First-batch “512 Talent Training Program” of Bengbu Medical College, No. 51201109 (to LHZ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
CRID3：又称CP-456 773、MCC 950，目前尚无中文名称，是一种特异性的凋亡相关斑点样蛋白(Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)寡聚阻断剂，它可以通过抑制凋亡相关斑点样蛋白寡聚化抑制炎症小体的活化和相应细胞因子的产生。脊髓损伤后炎症小体活化，凋亡相关斑点样蛋白是炎性小体共有的接头蛋白，CRID3可以通过阻断凋亡相关斑点样蛋白，从而治疗脊髓损伤。
转录组测序：其研究对象是某一特定功能状态下的细胞，检测该细胞所能转录出来的所有RNA的总和，能够全面快速地检测某一组织或器官在某一特定状态下所有转录本的序列信息。

背景：炎症小体在脊髓损伤后发挥重要作用，凋亡相关斑点样蛋白是炎症小体的共同接头蛋白。作者前期的研究表明，一种特异性的凋亡相关斑点样蛋白寡聚阻断剂CRID3，可以通过抑制凋亡相关斑点样蛋白寡聚化而抑制炎症小体的活化和相应细胞因子的产生，进而改善损伤脊髓局部微环境，发挥神经保护作用。但是其在转录水平对损伤脊髓的影响尚未见报道。
目的：采用转录组测序技术分析CRID3对小鼠脊髓损伤急性期(8 h)局部基因转录表达的影响。
方法：共取雌性8周龄C57BL/6小鼠30只，体质量18-20 g，随机分为假手术组和脊髓损伤组，将脊髓损伤后的小鼠分为模型对照组和给药组，给药组术后腹腔注射CRID3(50 mg/kg)，对照组只注射等体积的生理盐水。脊髓损伤后8 h，每组各灌注取材3只小鼠，取脊髓冰冻切片进行苏木精-伊红染色，确定损伤模型是否成功。损伤后8 h每组各取3只小鼠，取脊髓提取纯化总RNA，进行文库制备和转录组测序，用DESeq2软件分析3组模型的差异基因表达。同转录组测序，模型对照组和给药组各取6只小鼠脊髓提取纯化总RNA，采用反转录实时定量PCR方法验证转录组测序结果。用GOseq R软件和KOBAS软件对差异基因分别进行基因本体分析和京都基因与基因组百科全书富集分析；结合文献挖掘与炎症小体相关的信号通路、深入分析CRID3对其相关基因表达的影响；与CRID3作用相关的基因表达蛋白String互作分析。
结果与结论：①苏木精-伊红染色结果表明脊髓损伤模型构建成功；②转录组测序结果分析显示，与假手术组比较，模型对照组有5 661个差异表达基因，其中包括3 427个上调和2 224个下调基因；与模型对照组比较，给药组有2 924个差异表达基因，其中包含1 409个上调基因和1 515个下调基因；③基因本体分析结果表明，差异表达的基因主要富含趋化因子受体结合、G-蛋白偶联受体结合、细胞外-谷氨酸门控离子通道活性、兴奋性胞外配体门控离子通道活性、跨膜转运蛋白活性、酸性磷酸酶活性等；④京都基因与基因组百科全书分析结合文献挖掘表明，与炎症小体相关的信号通路主要包括肿瘤坏死因子、Toll样受体、核因子κB、PI3K-Akt、缺氧诱导因子1、MAPK、NOD-样受体信号通路以及细胞焦亡、白细胞跨内皮迁移、细胞因子与其受体相互作用等；⑤CRID3最敏感的基因包括Asc、Casp4、Cyba、Cybb、F11r、Hif1a、Il18、Il1b、Itgal、Itgam、Itgb2、Jam3、Mmp3、Mmp9、Tlr4等；⑥String蛋白互作分析表明炎症小体组成成分Nlrp1、Nlrp3、Nlrp6、Nlrc4、Aim2、ASC、Csap1和Csap4相互作用密切，并且它们又通过Csap8与白细胞介素1β、白细胞介素18形成完整的链接；此外还有一些重要的节点蛋白，如Actn1、Cxcl5、Cd14、Cyba、Cybb、Fgf2、Hif1a、F11r、Itgal、Itga2b、Itgam、Itgb1、Jam3、Mmp3、Tlr4等被确定；⑦结果表明，脊髓损伤后可以激活大量与炎症小体活化相关的基因表达，这些表达基因形成的信号通路可能是炎症小体活化的原因也可能是其活化的结果；CRID3可以通过抑制炎症小体相关基因的表达直接或间接导致脊髓损伤急性期基因表达抑制，其相关的分子和信号通路主要与炎症反应、局部缺氧、细胞的黏附、迁移、分化、增殖和凋亡有关，提示在脊髓损伤急性期应用CRID3可改善脊髓损伤局部微环境，这些关键的节点分子也可以作为新的治疗干预靶点。
缩略语：凋亡相关斑点样蛋白：Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC；京都基因与基因组百科全书：Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG；反转录实时定量PCR：reverse transcription quantitative real-time PCR，RT-qPCR

https://orcid.org/0000-0002-3049-8351(李璟璐)；https://orcid.org/0000-0002-3889-835X(吕合作)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 脊髓损伤, CRID3, 小鼠, 转录组测序, 炎症小体

Abstract: BACKGROUND: Inflammasomes play an important role in spinal cord injury. Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD is a common adaptor protein of inflammasome. Our previous studies have shown that CRID3, a specific oligomerization blocker of apoptosis-associated speck-like protein containing a card, can inhibit the activation of inflammasome and the production of corresponding cytokines by inhibiting the oligomerization of apoptosis-associated speck-like protein containing a card, so as to improve the local microenvironment of the injured spinal cord and play a neuroprotective role. However, its effect on spinal cord injury at transcriptional level has not been reported.
OBJECTIVE: To investigate the effect of CRID3 on local gene transcription at acute phase (8 hours) of spinal cord injury in mice by using RNA-sequencing.
METHODS: Thirty female C57BL/6 mice aged 8 weeks and weighing 18-20 g were divided into a sham operation group and a spinal cord injury group. Mice in the spinal cord injury group were randomly subdivided into a control group and a CRID3 administration group. Mice in the CRID3 administration group were intraperitoneally injected with CRID3 (50 mg/kg) after operation, while mice in the control group were injected with an equal volume of physiological saline solution. At 8 hours after spinal cord injury, three mice from each group were perfused, and the spinal cord was taken to make frozen sections that were then stained with hematoxylin-eosin to determine whether the spinal cord injury model was successfully established. Meanwhile, another three mice were selected from each group to taken spinal cord tissue. The total RNA was then extracted and purified for library preparation and RNA-sequencing. The differential gene expression of the three groups was analyzed by DESeq2 software. Another six mice were selected from the control group and the CRID3 administration group, and spinal cord tissue was taken to extract and purify total RNA. The results of RNA-sequencing were verified by real-time quantitative reverse transcription PCR. GOseq R and KOBAS software were used for gene ontology and Kyoto encyclopedia of genes and genomes enrichment analysis of the differentially expressed genes. Based on literature mining, signaling pathways related to inflammasomes were explored, and the effect of CRID3 on the expression level of related genes were further analyzed. String protein-protein interaction analysis was used to detect CRID3-related proteins.
RESULTS AND CONCLUSION: Hematoxylin-eosin staining results showed that the spinal cord injury model was successfully constructed. The results of RNA-sequencing showed that compared with the sham operation group, there were 5 661 differentially expressed genes in the control group, including 3 427 up-regulated genes and 2 224 down-regulated genes. Compared with the control group, 2 924 differentially expressed genes were found in the CRID3 administration group, including 1 409 up-regulated genes and 1 515 down-regulated genes. The results of gene ontology analysis showed that the differentially expressed genes were mainly rich in chemokine receptor binding, G-protein coupled receptor binding, extracellular-glutamate-gated ion channel activity, excitatory extracellular ligand-gated ion channel activity, transmembrane transporter activity, and acid phosphatase activity. Kyoto gene and genome encyclopedia analysis combined with literature mining showed that the signaling pathways related to inflammasome mainly included tumor necrosis factor, Toll-like receptor, nuclear factor‑κB, PI3K-Akt, hypoxia-inducible factor-1, MAPK, NOD-like receptor signaling pathways as well as pyrocytosis, leukocyte transendothelial migration, and interaction between cytokines and receptors. The genes most sensitive to CRID3 included Asc, Casp4, Cyba, Cybb, F11r, Hif1a, Il18, Il1b, Itgal, Itgam, Itgb2, Jam3, Mmp3, Mmp9, and Tlr4. The results of String protein-protein interaction analysis showed that inflammasome components (Nlrp1, Nlrp3, Nlrp6, Nlrc4, Aim2, ASC, Csap1, and Csap4) interacted closely, and they formed a complete link with interleubin 1b and interleubin 18 through Csap8. In addition, some important nodal proteins such as Actn1, Cxcl5, Cd14, Cyba, Cybb, Fgf2, Hif1a, F11r, Itgal, Itga2b, Itgam, Itgb1, Jam3, Mmmp3, and Tlr4 were identified. To conclude, after spinal cord injury, a large number of genes related to inflammasomes can be activated and the signaling pathways formed by these genes may be the cause or result of the activation of inflammasomes. CRID3 can directly or indirectly inhibit gene expression in the acute stage of spinal cord injury by inhibiting the expression of inflammasome-related genes. Its related molecules and signaling pathways are mainly related to inflammatory response, local hypoxia, cell adhesion, migration, differentiation, proliferation and apoptosis. CRID3 can improve the local microenvironment of spinal cord injury in the acute stage, and these key node molecules can also be used as new therapeutic intervention targets.

Key words: spinal cord injury, CRID3, mouse, RNA-sequencing, inflammasome

中图分类号:

李璟璐, 王赛男, 王阳阳, 付贵强, 王颖, 胡建国, 唐洁, 吕合作. 凋亡相关斑点样蛋白寡聚阻断剂对小鼠脊髓损伤急性期局部基因转录表达影响的转录组分析[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(23): 3620-3632.

Li Jinglu, Wang Sainan, Wang Yangyang, Fu Guiqiang, Wang Ying, Hu Jianguo, Tang Jie, Lyu Hezuo. CRID3, a blocker of apoptosis-associated speck-like protein containing a card, influences local gene transcription in mice with acute spinal cord injury: a transcriptomic analysis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(23): 3620-3632.

图/表（结果） 9

2.1 实验动物数量分析选用C57 BL/6雌性小鼠30只，分为3组，全部进入结果分析，无脱失。
2.2 苏木精-伊红染色证明脊髓损伤模型构建成功建模8 h后，对3组脊髓进行冰冻切片，脊髓横切面苏木精-伊红染色结果表明，假手术组脊髓灰质和白质分界清晰，可见典型的“蝴蝶”状灰质以及完整的神经元细胞；而在2个脊髓损伤组(模型对照组和给药组)，脊髓灰质和白质分界不清，没有典型的“蝴蝶”状灰质、几乎看不到完整的神经元细胞，这些都是典型的脊髓损伤表现，虽然给药组和模型对照组没有明显区别，但这足以证明脊髓损伤模型构建成功，见图1。

2.3 转录组基因质量分析和变异源性分析此次实验共建立了9个cDNA文库。通过转录组测序，在每个文库中产生了47 778 906到65 142 330个原始测序序列。过滤掉低质量的序列后，clean序列为47 216 038到64 290 602。为对数据中的变异源进一步阐述，对3个主要成分进行主成分分析。主成分分析常用来评估组间差异及组内样本重复情况，主成分分析采用线性代数的计算方法，对数以万计的基因变量进行降维及主成分提取。主成分1、主成分2和主成分3分别为52.93%，15.17%和7.34%，见图2。同一组的3个样本距离较近，表明变异较低，表明这些数据可以用来进一步分析。

2.4 脊髓损伤和CRID3治疗对小鼠脊髓局部基因表达的影响对3组小鼠的差异表达基因采用DESeq2软件进行分析。火山图结果显示，与假手术组比较，模型对照组有5 661个差异表达基因，其中包含3 427个上调基因和2 224个下调基因，见图3A。与模型对照组比较，给药组有2 924个差异表达基因，其中包含1 409个上调基因和1 515个下调基因，见图3B。

2.5 RT-qPCR验证转录组测序结果为了验证转录组测序结果，从模型对照组和给药组中随机选择9个差异表达的基因，即半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1、白细胞介素1β、irak4、jak3、lcn2、lrg1、p2rx7、stat6和tbx1，采用RT-qPCR进行验证。结果表明，在模型对照组中，这些基因在转录组测序的相对表达量(readcounts)分别为162.00±28.21，1 188.00±528.32，240.00±46.29，859.33±1 34.35，6 015.33±1 085.22，825.33±97.57，523.67±72.67，632.00±172.50和161.67±16.29；其在RT-qPCR检测中的相对表达水平分别为1.23±0.33，1.33±0.42，0.95±0.23，0.82±0.21，1.67±0.88，2.72±1.87，0.79±0.23，0.77±0.26和1.16±0.36。在给药组中，这些基因在转录组测序的相对表达量(readcounts)分别为177.00±29.61，257.33±86.03，150.33±13.58，601.00±143.04，2 051.00±603.76，248.33±71.93，318.33±50.77，343.67±23.07和38.00±8.89；其在RT-qPCR检测中的相对表达水平分别为0.97±0.26，0.59±0.25，0.46±0.03， 0.41±0.08，1.15±0.60，1.59±1.06，0.48±0.15，0.40±0.12和0.37±0.13。整体来看这些差异基因的表达趋势是基本一致的，见图4。

2.6 差异基因的聚类分析采用FPKM层次聚类分析，差异表达基因被分层聚类并分类到不同的表达簇中，包括上调和下调的差异表达基因。与假手术组相比，模型对照组上调的差异基因多位于中下簇；与模型对照组相比，给药组上调的差异表达基因大多位于中上簇，而下调的差异表达基因主要出现在下簇，见图5。

2.7 差异基因基因本体富集分析基因本体数据库把基因的本体分为3种：生物过程、细胞组成和分子功能。差异基因的基因本体富集分析表明，与假手术相比，模型对照组上调的差异基因中有111个有意义的基因本体功能注释(校正后的P < 0.05)，30个最为丰富的功能注释(有28个分子功能、1个生物过程和1个细胞组成)，其中在蛋白结合、核苷酸结合、阴离子结合、趋化因子受体结合、G-蛋白偶联受体结合等方面最为丰富，见图6A；在下调的差异基因中有33个有意义的基因本体功能注释(校正后的P < 0.05)，30个最为丰富的功能注释(有20个分子功能、9个生物过程和1个细胞组成)，其中在蛋白结合、核苷酸结合、阴离子结合、趋化因子受体结合、G-蛋白偶联受体结合等方面最为丰富，见图6B。与模型对照组相比，给药组上调的差异基因有24个有意义的基因本体功能注释(校正后的P < 0.05，包括10个分子功能、7个生物过程和7个细胞组成)，其中在结合、细胞膜内结合、金属离子结合、蛋白质结合、离子结合、阳离子结合等最为丰富，见图6C；下调的差异基因有14个有意义的基因本体功能注释(校正后的P < 0.05，包括5个生物过程和9个细胞组成)，其中在结合、蛋白质结合、序列特异性DNA结合等方面最为丰富，见图6D。

2.8 差异基因的KEGG富集分析差异表达基因的KEGG富集分析表明：与假手术组相比，模型对照组上调的差异基因中富集出39个重要的信号通路(校正后的P < 0.05)，前20个最主要的信号通路见图7A，包括Toll样受体信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、核因子κB信号通路、焦点粘连、细胞凋亡等；下调的差异基因富集出3个重要的信号通路(校正后的P < 0.05)，为谷氨酸能突触、轴突导引、ABC转运蛋白，见图7B。
与模型对照组相比，给药组上调的基因中富集出一条信号通路，即Fanconi anemia pathway(校正后的P < 0.05)，见图7C；下调的差异基因富集出4个重要的信号通路(校正后的P < 0.05)，主要为白细胞跨内皮迁移、缺氧诱导因子1信号通路和焦点粘连，见图7D。

2.9 CRID3对炎症小体活化相关基因表达水平的影响进一步对差异基因及其相关信号通路梳理，可以发现与炎症小体活化相关的信号通路主要包括肿瘤坏死因子、Toll样受体、核因子κB、PI3K-Akt、缺氧诱导因子1、MAPK和NOD-样受体信号通路。另外，炎症小体活化后诱发的信号通路包括细胞焦亡、白细胞跨内皮迁移、细胞因子与其受体相互作用等。这些信号通路中富集的基因在模型对照组的表达均较假手术组呈升高趋势。当给予药物干预后缺氧诱导因子1信号通路和白细胞跨内皮迁移明显被抑制。根据基因表达量(counts)的log2比值，又对上述信号通路相关的一些代表性基因表达水平进行了比较，整理出了57个在脊髓损伤后显著升高，而在给药后又明显降低的基因。根据基因表达水平相对于假手术组的log2比值，在假手术组所有的基因表达水平均为0，脊髓损伤后这些基因表达水平显著上调，当给药后其基因表达水平也相应降低。其中对CRID3最敏感的基因包括Asc、Casp4、Cyba、Cybb、F11r、Hif1a、Il18、Il1b、Itgal、Itgam、Itgb2、Jam3、Mmp3、Mmp9、Tlr4等，见图8。

2.10 String蛋白互作分析结果为了进一步探讨炎症小体组分与CRID3抑制的基因在蛋白水平的相互作用，对炎症小体组分与CRID3抑制的基因表达蛋白，在STRING数据库进行蛋白间相互作用分析，结果见图9，炎症小体组成成分Nlrp1、Nlrp3、Nlrp6、Nlrc4、Aim2、ASC(此数据库命名为Pycard)、Csap1和Csap4相互作用密切，并且它们又通过Csap8与白细胞介素1β、白细胞介素18形成完整的链接。此外，还有一些重要的节点蛋白，如Actn1、Cxcl5、Cd14、Cyba、Cybb、Fgf2、Hif1a、F11r、Itgal、Itga2b、Itgam、Itgb1、Jam3、Mmp3、Tlr4等被确定。

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引言

脊髓损伤是由于各种原因引起的一种严重的神经系统疾病，导致人体运动感觉功能障碍，具有高发病率及高致残率，给患者、家属以及卫生医疗机构带来极大的精神经济负担[1-4]。脊髓损伤后最初几小时组织被破坏，包括细胞缺血性死亡、轴突变性、血管功能障碍、氧化应激、兴奋性毒性、脱髓鞘和炎症等过程，其中炎症是导致损伤的主要原因之一[5-7]。因此，及时控制炎症反应是治疗脊髓损伤的重要策略之一。
炎症小体是一种多组分复合物，其在病原体侵入和组织损伤时，对炎症细胞的反应起着关键性作用[8-10]。炎性小体由胞内模式识别受体、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1等)以及链接两者的凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)组成[11]。当受到内在或外在刺激时，炎症小体可以识别病原相关分子模式和损伤相关分子模式，通过ASC的募集，水解半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1前体为有活性的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1进一步切割白细胞介素1细胞因子家族前体产生有致炎作用的白细胞介素1和白细胞介素18，在脊髓损伤炎症过程中起着关键作用[12-13]。因此，可以以炎症小体为靶点对脊髓损伤的炎症过程进行干预，从而达到抗炎和神经保护的作用。在炎症小体的组成成分方面，可以选择的余地较多。其中，ASC 是炎症小体共用的接头蛋白，前期研究表明CRID3(又称CP-456 773、MCC 950)是一种有效的小分子药物，可以通过抑制ASC 寡聚化抑制炎症小体活化和细胞因子的产生。作者前期的研究表明，CRID3可以通过抑制ASC寡聚化而抑制炎症小体的活化和相应的细胞因子的产生，进而改善损伤脊髓局部微环境，发挥神经保护作用[14]，但是其在转录水平对脊髓损伤局部的影响尚未见报道。因而此次研究采用转录组测序(RNA sequencing，RNA-Seq)技术分析CRID3对小鼠脊髓损伤急性期(8 h)局部基因转录表达的影响，以筛选和鉴定关键分子和信号通路，为脊髓损伤的临床治疗提供新的靶点和实验依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，Benjamini和Hochberg校正分析。
1.2 时间及地点实验于2020年 9月至2021年5月在安徽省蚌埠市蚌埠医学院完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物选用清洁级C57BL/6雌性成年小鼠30只，体质量18-20 g，8周龄，由常州卡文斯实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK(苏)2016-0010。动物实验经过蚌埠医学院伦理委员会批准。实验中所有C57BL/6小鼠外科手术操作及手术后的护理都按照《中国实验动物学会团体标准汇编及实施指南(第三卷)》执行。
1.3.2 实验试剂及仪器
试剂：CRID3(Target molecule公司，美国)；戊巴比妥钠(上海化学试剂采供站)；体积分数75%乙醇(山东利尔康公司)；Trizol(Ambion，英国)；荧光定量PCR管(Biosysterm’s公司，美国)；反转录试剂盒(Thermo公司，美国)；实时荧光定量PCR试剂盒(Takara公司，日本)；引物合成[生工生物工程(上海)股份有限公司]；组织包埋剂(Fisherscientific公司，美国)；伊红染料(Innovative cell techologies公司，中国)；苏木精染料(Innovative cell techologies公司，中国)；无水乙醇(山东利尔康公司)。
仪器：持针器、手术剪、镊子等(上海医疗器械有限公司)；PSI-IH脊髓损伤打击器(Precision Systems and Instrumentation公司，美国)；PCR梯度仪(苏州东胜兴业科学仪器有限公司)；低温高速离心机(Eppendorf公司，德国)；高压灭菌锅(三洋公司)；移液器(Gilson公司，美国)；电泳仪(BIORAD公司，美国)；实时荧光定量PCR仪(Thermo Fisher，美国)；冰冻切片机(Eppendorf公司，中国)；荧光显微镜(Ziess公司，德国)。
1.4 实验方法

1.4.1 脊髓损伤模型制备实验前将小鼠放于温度20-22 ℃、湿度30%-70%的适宜环境中饲养5-7 d。术前将所需手术器械用体积分数75%的乙醇消毒30 min，并用紫外线照射30 min。术中首先用50 mg/kg戊巴比妥腹腔注射麻醉小鼠，然后剔除T9椎板周围的鼠毛，用手术刀划开T9周围的皮肤、筋膜、肌肉，切除T9椎板，使用PSI-IH脊髓损伤仪对小鼠脊髓以500 mN的力进行撞击，形成撞击性脊髓损伤，最后进行手术缝合。术后将小鼠标号分组并放于上述环境中。

1.4.2 动物分组 30只小鼠按随机数字表法分为假手术组(n=6)和脊髓损伤组(n=24)，假手术组只接受椎板切除，不给予撞击。使用配对比较法将脊髓损伤后的小鼠随机分为模型对照组和给药组，每组12只。在上述3组中，每组分别取3只用于组织学检测，3只用于转录组分析；模型对照组和给药组分别取6只进行反转录实时定量PCR(reverse transcription quantitative real-time PCR，RT-qPCR)验证。
1.4.3 试剂配制和给药将粉末状CRID3溶于无菌的0.01 mol/L PBS(pH 7.4)中，配成1 g/L的储存液，分装后保存于-80 ℃备用。脊髓损伤后给药时，给药方式为50 mg/kg腹腔注射，CRID3药物用量参照他人和作者前期的文献报道[18-20]。模型对照组只注射等体积的PBS。
1.4.4 小鼠脊髓分离术后8 h，用50 mg/kg戊巴比妥腹腔注射麻醉小鼠。待小鼠完全麻醉后，用手术剪沿剑突打开胸腔，露出心脏。用微量注射泵，从心脏主动脉灌注10 mL 0.01 mol/L PBS，接着灌注10 mL的40 g/L多聚甲醛溶液，在灌注过程中小鼠四肢和尾巴不停抽搐，肌肉僵硬，表明多聚甲醛灌注成功。取损伤中心前后0.5 cm脊髓(假手术组取相应阶段的脊髓)，移至40 g/L多聚甲醛中浸泡过夜。沉底后，分别置于20%的蔗糖溶液和30%的蔗糖溶液梯度脱水，直至完全沉底。最后用OCT包埋剂包埋，用冰冻切片机将脊髓切为6 μm的冰冻切片。
1.4.5 苏木精-伊红染色用PBS洗涤脊髓冷冻切片上的包埋剂，苏木精室温染色6 min后，用10%的醋酸乙醇分色3 s，然后用50 ℃的自来水返蓝10 min，此过程在水浴箱中进行。接着，在体积分数85%的乙醇中浸泡3 min，用伊红染料染色30 s，分别用体积分数70%，85%，95%，100%的乙醇脱水3 min。最后用二甲苯透明，用中性胶封固后在切片光镜下观察。
1.4.6 脊髓组织总RNA提取与浓度测定术后8 h再次麻醉小鼠，用10 mL的0.01 mol/L PBS进行心脏灌注。取损伤中心前后3 mm(假手术组取相应节段的脊髓)，加0.5 mL Trizol试剂充分研磨，直至溶液中没有明显的脊髓块，变成匀浆为止(整个过程均需要在冰上操作)。将匀浆后的脊髓移入无酶的EP管，冰上放置5 min。随后每0.5 mL的Trizol的加入100 μL氯仿，剧烈震荡15 s，于冰上放置5 min，12 000×g离心15 min。离心后分3层，将上层水相中的RNA移至新的无酶的EP管中，加入异丙醇，轻柔混匀后，在冰上静置15 min。然后12 000×g离心10 min，弃上清，加500 μL的无水乙醇，洗涤管底的RNA沉淀，再以7 500×g，4 ℃离心5 min，弃上清，倒置干燥后加入20 μL DEPC水，用无酶枪头使RNA充分溶解混匀，并于多功能酶标仪检测RNA浓度。
1.4.7 文库制备和转录组测序通过NEB Next Ultra TMRNA Library Prep Kit for Illumina获取测序文库，此次实验委托诺禾致源生物信息科技有限公司完成。
1.4.8 差异基因的表达分析使用RSEM软件分析基因表达统计数，DESeq2软件分析3组小鼠的差异基因。采用Benjamini和Hochberg的校正方法校正P值，调整后的P < 0.05被定义为基因表达显著差异的标准，用火山图展示差异基因的整体分布情况。将所有比较组的差异基因取并集之后作为差异基因集，对差异基因集进行聚类分析，将表达模式相近的基因聚在一起。此次实验采用层次聚类对基因的FPKM(Fragments Per Kilobase per Million)值进行聚类分析，对行(row)进行均一化处理(Z-score)。热图中表达模式相近的基因或样本会被聚集在一起，每个方格中的颜色反映的不是基因表达值，而是表达数据的行进行均一化处理后得到的数值(一般在-2-2之间)，所以热图中的颜色只能横向比较(同一基因在不同样本中的表达情况)，不能纵向比较(同一样本不同基因的表达情况)。
1.4.9 差异基因的基因本体和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析在基因本体分析中，使用GOseq R软件，以校正P < 0.05被认为是差异基因显著富集的标准；在KEGG分析中，使用KOBAS软件进行差异基因的分析，以校正P < 0.05作为显著性富集的阈值。
1.4.10 RT-qPCR 为了验证转录组测序结果的可靠性，采用随机数字表法随机选取9个差异基因，引物序列见表1。采用TRIzol法(同1.4.6)提取纯化模型对照组和给药组各6只小鼠脊髓的总RNA，采用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，采用SYBR Green PCR Master Mix和ABI 7900 PCR检测系统进行实时定量PCR进行验证，用2–∆∆Ct法计算目的基因与内参基因β-actin的相对表达水平。该方法设定目的基因和内参基因的扩增效率是相同的，并且等于1，该方法在双链DNA交联荧光染料(如SYBR Green I)qPCR中应用多见。由于此次实验的主要目的是验证转录组测序结果，只比较它们之间的表达趋势，没有进行统计学分析。转录组测序结果采用基因表达量
(readcounts)进行比较。

1.4.11 结合文献挖掘与炎症小体相关的信号通路、深入分析CRID3对其相关基因表达水平的影响根据差异基因KEGG信号通路分析，结合文献报道[21-31]，首先确定与炎症小体活化相关的信号通路主要包括肿瘤坏死因子、Toll样受体、核因子κB、PI3K-Akt、缺氧诱导因子1、MAPK、NOD-样受体信号通路以及细胞焦亡、白细胞跨内皮迁移、细胞因子与其受体相互作用等。根据基因表达量(readcounts)的log2比值[log2(Sample1/Sample2)，其中Sample1、Sample2分别为校正后样品1和2的readcounts值]，对上述信号通路中的一些代表性基因进行比较，整理出了57个在脊髓损伤后显著升高，而在给药后又明显降低的基因。进一步基于log2比值分析这些基因表达量与假手术组基因表达水平(均为0)的关系。在Excel表中通过列表，选中数据，通过选择“条件格式”“色阶”建成表达量比较热图。假手术组为“0”，其颜色为白色，颜色越红代表表达量越高，颜色越绿代表表达量越低。
1.4.12 与CRID3作用相关的基因表达蛋白String互作分析将1.4.11中整理出的57个基因表达的蛋白，加上炎症小体的常见相关组分NLRP1、NLRP3、NLRP6、NLRC4、AIM2、ASC、CSAP1、CSAP4、CSAP8、CSAP12、白细胞介素1β和白细胞介素18进行String蛋白互作分析(https://www.string-db.org/)。具体条件设置如下：Network type为“physical network”；meaning of network edges为“evidence”，minimum required interaction score为0.4，其他设置为默认。结果以网络图片的方式表达，找出关键的相互作用节点蛋白。
1.5 主要观察指标及统计学分析
1.5.1 测序数据质量评估去除带接头(adapter)、含N(N表示无法确定碱基信息)和低质量reads(Q ≤ 20的碱基数占整个read长度50%以上的 reads)获得clean reads。
1.5.2 转录组基因变异源性分析为对数据中的变异源进一步阐述，对3个主要成分进行主成分分析。
1.5.3 差异基因的表达分析使用RSEM软件分析基因表达统计数，使用DESeq2软件分析差异基因。采用Benjamini和Hochberg的校正方法校正P值，调整后的P < 0.05被定义为基因表达显著差异的标准。用火山图展示差异基因的整体分布情况，用聚类图判断差异基因在不同实验条件下的表达模式。
1.5.4 基因本体富集分析使用GOseq R软件，以校正P < 0.05被认为是差异基因显著富集的标准。差异基因采用基因本体富集柱状图，直观反映出在生物过程、细胞组分和分子功能富集的GO term上差异基因的分布情况。
1.5.5 KEGG富集分析使用KOBAS软件进行差异基因的分析，以校正P < 0.05作为显著性富集的阈值。KEGG富集分析结果采用散点图展示，KEGG富集程度通过Rich factor、Q value和富集到此通路上的基因个数来衡量。其中Rich factor指该pathway中富集到的差异基因个数(Sample number)与注释基因个数(Background number)的比值，Rich factor越大，表示富集的程度越大；Q value是做过多重假设检验校正之后的P value，Q value的取值范围为[0，1]，越接近于零，表示富集越显著。
1.5.6 RT-qPCR验证转录组测序结果在RT-qPCR中用2–∆∆Ct法计算目的基因与内参基因β-actin的相对表达水平，转录组测序结果采用基因表达量(readcounts)进行展示。由于此次实验的主要目的是验证转录组测序结果，只比较它们之间的表达趋势，没有进行统计学分析。引物序列见表1。
1.5.7 差异表达基因数据挖掘分析基于log2(比值)分析这些基因的表达量。
1.5.8 String互作分析根据分析结果，找出关键的相互作用节点蛋白。

讨论

导致脊髓损伤的因素多以创伤为主，最常见的原因是交通事故，其次是坠落、暴力和运动意外，因而大部分患者为30岁以下的年轻人[1-4]。在此次研究中选用2月龄的雌性小鼠，其原因有二：一是2个月的小鼠达到成年，相当于人的青壮年期，这也是脊髓损伤高发的年龄段；二是选用雌性小鼠的主要目的是为了验证作者以前的实验结果[14]，并进一步在转录组水平探讨其分子机制。
为了证明脊髓损伤模型是成功的，作者对3组脊髓切片进行染色，脊髓横切面苏木精-红染色结果表明，没有损伤的脊髓灰质和白质分界清晰，可见典型的“蝴蝶”状灰质以及完整的神经元细胞；而损伤的脊髓灰质和白质分界不清，没有典型的“蝴蝶”状灰质、几乎看不到完整的神经元细胞。这些都是典型的脊髓损伤表现，这表明脊髓损伤模型构建成功，可以用于下一步的转录组测序分析。
转录组测序分析结果表明，与假手术组比较，模型对照组有5 661个差异基因，其中包括3 427个上调基因和2 224个下调基因，这与前期的报道是基本一致的[32-33]，表明此次实验结果是可靠的。与模型对照组比较，给药组有2 924个差异基因，其中包括1 409个上调基因和1 515个下调基因。为了进一步验证转录组测序结果，作者采用随机数字表达法随机选择了9个差异表达基因用RT-qPCR进行验证，结果再次证明转录组测序结果是可靠的，可以用于后续的分析，这也证实了CRID3可以改变脊髓损伤后急性期的基因转录。
为了进一步具体分析CRID3对差异表达基因的影响，作者采用基因本体富集分析和KEGG通路分析研究差异基因的表达模式。结果表明，与假手术组相比，模型对照组上调的差异基因在蛋白结合、核苷酸结合、阴离子结合、趋化因子受体结合、G-蛋白偶联受体结合等最为丰富；下调的差异基因在蛋白质结合、结合、细胞外-谷氨酸门控离子通道活性、兴奋性胞外配体门控离子通道活性、转运蛋白活性、跨膜转运蛋白活性、酸性磷酸酶活性、离子结合等方面最为丰富。这与前期的报道也是基本一致的[32-33]。与模型对照组相比，给药组上调的差异基因在结合、细胞膜内结合、金属离子结合、蛋白质结合、离子结合、阳离子结合等最为丰富；下调的差异基因在结合、蛋白质结合、序列特异性DNA结合等最为丰富。
KEGG分析结果表明，与假手术组相比，上调的差异基因中富集的信号通路主要为Toll样受体信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、核因子κB信号通路、焦点粘连、细胞凋亡等；下调的差异基因中富集的信号通路主要为谷氨酸能突触、轴突导引、ABC转运蛋白，这与前期的报道也是基本一致的[32-33]。与模型对照组相比，给药组中上调的差异基因中高表达的基因只有一条显著的富集通路，即Fanconi anemia pathway。下调的差异基因中富集的信号通路主要为白细胞跨内皮迁移、缺氧诱导因子1信号通路、焦点粘连等。
在这些信号通路中，已经有部分信号通路用于脊髓损伤的治疗研究中，如缺氧诱导因子1信号通路[34-36]、焦点粘连[37-38]，可以根据这些富集的信号通路表达出重要的相关生物信息，从而更深入地研究脊髓损伤后的相关病理生理过程。另外，机体受到刺激或损伤时，白细胞通过激活的小静脉壁迁移至感染和损伤部位，减轻炎症反应和促进组织修复[39-40]，此次实验中研究的白细胞跨内皮迁移途径与其密不可分。CRID3药物治疗后，白细胞跨内皮迁移途径下调，证明CRID3药物可以抑制外周血白细胞向脊髓损伤部位迁移和浸润，进而改善炎症反应。
缺氧诱导因子1信号通路中的缺氧诱导因子1α是一种在缺氧条件下被激活的特异性转录因子，主要调控缺氧相关的信号通路[41-42]。脊髓损伤后免疫细胞聚集在炎症部位，留下快速缺氧的环境，进而导致免疫细胞表达缺氧诱导因子1α。此次研究表明CRID3治疗可以抑制缺氧诱导因子1信号通路，表明CRID3改善了脊髓损伤的局部缺氧环境。
焦点粘连是一种大型的蛋白复合物(包括细胞骨架、结构、支架蛋白、调控、信号传导、机械传感等)，位于细胞基底表面，它连接细胞外基质和细胞骨架，介导细胞迁移[43-46]。脊髓损伤后，通过CRID3药物治疗，灶性黏附下降，提示CRID3可以通过抑制细胞的黏附、迁移、分化、增殖和凋亡来改善脊髓损伤局部微环境。
为了进一步细化，特别是对转录组学研究结果的具体内容进行分析，作者又对差异基因进行了梳理，以找到主要变化的基因及其通路，特别是对炎症小体相关的调控基因及其变化通路和具体的机制。通过进一步挖掘，并参考相关文献报道，可以推测与炎症小体活化相关的信号通路主要包括肿瘤坏死因子、Toll样受体、核因子κB、PI3K-Akt、缺氧诱导因子1、MAPK和NOD-样受体信号通路等[18-25]。另外，炎症小体活化后诱发的信号通路可能包括细胞焦亡、白细胞跨内皮迁移、细胞因子与其受体相互作用等[26-28]。为了证实上述推测，根据基因表达量(counts)的log2比值，对上述信号通路相关的一些代表性基因表达水平进行了比较，结果整理出了57个在脊髓损伤后显著升高，而在给药后又明显降低的基因。其中对CRID3最敏感的基因包括Asc、Casp4、Cyba、Cybb、F11r、Hif1a、白细胞介素18、白细胞介素1β、Itgal、Itgam、Itgb2、Jam3、Mmp3、Mmp9、Tlr4等，在这些基因中，Asc是炎症小体的接头蛋白，也是CRID3直接作用的靶点，Casp4、白细胞介素18和白细胞介素1β则是炎症小体信号通路中的重要成分[26]，这表明脊髓损伤后CRID3确实能够抑制损伤脊髓局部炎症小体的活化，这与作者前期的报道也是一致的[13，47]。另外，Cyba和Cybb分别为细胞色素b-245的轻链和重链，是吞噬细胞膜结合氧化酶的关键成分，能够产生超氧化物，与NOX3结合形成功能性NADPH氧化酶，组成性产生超氧化物[48]，而脊髓损伤后的过氧化压力及其产生的超氧化物正是脊髓急性期损伤的重要病理机制之一[49]，因此CRID3可能通过抑制炎症小体的活化进而抑制脊髓损伤后的过氧化应激。F11r为连接黏附分子A，属于免疫球蛋白超家族，在上皮紧密连接形成中起重要作用，参与调节上皮屏障的完整性，进而影响单核细胞、记忆性T细胞和中性粒细胞迁移[50]。F11r在脊髓损伤中的作用尚未见报道，此次报道中发现脊髓损伤后F11r显著升高，CRID3药物治疗后其表达量明显降低，结合KEGG信号通路分析中CRID3可以抑制白细胞跨内皮迁移，提示CRID3可能通过抑制炎症小体的活化进而抑制单核细胞、T细胞和中性粒细胞等向脊髓损伤部位的浸润，从而改善损伤局部免疫微环境。Hif1a为缺氧诱导因子1α，是缺氧适应性反应的主要转录调节因子发挥作用。在缺氧条件下，能够激活40多个基因的转录，包括促红细胞生成素、葡萄糖转运蛋白、糖酵解酶、血管内皮生长因子、HILPDA等，其蛋白产物能够通过增加氧气输送或促进新陈代谢以适应缺氧环境，在肿瘤血管生成和缺血性疾病的病理生理中起着重要作用[51-52]。关于Hif1a在脊髓损伤中的报道有很多，2002年就有报道认为Hif1a可能参与脊髓损伤后继发性缺血缺氧过程，并可能介导损伤性细胞凋亡[53]，随后又有报道认为Hif1a参与过氧化应激、缺氧诱导小胶质细胞自噬性死亡等[54-55]。
在此次报道中，证实脊髓损伤后Hif1a基因表达显著增高，并且CRID3应用可以显著降低其表达，KEGG分析也显示CRID3可以抑制脊髓损伤导致的缺氧诱导因子1信号通路，提示CRID3可以发挥抗氧化应激、抗自噬、抗凋亡等作用。Itgal和Itgb2是淋巴细胞功能相关抗原1的2个亚单位，其形成的异二聚体整合素是ICAM1、ICAM2、ICAM3和ICAM4的受体，参与白细胞-内皮细胞相互作用、细胞毒性T细胞介导的杀伤、粒细胞和单核细胞抗体依赖性杀伤等多种免疫现象[56]。Itgam为整合素α-M，它可以与Itgb2形成二聚体参与单核细胞、巨噬细胞和粒细胞的各种黏附相互作用以及介导补体包被颗粒的摄取[57]。Jam3为连接黏附分子C，参与细胞间黏附，调节白细胞的跨上皮迁移[58]。其实，Itgal、Itgb2、Itgam和Jam3都属于细胞黏附分子，其功能也比较相似，均参与疾病的炎症过程。目前，有一篇关于Itgal在脊髓损伤后表达升高的相关报道[59]，有2篇关于Itgb2表达升高的相关报道[60-61]，有2篇关于Itgam表达升高的相关报道[62-63]，但是，关于Jam3在脊髓损伤中的表达尚未见报道，另外CRID3对这些基因表达的影响均未见报道。此次实验中证明CRID3药物治疗后其表达量明显降低，提示CRID3可能通过抑制这些细胞黏附分子表达进而抑制局部炎症应答。Mmp3和Mmp9属于基质金属蛋白酶家族，是一种锌依赖性内肽酶，最早被发现是一种以细胞外蛋白为靶点的蛋白酶，它们参与多种疾病的发病机制，如心血管肾脏疾病、炎症和恶性肿瘤等[64]。关于基质金属蛋白酶家族在脊髓损伤中的报道比较多，2000年就有报道它们在脊髓损伤后表达显著升高[65]。随后又有报道认为它们能够促进脊髓损伤后早期血脊髓屏障破坏和出血，损害长期神经功能恢复[66-67]。但是，关于CRID3对这些基因表达的影响尚未见报道，此次实验证明CRID3药物治疗后其表达量明显降低，提示CRID3可能在急性期通过抑制基质金属蛋白酶活性，进而发挥神经保护作用。Tlr4为Toll样受体4，它与LY96和CD14协同介导对细菌脂多糖的天然免疫应答，通过Myd88等导致核因子κB活化、细胞因子分泌和炎症反应[68]。关于Tlr4在脊髓损伤中的研究有很多，具体主要集中于TLR4/核因子κB信号通路在脊髓损伤中的作用，目前的结果均是通过抑制该信号通路可以起到抗细胞凋亡、氧化应激与炎症反应的效果[69-71]。在此次实验中，也同样证实脊髓损伤后Tlr4报道升高，并且CRID3有抑制其表达的作用，但是具体是直接作用还是通过抑制炎症小体的间接作用尚需要进一步探讨。同样，对于上述讨论的其他一些非炎症小体组分的分子，如Cyba、Cybb、F11r、Hif1a、Itgal、Itgam、Itgb2、Jam3、Mmp3、Mmp9等也存在类似的情况，均需要深入探讨。
为了进一步在蛋白水平验证上述被CRID3明显抑制表达的基因与炎症小体相关主要成分之间的相互关系，作者在STRING数据库进行蛋白间相互作用分析，结果见图9，炎症小体组成成分Nlrp1、Nlrp3、Nlrp6、Nlrc4、Aim2、Asc、Csap1和Csap4相互作用密切，并且它们又通过Csap8与白细胞介素1β、白细胞介素18形成完整的链接。这表明炎症小体在脊髓损伤的急性期确实是活化的，并且CRID3也确实对其活化起到了抑制作用。此外，还有一些重要的节点蛋白，如Actn1、Cxcl5、Cd14、Cyba、Cybb、Fgf2、Hif1a、F11r、Itgal、Itga2b、Itgam、Itgb1、Jam3、Mmp3、Tlr4等被确定在整个互作网路中起重要的链接作用。与图8挖掘的对CRID3最敏感的基因比较，它们之间大部分是一致的，虽然Actn1、Cxcl5、Cd14、Fgf2这些分子没有被突出强调，其实CRID3对它们的表达均有不同程度的抑制作用。另外，这几个分子的功能与上述其他分子也有着千丝万缕的联系。如Actn1为α-肌动蛋白1，是一种广泛表达的肌动蛋白交联蛋白，主要定位于细胞骨架丝和黏着点，与包括整合素在内的多种黏附受体家族有关[72]。在此次实验分析中，Actn1是Itgal、Itga2b、Vasp和Ctnna1的节点蛋白，其中Itgal、Itga2b正是上述讨论的黏附分子，提示Actn1也参与细胞间的黏附作用。Cxcl5为C-X-C基序趋化因子5，参与损伤或感染组织的炎症细胞募集[73-74]。Cxcl5是Ccr1、Cxcr2、白细胞介素1β和白细胞介素18的节点蛋白，其中Ccr1和Cxcr2是趋化因子信号通路的重要成分[75]，而白细胞介素1β和白细胞介素18则是炎症小体活化的下游产物，与炎症反应与细胞焦亡密切相关[76]。Cd14为单核细胞的特异性标志[77]，是Itga2b、Itgam、Irf7、Tab2、Casp8等的节点蛋白，其中Itga2b、Itgam正是上述讨论的黏附分子，提示Cd14也参与细胞间的黏附作用。通过Casp8和Irf7，Cd14分别与炎症小体信号通路的上游和下游联系起来，提示在脊髓损伤后单核细胞是炎症小体活化的重要参与者，这与作者最近的报道也是一致的[13，47]。另外，Cd14通过Tab2与Tlr4链接起来，而TLR4/核因子κB信号通路已被公认在脊髓损伤中起重要作用[69-71]。因此，这与前面转录组数据挖掘分析的结果也是一致的。Fgf2为成纤维细胞生长因子2，在细胞存活、细胞分裂、血管生成、细胞分化和细胞迁移的调控中起着重要作用[78]。在此次实验分析中，Fgf2是Thbs1、Mmp3、Hif1a和Casp1等的节点蛋白，其中通过Thbs1可以与上述分析的黏附分子Itga2b和Itgb1联系起来；通过Mmp3可以与前面转录组数据挖掘分析联系起来，提示CRID3确实在急性期通过抑制基质金属蛋白酶活性，进而发挥神经保护作用；通过Hif1a可以与前面转录组数据挖掘分析的缺氧诱导因子1信号通路联系起来，提示CRID3可以发挥抗氧化应激、抗自噬、抗凋亡等作用。最后，Fgf2通过炎症小体的关键分子Casp1联系起来，提示其可能参与脊髓损伤炎症小体活化作用。
根据目前的数据，可以得出如下假设：急性脊髓损伤可导致大量与炎症相关的基因表达，这些差异基因表达的产物及其相关信号通路主要包括肿瘤坏死因子、Toll样受体、核因子κB、PI3K-Akt、缺氧诱导因子1、MAPK和NOD-样受体信号通路。这些活化的信号通路可以通过直接或间接的方式产生损伤相关的分子模式，后者通过与损伤相关的胞内模式识别受体结合进而通过ASC募集pro-caspase-1形成活化的炎症小体复合体，引起pro-caspase-1的裂解和活化产生caspase-1。激活的caspase-1可进一步切割pro-IL-1β和pro-IL-18，形成成熟的白细胞介素1β和白细胞介素18，诱发细胞焦亡、白细胞跨内皮迁移、细胞因子与其受体相互作用等信号通路活化，从而造成脊髓局部炎症和神经损伤。当给予CRID3治疗时，可以阻断ASC的聚集、抑制炎症小体复合体的形成及其下游炎症分子的活化，从而能够抑制相应的炎症信号通路，提供神经保护作用，见图10。

总之，脊髓损伤后可以激活大量与炎症小体活化相关的基因表达，这些表达基因形成的信号通路可能是炎症小体活化的原因也可能是其活化的结果。CRID3可以通过抑制炎症小体相关基因的表达直接或间接导致脊髓损伤急性期基因表达抑制，其相关的分子和信号通路主要与炎症反应、局部缺氧、细胞的黏附、迁移、分化、增殖和凋亡有关，提示在脊髓损伤急性期应用CRID3可改善脊髓损伤局部微环境，这些关键的节点分子也可以作为新的治疗干预靶点。当然脊髓损伤涉及基因、蛋白、组织等多方面的作用，此文仅仅探探讨了脊髓损伤后急性期(8 h)基因表达的变化规律，虽然得出了一些重要的基因和信号通路，但需要在蛋白水平进一步验证，可以在此基础上深入探究脊髓损伤的作用机制，为脊髓损伤的治疗寻找新的靶点，为临床治疗脊髓损伤提供实验基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

凋亡相关斑点样蛋白寡聚阻断剂对小鼠脊髓损伤急性期局部基因转录表达影响的转录组分析

CRID3, a blocker of apoptosis-associated speck-like protein containing a card, influences local gene transcription in mice with acute spinal cord injury: a transcriptomic analysis

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