京尼平交联音猬因子复合纤维蛋白支架修复大鼠脊髓损伤

doi:10.12307/2022.642

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (21): 3345-3350.doi: 10.12307/2022.642

• 组织工程神经材料 tissue-engineered nerve materials • 上一篇下一篇

京尼平交联音猬因子复合纤维蛋白支架修复大鼠脊髓损伤

陈平波1，王晶1，孙勇2，徐晓峰3，陈谦3，张志坚3

1皖南医学院弋矶山医院骨科，安徽省芜湖市 241000；2镇江市第一人民医院疼痛科，江苏省镇江市 212001；3江苏大学医学院，江苏省镇江市 212001

收稿日期:2021-07-27 接受日期:2021-10-30 出版日期:2022-07-28 发布日期:2022-01-27
通讯作者: 徐晓峰，主任医师，江苏大学医学院，江苏省镇江市 212001
作者简介:陈平波，男，汉族，医师，主要从事组织工程研究。
基金资助:
国家自然科学基金地区科学基金项目(81571830)，项目负责人：张志坚；国家自然科学基金地区科学基金项目(81501077)，项目负责人：陈谦；皖南医学院中青年自然基金(WK2019F16)，项目负责人：陈平波

Genipin crosslinked sonic hedgehog composite fibrin scaffolds for the repair of spinal cord injury in rats

Chen Pingbo1, Wang Jing1, Sun Yong2, Xu Xiaofeng3, Chen Qian3, Zhang Zhijian3

1Department of Orthopedics, Yijishan Hospital of Wannan Medical College, Wuhu 241000, Anhui Province, China; 2Department of Pain, Zhenjiang First People’s Hospital, Zhenjiang 212001, Jiangsu Province, China; 3Medical College of Jiangsu University, Zhenjiang 212001, Jiangsu Province, China

Received:2021-07-27 Accepted:2021-10-30 Online:2022-07-28 Published:2022-01-27
Contact: Xu Xiaofeng, Chief physician, Medical College of Jiangsu University, Zhenjiang 212001, Jiangsu Province, China
About author:Chen Pingbo, Physician, Department of Orthopedics, Yijishan Hospital of Wannan Medical College, Wuhu 241000, Anhui Province, China
Supported by:
Regional Science Foundation Project of National Natural Science Foundation of China, No. 81571830 (to ZZJ); Regional Science Foundation Project of National Natural Science Foundation of China, No. 81501077 (to CQ); Young and Middle-aged Natural Foundation of Wannan Medical College, No. WK2019F16 (to CPB)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
京尼平：是栀子苷经β-葡萄糖苷酶水解后的产物，是一种优良的天然生物交联剂，可以与蛋白质、胶原、明胶和壳聚糖制作生物材料，如人造骨骼、伤口包扎等，其毒性远低于戊二醛和其他常用化学交联剂。
音猬因子：是5种刺猬因子中的一种，以电子游戏角色超音速刺猬命名，由腹背侧神经管结构产生，可维持神经上皮细胞的存活、促进神经管的形成，在神经系统的发育、分化过程中具有调控功能。
纤维蛋白：是来源于血液的细胞外基质，作为细胞移植和生长因子缓释的载体用于修复脊髓损伤已取得令人满意的效果。

背景：组织工程支架移植是修复脊髓损伤最有应用前景的治疗手段之一，通过组织工程支架募集内源性神经干细胞并促进其分化为神经细胞，进而修复脊髓损伤。
目的：观察京尼平交联的音猬因子复合纤维蛋白支架移植到大鼠脊髓损伤处的修复作用，探讨其作用机制。
方法：分别制备纤维蛋白胶、音猬因子复合纤维蛋白支架、京尼平交联音猬因子复合纤维蛋白支架，检测京尼平交联音猬因子复合纤维蛋白支架的体外降解率与缓释性能。将120只雌性SD大鼠随机分为4组，每组30只，A组T10-T11脊髓损伤部位不植入任何材料，B组T10-T11脊髓损伤部位植入纤维蛋白胶，C组T10-T11脊髓损伤部位植入音猬因子复合纤维蛋白支架，D组T10-T11脊髓损伤部位植入京尼平交联音猬因子复合纤维蛋白支架，术后每周对大鼠进行运动功能BBB评分，术后12周取脊髓损伤处及周围脊髓组织，进行组织形态与Western Blot检测。
结果与结论：①音猬因子复合纤维蛋白支架14 d基本完全降解，京尼平交联的纤维蛋白支架14 d的降解率不超过20%；音猬因子复合纤维蛋白支架7 d基本完全释放了音猬因子；京尼平交联音猬因子复合纤维蛋白支架在1-3 d爆发释放音猬因子，4-14 d内缓慢释放音猬因子，具有良好的缓释性能；②随着时间的延长，各组大鼠的运动功能BBB评分升高，B、C组术后12周的BBB评分高于A组(P < 0.05)，D组术后12周的BBB评分高于B、C组(P < 0.05)；③苏木精-伊红染色显示，A组脊髓损伤处恢复最差，D组恢复最好；④免疫组化染色与Western Blot检测显示，A组巢蛋白、神经生长相关蛋白43、神经丝蛋白200、髓鞘碱性蛋白表达量最低，胶质纤维酸性蛋白表达最高；D组巢蛋白、神经生长相关蛋白43、神经丝蛋白200、髓鞘碱性蛋白表达量最高，胶质纤维酸性蛋白表达最低；⑤结果表明，京尼平交联音猬因子复合纤维蛋白支架具有良好的缓释性能，可促进大鼠损伤脊髓的修复。
缩略语：京尼平交联音猬因子复合纤维蛋白支架：fibrin-genipin-sonic hedgehog，Fibrin-GP-SHH

https://orcid.org/0000-0003-4149-7909 (陈平波)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 京尼平, 音猬因子, 纤维蛋白, 缓释脊髓损伤, 交联, 支架, 移植, 修复

Abstract: BACKGROUND: Tissue engineering scaffold transplantation is one of the most promising therapeutic methods for repairing spinal cord injury. Endogenous neural stem cells are recruited through tissue engineering scaffolds and promoted to differentiate into nerve cells to repair spinal cord injury.
OBJECTIVE: To observe the effect of transplantation of genipin crosslinked sonic hedgehog (Shh) composite fibrin scaffolds into the injured spinal cord of rats on the repair of spinal cord injury and to explore the underlying mechanism.
METHODS: Fibrin glue, Shh composite fibrin scaffold, and genipin crosslinked Shh composite fibrin scaffold were prepared separately. In vitro degradation rate and sustained release performance of genipin crosslinked Shh composite fibrin scaffold were detected. Totally 120 female Sprague-Dawley rats were randomly divided into four groups (n=30). No material was implanted at the T10-T11 spinal cord injury site in group A. Fibrin glue was implanted in the T10-T11 spinal cord injury site of group B. T10-T11 spinal cord injury site was implanted with Shh composite fibrin scaffold in group C. Genipin crosslinked Shh composite fibrin scaffold was implanted at the T10-T11 spinal cord injury site in group D. After surgery, the rats were scored with BBB motor function every week. At 12 weeks after surgery, spinal cord tissue at and around the injury site was harvested and used for morphological observation and western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Shh composite fibrin scaffold was basically completely degraded at 14 days. The degradation rate of the genipin crosslinked fibrin scaffold at 14 days did not exceed 20%. The Shh composite fibrin scaffold basically released the Shh at 7 days. Genipin crosslinked Shh composite fibrin scaffold released Shh explosively in 1-3 days, and slowly released Shh within 4-14 days, which had a good slow-release property. (2) As time went by, the BBB scores of motor function of rats increased in each group. The BBB scores of groups B and C were higher than those of group A at 12 weeks after surgery (P < 0.05). The BBB score of group D was higher than those in groups B and C at 12 weeks after surgery (P < 0.05). (3) Hematoxylin-eosin staining showed that the recovery from spinal cord injury site in group A was the worst, and the recovery in group D was the best. (4) Immunohistochemical staining and western blot assay showed that the expression of nestin, nerve growth-associated protein 43, neurofilament protein 200, and myelin basic protein was the lowest, and the expression of glial fibrillary acidic protein was the highest in group A. The expression of nestin, nerve growth-associated protein 43, neurofilament protein 200, and myelin basic protein was the highest, and glial fibrillary acidic protein expression was the lowest in group D. (5) It is concluded that genipin crosslinked Shh composite fibrin scaffold had a good slow-release effect and could promote the repair of rat spinal cord.

Key words: genipin, sonic hedgehog, fibrin, slow-release, spinal cord injury, crosslinking, scaffolds, transplant, repair

中图分类号:

陈平波, 王晶, 孙勇, 徐晓峰, 陈谦, 张志坚. 京尼平交联音猬因子复合纤维蛋白支架修复大鼠脊髓损伤[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(21): 3345-3350.

Chen Pingbo, Wang Jing, Sun Yong, Xu Xiaofeng, Chen Qian, Zhang Zhijian. Genipin crosslinked sonic hedgehog composite fibrin scaffolds for the repair of spinal cord injury in rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(21): 3345-3350.

图/表（结果） 7

2.1 各组支架的大体及微观结构纤维蛋白胶与音猬因子复合纤维蛋白支架大体观为半透明水凝胶样，Fibrin-GP-SHH支架为透明淡蓝色水凝胶样；扫描电镜下可见，各组支架内部为多孔网状结构，其中Fibrin-GP-SHH支架的多孔网状结构序列得到进一步改善，见图1。

2.2 Fibrin-GP-SHH支架的体外降解率见图2。

音猬因子复合纤维蛋白支架在7 d时的降解率超过80%，14 d基本完全降解；Fibrin-GP-SHH支架14 d时的降解率不超过20%，降解率较音猬因子复合纤维蛋白支架明显降低，两种支架不同时间点的降解率比较差异均有显著性意义(P < 0.05)。
2.3 Fibrin-GP-SHH支架的体外音猬因子缓释性能根据音猬因子-ELISA试剂盒测得每天所取样本中音猬因子浓度绘制缓释曲线，音猬因子复合纤维蛋白支架与Fibrin-GP-SHH支架显示音猬因子在1-3 d有爆发释放，音猬因子复合纤维蛋白支架4-7 d音猬因子基本快速释放结束，而Fibrin-GP-SHH支架在之后4-14 d内缓慢释放，见图3。

2.4 Fibrin-GP-SHH支架动物体内应用效果
2.4.1 移植后大鼠运动功能评价实验过程中所有大鼠均存活，4组大鼠术后运动功能BBB评分见图4。术后1周内，各组大鼠运动功能BBB评分基本为0分，2周后评分开始升高，其中D组大鼠术后3-12周的运动功能BBB评分高于A、B、C组(P < 0.05)。

2.4.2 组织学观察脊髓损伤修复见图5。

苏木精-伊红染色：A组脊髓损伤周围坏死液化区明显，新生纤维稀疏且排列紊乱，损伤近端胶质瘢痕增生明显，远端脊髓组织萎缩明显。B、C、D组脊髓损伤部位均有不同程度的恢复，其中B组恢复程度较小，D组恢复程度最大，周围坏死液化区较少，新生纤维密集且呈线性排列，损伤愈合部位空洞较少。
免疫组化染色：巢蛋白、神经生长相关蛋白43、神经丝蛋白200、髓鞘碱性蛋白免疫组化染色显示，D组残留的未坏死神经元较多，且新生神经元呈线性排列，新生神经元相互交织并形成突触；C组虽有新生神经元生成，但较D组稀疏，且新生神经元较短、突触较少；B组虽有恢复，但仅见少量残留的未坏死神经元，其间新生神经元较少；A组损伤两端可见组织坏死，细胞凋亡多，见大量的坏死的神经纤维。胶质纤维酸性蛋白免疫组化染色显示胶质瘢痕含量为：D组<C组<B组<A组。
2.4.3 Western blotting检测脊髓损伤修复相关蛋白表达见图6。

B组脊髓损伤处巢蛋白、神经生长相关蛋白43、神经丝蛋白200、髓鞘碱性蛋白的蛋白表达量高于A组(P < 0.05)，胶质纤维酸性蛋白的蛋白表达量低于A组(P < 0.05)；C、D组脊髓损伤处巢蛋白、神经生长相关蛋白43、神经丝蛋白200、髓鞘碱性蛋白的蛋白表达量高于B组(P < 0.05)，胶质纤维酸性蛋白的蛋白表达量低于B组(P < 0.05)；D组脊髓损伤处巢蛋白、神经生长相关蛋白43、神经丝蛋白200、髓鞘碱性蛋白的蛋白表达量高于C组(P < 0.05)，胶质纤维酸性蛋白的蛋白表达量低于C组(P < 0.05)。
2.5 Fibrin-GP-SHH支架的组织相容性由体内动物实验可知，Fibrin-GP-SHH支架具有良好的组织相容性。

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引言

材料方法

1.1 设计动物体内实验，组间比较采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2016年3月至2019年3月在江苏大学医学院基础医学研究所完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物健康5周龄雌性SD大鼠120只，体质量约200 g，由江苏大学试验动物中心提供，动物许可证号：SCXK(苏)2017-0023。将120只大鼠随机分为4组，每组30只。
动物实验经江苏大学医学院动物实验伦理委员会批准。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.3.2 主要试剂纤维蛋白原(拜英公司，中国)；京尼平(普振生物，上海)；音猬因子(PeproTech，美国)；小鼠抗巢蛋白、兔抗神经生长相关蛋白43、小鼠抗神经丝蛋白200、小鼠抗胶质纤维酸性蛋白、小鼠抗 actin、HRP结合的羊抗兔/鼠IgG(武汉博士德)；音猬因子-ELISA试剂盒(Thermo Fisher，美国)；DMEM培养基(Gibco公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 Fibrin-GP-SHH支架的制备将纤维蛋白粉末及京尼平粉末分别溶于生理盐水中，制成质量浓度为25 g/L的纤维蛋白溶液及1 g/L的京尼平溶液。将凝血酶粉末溶于40 mmol/L氯化钙溶液中，制成质量浓度为20 mg/L的凝血酶溶液。将25 μg的音猬因子粉末溶于250 μL凝血酶溶液中，制成100 mg/L的音猬因子溶液。取10 μL的音猬因子溶液、20 μL的京尼平溶液及20 μL的凝血酶溶液，加入50 μL纤维蛋白原溶液中，混合入10 mL离心管中，混合液迅速反应形成生物凝胶，将生成的凝胶置于37 ℃恒温箱中24 h，促进京尼平充分交联，得到Fibrin-GP-SHH支架。同理制备纤维蛋白胶、音猬因子复合纤维蛋白支架。扫描电镜下观察支架的微观结构。
1.4.2 支架的体外降解性能取音猬因子复合纤维蛋白支架及Fibrin-GP-SHH支架各3个样品，冷冻干燥后称质量，记为m0，置入含2.5 g/L的DMEM培养基中，37 ℃恒温。在不同时间段取出支架(1，3，5，7，14 d)，冷冻干燥后称质量，记为m1。支架降解率=(m0-m1)/m1×100%。
1.4.3 支架的体外缓释性能将Fibrin-GP-SHH支架置入5 mL离心管中，加入3 mL的PBS(pH=7.4),放入37 ℃恒温摇床中(摇速60 r/min)，取不同时间段上清(1，2，3 d……14 d)，每次取样3 mL，补充等体积PBS，用音猬因子-ELISA试剂盒检测所取样本浓度。每个样品设置2个复孔，重复2次，取平均值。
1.4.4 支架的动物体内实验 4组大鼠麻醉后暴露T9-L1棘突及椎板，用特制咬骨钳去除T9-T12棘突及椎板，于T10-T11节段用铂金刀切断脊髓，A组不植入任何材料，B组植入纤维蛋白胶，C组植入音猬因子复合纤维蛋白支架，D组植入Fibrin-GP-SHH支架，复位硬脊膜并逐层缝合肌肉皮肤。术后大鼠分笼喂养，1周内肌注青霉素(5×104 U/kg，1次/d)，预防感染。术后每天数次人工按摩膀胱，协助排尿。

运动功能评估：术后每周进行运动功能Basso Beattie Bresnahan(BBB)评分，对每组大鼠后肢功能进行双盲评分，评分越高表明大鼠运动功能恢复的越好。将评分的大鼠放置于空旷的环境中适应10 min，然后让大鼠自由行走5 min进行评分，评分时不要触碰或刺激大鼠[15]，具体评分方法，见表1。

组织学评估脊髓损伤组织恢复：术后12周，每组取15只大鼠，深度麻醉下开胸行快速灌注固定，先予以500 mL的生理盐水快速置换大鼠体内血液，然后再用500 mL的40 g/L多聚甲醛固定大鼠。待大鼠固定完全后取出大鼠脊髓组织，将脊髓损伤上下2 cm的脊髓组织置入40 g/L多聚甲醛再固定24 h，将组织行石蜡包埋、切片，切片厚度10 μm，对组织行苏木精-伊红染色及巢蛋白、神经生长相关蛋白43、神经丝蛋白200、髓鞘碱性蛋白、胶质纤维酸性蛋白的免疫组织化学染色。免疫组化染色：切片脱蜡，PBS洗3次，每次5 min；柠檬酸煮沸3 min，冷却5 min，再加热2 min，冷却后PBS冲洗3次；加3%BSA后37 ℃封闭15 min；分别加入一抗巢蛋白、神经生长相关蛋白43、神经丝蛋白200、髓鞘碱性蛋白、胶质纤维酸性蛋白(1∶200)4 ℃孵育过夜；PBS洗3次，加入HRP结合的山羊抗兔二抗(1∶500)37 ℃孵育30 min；PBS洗3次，加入DAB显色；苏木精复染细胞核；脱水、封固观察。
Western blotting 检测脊髓组织相关蛋白表达：术后12周，每组取15只大鼠，将大鼠深度麻醉后行颈椎脱臼法处死，与冰上快速取出脊髓损伤处上下0.5 cm脊髓组织。加入RAPI蛋白裂解液(使用前于裂解液中加入苯甲基磺酰氟)，用组织研磨器将脊髓组织研磨成匀浆，裂解45 min后超声进一步打碎组织，上述所有操作均在冰上操作。于4 ℃离心机中12 000 r/min离心10 min，取上清加入buffer煮沸5 min。聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，封闭，加入一抗巢蛋白、神经生长相关蛋白43、神经丝蛋白200、髓鞘碱性蛋白、胶质纤维酸性蛋白(1∶300)于4 ℃过夜，加入HRP结合的山羊抗兔二抗(1∶500)，摇床上室温孵育2 h，加入ECL-plus发光剂，于分子成像系统(Ty-phoon9400)中曝光。
1.5 主要观察指标 Fibrin-GP-SHH支架的体外降解与缓释性能，以及修复脊髓损伤的效果。
1.6 统计学分析所有定量实验数据用x±s表示，采用SPSS 17.0软件进行统计分析，组间数据比较采用单因素方差分析。以P < 0.05为差异有显著性意义。该文统计学方法已经江苏大学生物统计学专家审核。

讨论

脊髓损伤是临床工作中需要解决的难题，迄今为止尚无任何有效的解决方案[16]。脊髓损伤后损伤处的神经及轴突再生是治疗策略中的难点[17]，因此，应为神经损伤修复提供一个良好的微环境，促进干细胞增殖、分化为神经细胞，并促进神经元细胞成熟形成突触[18-19]。组织工程支架移植是修复脊髓损伤最有应用前景的治疗手段之一，可以改善损伤处微环境、促进脊髓内再生机制、促进脊髓损伤修复[20-24]。
此次实验选用纤维蛋白原作为组织工程支架载体，纤维蛋白原是一种高分子蛋白，是血凝块基础成分纤维蛋白的前体，纤维蛋白原在凝血酶及凝血因子XⅢ的激活下形成纤维蛋白[25-27]。纤维蛋白原可取自自体血浆，移植无排斥反应，用其构建的组织工程支架在体内具有良好的生物相容性[28-31]；纤维蛋白原在凝血酶激活下可迅速凝固并交织成多孔的纤维蛋白网状支架，有利于支架内外的物质交换，且支架的制作过程简单易行；纤维蛋白分子上含有RGD序列，可促进细胞的黏附、增殖及迁移[31-32]。纤维蛋白较快的降解率限制了其在组织工程的应用[33]。然而，交联可降低纤维蛋白的降解，并增强其作为缓释载体的性能。
京尼平是一种天然交联剂，是栀子苷经β-葡萄糖苷酶水解后的产物，其细胞毒性远低于其他传统化学交联剂，如戊二醛、二异氰酸酯等[34]。京尼平已被广泛用于生物材料改性及药物缓释等领域[35]。实验结果表明，京尼平交联后的纤维蛋白支架降解率速度明显减缓，且交联后支架音猬因子缓释更加平稳，缓释时间明显延长。
此次实验研究表明，京尼平交联音猬因子纤维蛋白复合支架可以有效促进大鼠脊髓损伤后运动功能的恢复及其组织学修复，且明显优于其他实验组。京尼平交联音猬因子复合纤维蛋白支架组巢蛋白、神经生长相关蛋白43、神经丝蛋白200、髓鞘碱性蛋白表达量明显高于其他实验组，胶质纤维酸性蛋白表达量明显低于其他实验组，且损伤处空洞较小。巢蛋白是神经干细胞的一种特异性的表面标记物，神经生长相关蛋白43及神经丝蛋白200是神经元特有的结构蛋白，胶质纤维酸性蛋白是神经胶质细胞的特异性表面标志物。此次实验结果表明，Fibrin-GP-SHH支架不但可以缓释音猬因子形成浓度梯度有效诱导内源性神经干细胞向损伤处募集，同时损伤处高浓度的音猬因子可以诱导神经干细胞分化为成熟的神经元；并且可以抑制脊髓损伤后胶质瘢痕的生成，同时对损伤处及损伤周围的神经元具有保护作用，减少神经元的凋亡，从而减少空洞的形成。
综上所述，京尼平的交联使音猬因子复合纤维蛋白支架具有良好的缓释功能。京尼平交联音猬因子复合纤维蛋白支架移植到大鼠脊髓损伤处，可以为损伤处提供良好的微环境，且缓慢释放的音猬因子可以募集内源性神经干细胞，损伤处释放游离的音猬因子和交联的多聚体音猬因子促进募集的神经干细胞增殖并分化为成熟的神经元，促进促进脊髓损伤的恢复，为组织工程治疗脊髓损伤提供了一种可行性。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

京尼平交联音猬因子复合纤维蛋白支架修复大鼠脊髓损伤

Genipin crosslinked sonic hedgehog composite fibrin scaffolds for the repair of spinal cord injury in rats

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