高糖状态下脂多糖介导βtc6细胞自噬的机制

doi:10.12307/2022.609

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (20): 3127-3132.doi: 10.12307/2022.609

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高糖状态下脂多糖介导βtc6细胞自噬的机制

蔡智国，都沙沙，杨琨，赵娜，刘琪

遵义医科大学附属口腔医院牙周科，贵州省遵义市 563000

收稿日期:2021-04-12 接受日期:2021-06-03 出版日期:2022-07-18 发布日期:2022-01-19
通讯作者: 刘琪，博士，主任医师，遵义医学院附属口腔医院牙周科，贵州省遵义市 563000
作者简介:蔡智国，男，1990年生，贵州省桐梓县人，汉族，2019年遵义医科大学研究生院毕业，硕士，医师，现工作于遵义市红花岗区口腔医院牙周黏膜科，主要研究牙周病与2型糖尿病的关系。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81860196)，项目负责人：刘琪，课题名称：2型糖尿病伴牙周炎牙周膜干细胞凋亡转归的线粒体损伤、自噬失调机制研究

Lipopolysaccharides mediate autophagy of mouse insulinoma βtc6 cells in high glucose state

Cai Zhiguo, Du Shasha, Yang Kun, Zhao Na, Liu Qi

Department of Periodontology, Affiliated Stomatological Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi 563000, Guizhou Province, China

Received:2021-04-12 Accepted:2021-06-03 Online:2022-07-18 Published:2022-01-19
Contact: Liu Qi, MD, Chief physician, Department of Periodontology, Affiliated Stomatological Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi 563000, Guizhou Province, China
About author:Cai Zhiguo, Master, Physician, Department of Periodontology, Affiliated Stomatological Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi 563000, Guizhou Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81860196 (to LQ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
过度自噬：是细胞自噬性细胞死亡，也称为Ⅱ型程序性细胞死亡，其主要特征为细胞质中大量自噬溶酶体降解大部分物质，但细胞核依然保持完整。
PI3K/Akt/mTOR通路：主要由 PI3K 激酶、蛋白激酶 B和哺乳动物类雷帕霉素靶蛋白的3个作用分子组成，在正常细胞生理、癌症扩散、肿瘤发生和转移中都发挥作用。

背景：作者团队前期证实糖尿病促进牙周炎的发生发展，而牙周炎是否促进糖尿病发展？
目的：探索牙周炎促进糖尿病发展的分子机制。
方法：体外培养小鼠胰岛素瘤βtc6细胞，分为对照组、葡萄糖组、脂多糖组、葡萄糖+脂多糖组，采用不同浓度葡萄糖(0，25，50，
100 mmol/L)和脂多糖(0，10，20，40 mg/L)单独或联合刺激βtc6细胞12 h，检查每组胰岛素分泌量。另外分别加入自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(5 μmol/L)和自噬激活剂雷帕霉素(10 mmol/L)对磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白(phoshatidylinositol-3-kinase/rotein kinase B/the mammalian target of rapamycin，PI3K/AKT/mTOR)信号通路进行干预，分为雷帕霉素+脂多糖组、雷帕霉素+葡萄糖组、雷帕霉素+葡萄糖+脂多糖组及3-甲基腺嘌呤+脂多糖组、3-甲基腺嘌呤+葡萄糖组、3-甲基腺嘌呤+葡萄糖+脂多糖组。CCK-8法检测各组βtc6细胞增殖情况，活性氧荧光探针检测各组βtc6细胞中活性氧聚集量，透射电镜观察各组βtc6细胞中自噬小体生成量，Western Blot法检测自噬蛋白及相关通路蛋白表达。
结果与结论：①葡萄糖浓度超过50 mmol/L时，胰岛素分泌量不受葡萄糖调节(P > 0.05)；脂多糖质量浓度大于20 mg/L时，胰岛素分泌量受到抑制(P < 0.05)；②加入3-甲基腺嘌呤后，3-甲基腺嘌呤+葡萄糖组、3-甲基腺嘌呤+脂多糖组、3-甲基腺嘌呤+脂多糖+葡萄糖组中Becline1、p-PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR表达较对照组显著降低(P < 0.05)；p62蛋白表达则呈相反趋势(P < 0.05)；③加入雷帕霉素后，Becline1、p-PI3K、p-mTOR/mTOR表达较对照组显著增加(P < 0.05)；④提示脂多糖能诱导胰岛β细胞过度自噬下调胰岛素分泌，该机制可能与沉默PI3K/AKT/mTOR信号通路有关。
缩略语：磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白：phoshatidylinositol-3-kinase/rotein kinase B/the mammalian target of rapamycin，PI3K/AKT/mTOR

https://orcid.org/0000-0003-0901-9237 (蔡智国)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 牙周炎, 糖尿病, 脂多糖, 自噬, 3-甲基腺嘌呤, PI3K/AKT/mTOR信号通路

Abstract: BACKGROUND: Our previous studies have confirmed that diabetes mellitus promotes the occurrence and development of periodontitis. However, it is unclear whether periodontitis can promote the development of diabetes.
OBJECTIVE: To explore the molecular mechanism by which periodontitis promotes the development of diabetes mellitus.
METHODS: Mouse βtc6 insulinoma cells cultured in vitro were divided into control group, glucose group, lipopolysaccharide group, and glucose+lipopolysaccharide group. The cells in the latter three groups were treated with different concentrations of glucose (0, 25, 50, 100 mmol/L) and lipopolysaccharide (0, 10, 20, 40 mg/L) alone or in combination for 12 hours. Insulin secretion was measured in each group. In addition, 3-methyladenine (an autophagy inhibitor, 5 μmol/L) and rapamycin (an autophagy activator, 10 mmol/L) were used to intervene with the phosphatidylinositol 3-kinase/rotein kinase B/the mammalian target of rapamycin (PI3K/AKT/mTOR) signaling pathway. The cells were then further divided into rapamycin+lipopolysaccharide group, rapamycin+glucose group, rapamycin+glucose+lipopolysaccharide group, 3-methyladenine+lipopolysaccharide group, 3-methyladenine+glucose group, and 3-methyladenine+glucose+lipopolysaccharide group. The cell counting kit-8 method was used to detect the proliferation of βtc6 cells. Fluorescent probes were used to detect the amount of reactive oxygen species in βtc6 cells. Production of autophagosomes in βtc6 cells was observed by transmission electron microscopy. Western blot method was used to detect the expression of autophagy proteins and PI3K/AKT/mTOR signaling pathway-related proteins.
RESULTS AND CONCLUSION: The insulin secretion was out of control as the glucose concentration exceeded 50 mmol/L (P > 0.05), whereas the insulin secretion was inhibited as the lipopolysaccharide concentration exceeded 20 mg/L (P < 0.05). After addition of 3-methyladenine, the expression levels of Becline1, p-PI3K, p-AKT/AKT, p-AKT/AKT, p-AKT/AKT, and p-PI3K were significantly decreased in the 3-methyladenine+glucose group, 3-methyladenine+lipopolysaccharide group, and 3-methyladenine+lipopolysaccharide+glucose group compared with the control group. While the expression of p62 protein showed the opposite trend (P < 0.05). After addition of rapamycin, the expression of Becline1, p-PI3K, and p-mTOR/mTOR was significantly increased in comparison with the control group (P < 0.05). These findings indicate that lipopolysaccharides can induce excessive autophagy of pancreatic β cells and downregulate insulin secretion. This mechanism may be related to the silencing of PI3K/AKT/mTOR signaling pathway.

Key words: periodontitis, diabetes mellitus, lipopolysaccharide, autophagy, 3-methyladenine, PI3K/AKT/mTOR signaling pathway

中图分类号:

蔡智国, 都沙沙, 杨琨, 赵娜, 刘琪. 高糖状态下脂多糖介导βtc6细胞自噬的机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(20): 3127-3132.

Cai Zhiguo, Du Shasha, Yang Kun, Zhao Na, Liu Qi. Lipopolysaccharides mediate autophagy of mouse insulinoma βtc6 cells in high glucose state[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(20): 3127-3132.

图/表（结果） 7

2.1 βtc6细胞胰岛素分泌量细胞接种48 h后，镜下可见细胞呈片状、岛状等不规则形状生长，极少个别细胞独立生长。葡萄糖浓度为50 mmol/L时，βtc6细胞胰岛素分泌量与对照组相比差异无显著性意义(P > 0.05)，在后续实验中选择葡萄糖浓度为50 mmol/L，见图1。当脂多糖浓度为20 mg/L时，βtc6细胞胰岛素分泌量(11.109 5±0.181 2) mIU/L显著下降，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图2。因此在后续实验中选择脂多糖质量浓度为20 mg/L。

2.2 βtc6细胞增殖能力相较于对照组，高浓度葡萄糖对βtc6细胞增殖总体呈现抑制趋势，脂多糖抑制βtc6细胞增殖的能力较强。当脂多糖联合50 mmol/L 葡萄糖作用于βtc6细胞时，抑制增殖的能力最强，除了第2天外，其余5 d增殖能力均低于另外3组(P < 0.05)，见图3。

2.3 βtc6细胞中活性氧聚集量与对照组相比，葡萄糖组和脂多糖组生成的活性氧水平有所增加(P < 0.05)，脂多糖+葡萄糖组的活性氧生成量显著增加(P < 0.05)；且脂多糖+葡萄糖组水平高于葡萄糖组和脂多糖组(P < 0.05)；脂多糖组生成的活性氧水平高于葡萄糖组，但二者之间差异无显著性意义(P > 0.05)，见图4。

2.4 自噬小体变化电镜下，对照组细胞自噬小体数量少，体积小，见图5A；脂多糖组略多于葡萄糖组，自噬小体数量较对照组增加，见图5B，C；脂多糖+葡萄糖组自噬小体增加更明显，体积较大，部分细胞器被包裹其中，见图5D。

2.5 自噬相关基因相对表达与对照组相比，葡萄糖组、脂多糖组及脂多糖+葡萄糖组的LC3Ⅱ基因相对表达量依次升高(P < 0.05)，脂多糖组LC3Ⅱ虽略高于葡萄糖组，但两者相比差异无显著性意义(P > 0.05)。Becline1基因相对表达量依次升高，特别是脂多糖+葡萄糖组升高更剧烈(P < 0.05)；另外，p62基因相对表达量在葡萄糖组、脂多糖组和脂多糖+葡萄糖组中均低于对照组，且脂多糖+葡萄糖组低于葡萄糖组和脂多糖组(P < 0.05)，见图6。LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Becline1、p62蛋白表达与荧光定量PCR结果一致(P < 0.05)，见图7。

2.6 PI3K/AKT/mTOR信号通路的调控作用加入3-甲基腺嘌呤后，与对照组相比，3-甲基腺嘌呤+葡萄糖组、3-甲基腺嘌呤+脂多糖组、3-甲基腺嘌呤+葡萄糖+脂多糖组Becline1蛋白表达显著降低(P < 0.05)；与3-甲基腺嘌呤+葡萄糖组、3-甲基腺嘌呤+脂多糖组相比，3-甲基腺嘌呤+葡萄糖+脂多糖组Becline1蛋白表达显著降低(P < 0.05)；p62蛋白表达则呈相反趋势(P < 0.05)；加入雷帕霉素后，
Becline1蛋白表达与加入3-甲基腺嘌呤后相反(P < 0.05)；p62蛋白表达趋势与Becline1相反(P < 0.05)，见图8。

加入3-甲基腺嘌呤后，与对照组相比，3-甲基腺嘌呤+葡萄糖组、3-甲基腺嘌呤+脂多糖组、3-甲基腺嘌呤+脂多糖+葡萄糖组中p-PI3K显著降低(P < 0.05)；与3-甲基腺嘌呤+葡萄糖组和3-甲基腺嘌呤+脂多糖组相比，3-甲基腺嘌呤+葡萄糖+脂多糖组p-PI3K显著降低(P < 0.05)；与对照组相比，雷帕霉素+葡萄糖组、雷帕霉素+脂多糖组、雷帕霉素+葡萄糖+脂多糖组中p-AKT/AKT比值显著降低(P < 0.05)，p-mTOR/mTOR比值趋势与p-PI3K一致(P < 0.05)。自噬激活组中p-PI3K、p-mTOR/mTOR 比值与自噬抑制组相反(P < 0.05)，p-AKT/AKT比值趋势与自噬抑制组一致(P < 0.05)，见图9。

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引言

材料方法

1.1 设计分组对照细胞学体外实验，两两比较均采用非配对t检验，组间比较采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2016年9月至2018年9月在遵义医科大学细胞工程实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 细胞株选用小鼠胰岛素瘤βtc6细胞株，由中国科学院上海生命科学研究院细胞库提供，实验过程中对细胞的使用符合伦理学要求。
1.3.2 试剂与抗体 DMEM培养液(Gibco)，胎牛血清(Gibco)，葡萄糖(碧云天)，脂多糖(InvivoGen)，兔抗人p62多克隆抗体(Abcam)，兔抗人Becline1单克隆抗体(Abcam)，兔抗人LC3B单克隆抗体(Abcam)、兔抗人PI3K单克隆抗体(Abcam)、兔抗人p-PI3K多克隆抗体(Abcam)，兔抗人AKT多克隆抗体(Abcam)，兔抗人p-AKT多克隆抗体(Abcam)，兔抗人mTOR单克隆抗体(Abcam)，兔抗人p-mTOR单克隆抗体(Abcam)。
1.4 实验方法
1.4.1 细胞培养从中国科学院上海生命科学研究院细胞库购买βtc6细胞株，加入含体积分数15%胎牛血清的DMEM培养液10 mL，按1∶2比例接种于25 cm2培养瓶中，置于体积分数5%CO2、37℃恒温孵箱中培养，隔日换液。细胞分为4组：对照组为正常DMEM培养基；脂多糖刺激组在DMEM培养基中加入20 mg/L的脂多糖，葡萄糖刺激组在DMEM培养基中加入50 mmol/L的葡萄糖，葡萄糖+脂多糖组在DMEM培养基中加入50 mmol/L的葡萄糖以及20 mg/L的脂多糖。
另外分别加入自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(5 μmol/L)和自噬激活剂雷帕霉素(10 mmol/L)对PI3K/AKT/mTOR信号通路进行干预，分为雷帕霉素+脂多糖组、雷帕霉素+葡萄糖组、雷帕霉素+葡萄糖+脂多糖组及3-甲基腺嘌呤+脂多糖组、3-甲基腺嘌呤+葡萄糖组、3-甲基腺嘌呤+葡萄糖+脂多糖组。
1.4.2 酶联免疫吸附实验分析细胞浓度调整为1×104个/孔，接种于96孔板，共4组，每组5孔。48 h后弃上清液，PBS清洗1遍，将已配置DMEM培养基依次加入每个组中，200 μL/孔，各组培养基分别加入不同剂量的葡萄糖(0，25，50，100 mmol/L)及脂多糖(0，10，20，40 mg/L)，用以筛选葡萄糖及脂多糖的最佳剂量用于后续实验。12 h后酶联免疫吸附试剂盒检测上清液中胰岛素含量。
1.4.3 CCK-8分析细胞浓度调整为1×104个/孔，接种于96孔板，每组4孔，共4组：对照组、50 mmol/L葡萄糖组、20 mg/L脂多糖组、50 mmol/L葡萄糖组+20 mg/L脂多糖组。将4种不同的实验培养基分别加入到对应的组别中，置于恒温孵箱中培养，隔日换液。于次日同一时间取出任意一块板，依照 CCK-8试剂盒说明书进行检测，以时间(d)为横轴、吸光度值为纵轴绘制细胞增殖曲线图。
1.4.4 AnnexinV-FITC/PI结合流式细胞仪分析βtc6细胞中活性氧聚集量分组方法同1.4.3，加入PBS调整细胞浓度为1.0×109-2.0×1010 L-1，离心后备用。按照说明书操作，上机检测。
1.4.5 透射电镜分析调整细胞浓度为1×1011 L-1，1 000 r/min离心5 min，40 g/L预冷多聚甲醛固定，1%锇酸固定，常规乙醇、丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，铅、铀双重染色后透射电镜观察并摄片。
1.4.6 实时荧光定量PCR分析分组方法同1.4.3，用TRIzol试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)提取总细胞RNA。使用反转录酶和oligo-dT引物，按照生物工程(上海)有限公司反转录试剂说明书反转录，从20 mL总RNA中转录成单链cDNA。对该cDNA进行PCR扩增，并使用SYBR Green Mix实时荧光定量PCR进行产物定量，每个反应重复3次，扩增GAPDH基因作为内部对照。GAPDH反应条件如下：①95 ℃ 30 s；②循环40次 95 ℃，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s；③95 ℃ 10 s，65 ℃ 5 s，95 ℃ 5 s。
GAPDH: Upstream 5’-CAC GGC AAA TTC CAC GGC ACA GT-3’，Downstream 5’-GGG GGC ATC AGC AGA AGG AGC AG-3’；
LC3Ⅱ: Upstream 5’-ATG TCC GAC TTA TTC GAG AGC-3’，Downstream 5’- TTG AGC TGT AAG CGC CTT CTA-3’；
Becline1: Upstream 5’-GAT GGT GTC TCT CGC AGA TTC-3’，Downstream 5’- CTG TGC ATT CCT CAC AGA GTG-3’；
p62: Upstream 5’-ACC ACT TCG CCC AGG TAA AT-3’，Downstream 5’-GGC ACT TGT CGC ACG ATA GA-3’。
1.4.7 Western Blot 分析样本中加入RIPA裂解液冰上裂解。收集上清，根据碧云天BCA测定试剂盒说明书操作进行蛋白测定。在SDS-PAGE上分离等量的蛋白质，然后转移到PVDF膜(Bio-Rad，Hercules，CA)上。加入含5%脱脂奶粉TBST溶液，脱色、封闭1 h；4 ℃一抗孵育过夜，印迹结合了HRP的抗兔二抗(Cell Signaling Technology)，并通过增强的化学发光试剂盒(West Pico，Thermo Fisher Scientific)进行化学发光反应，内参采用GAPDH。Odyssey系统测定目标蛋白，获取图片。以目的条带和内参条带的比值代表目的蛋白的表达水平，实验重复3次。
1.5 主要观察指标酶联免疫吸附实验检测各组βtc6细胞中胰岛素分泌；CCK-8法检测各组βtc6细胞增殖情况；活性氧荧光探针检测各组βtc6细胞中活性氧聚集量；透射电镜观察各组βtc6细胞中自噬小体生成量；Western Blot法检测自噬蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Becline1、p62和PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白p-PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR表达。
1.6 统计学分析所有数据均采用SPSS 18.0统计软件进行分析处理，数据均以x±s表示，两两比较均采用非配对t检验，组间比较采用单因素方差分析，以α=0.05为检验水准，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

大多数研究认为糖尿病和牙周炎之间存在双向关系，糖尿病增加了牙周炎发病风险，影响牙周疾病基础治疗，牙周疾病又会在一定程度上促进血糖升高。自噬与牙周炎和糖尿病之间的关系众说纷纭，阐明牙周炎影响糖尿病发展的机制有利于通过治疗牙周炎来缓解糖尿病的发展。
NIU等[12]采用不同浓度的葡萄糖检测了βtc6细胞株胰岛素分泌能力，发现胰岛β细胞胰岛素分泌量与葡萄糖浓度相关。此次实验结果发现，50 mmol/L 葡萄糖可以模拟糖尿病高糖微环境。脂多糖是牙周菌P.gingivalis主要产物，低剂量脂多糖参与调节胰岛β细胞增殖和胰岛素分泌[13]。有研究表明，脂多糖对胰岛β细胞功能的影响与刺激强度和时间存在关系，高浓度脂多糖或长时间刺激存对组织有高毒性[14]；甚至脂多糖暴露可促进胰岛β细胞凋亡，降低胰岛素分泌量，是胰腺炎症、胰岛β细胞受损的高危因子[15]。此次实验结果还显示脂多糖质量浓度为20 mg/L时可以模拟牙周炎的炎性微环境。同时，也有研究表明，高浓度葡萄糖和脂多糖能诱导胰岛细胞胞内活性氧聚集量增加。
体内氧化和抗氧化平衡失调，活性氧大量聚集。脂多糖能上调胰岛β细胞中诱导型一氧化氮合酶过表达，诱导一氧化氮产生，抑制胰岛β细胞胰岛素合成与分泌，最终导致胰岛β细胞功能紊乱和胰岛素抵抗[16]。SUN等[17-18]研究发现2型糖尿病患者胰岛组织中氧化应激标记物增加，表明高血糖还能诱导产生大量活性氧和其他氧自由基促进糖尿病发生发展。此次实验结果显示，葡萄糖+脂多糖组较脂多糖组和葡萄糖组活性氧聚集量显著增加；推测在葡萄糖与脂多糖作用下，β细胞内抗氧化水平失衡，最终引起胰岛素分泌受损和胰岛β细胞凋亡，这与国外文献结果相一致[19]。此外，相对于健康成年人而言，在牙龈成纤维细胞中，P.gingivalis-脂多糖可通过活性氧诱发自噬[20]。
GIACOPPO等[7]通过电子显微镜研究 2型糖尿病患者和正常人群胰腺内分泌细胞情况，结果显示死亡的胰岛β细胞在2型糖尿病组和对照组中分别占(2.24±0.53)%和(0.66±0.52)%；在2型糖尿病组胰岛中死亡的胰岛β细胞有凋亡标志的占(1.06±0.43)%，对照组占(0.30±0.32)%(P < 0.05)；在2型糖尿病组胰岛中死亡的胰岛β细胞有大量液泡没有变大的染色质凝聚(自噬死亡相关迹象)者占0.54%，对照组占(0.36±0.26)%。当正常人群的胰岛暴露于非酯化脂肪酸时可观察到大量液泡积聚，同时伴有胰岛β细胞死亡增加和溶酶体相关性膜蛋白2表达减少[21]。溶酶体相关性膜蛋白2是分子伴侣介导自噬的关键调节因子，因此提示过度自噬也可能导致胰岛β细胞的损伤。鉴于该研究的观点，作者检测了每组中自噬小体以及自噬相关基因和蛋白的表达情况，实验结果显示，葡萄糖组和脂多糖+葡萄糖组自噬小体多于脂多糖组和对照组，且脂多糖+葡萄糖组自噬小体的体积较大，部分细胞器被包裹其中；脂多糖+葡萄糖组和脂多糖组中Becline1和LC3Ⅱ相对基因表达量最高，Becline1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达趋势与之一致。这说明葡萄糖与脂多糖作用下，胰岛β细胞自噬上调。结合前部分酶联免疫吸附实验结果，葡萄糖与脂多糖作用下βtc6细胞胰岛素分泌降低，与HUANG等[22]得到的结果相印证，即通过上调小鼠胰岛β细胞自噬水平其胞内胰岛素含量降低。
PI3K/Akt/mTOR信号通路中PI3K激活丝氨酸/苏氨酸激酶Akt，之后通过一系列的调控使 mTOR磷酸化从而抑制自噬[23]。有证据表明，来自P.gingivalis的脂多糖能够抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路促进人牙龈成纤维细胞的自噬[20]。近期研究发现糖尿病心肌缺血再灌注损伤过程中PI3K/Akt/mTOR信号传导通路受到抑制，从而导致糖尿病心肌缺血再灌注损伤自噬表达进一步增强[24]。由此可见，自噬及其相关PI3K/Akt/mTOR信号通路与糖尿病存在密切联系，为了验证牙周毒力因子是否能通过PI3K/Akt/mTOR信号通路诱导高糖状态下胰岛细胞过度自噬，此次实验使用PI3K抑制剂3-甲基腺嘌呤及mTOR特异性抑制剂雷帕霉素来对该信号通路进行调控。雷帕霉素是哺乳动物mTOR信号通路特异性的负调控因子，可通过与mTOR结合，阻断mTOR信号通路，激活细胞自噬[25]；3-甲基腺嘌呤是Ⅲ型PI3K的抑制剂，在自噬起始阶段阻止LC3Ⅰ向LC3Ⅱ转化，从而抑制自噬发生[26]。βtc6细胞株实验结果也显示，经3-甲基腺嘌呤调控后，p-PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR较雷帕霉素调控后低，同时自噬相关蛋白Beclin1随之降低，而p62则增加，这些结果表明PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达水平受到调控。
总之，此次研究通过不同的方法模拟牙周炎、糖尿病和牙周炎伴糖尿病体外微环境，验证了牙周毒力因子脂多糖能诱导胰岛β细胞过度自噬下调胰岛素分泌，该机制可能与沉默PI3K/AKT/mTOR信号通路有关。当然体外实验研究糖尿病和牙周炎的关系方法较多，大量阅读国内外文献，作者选择了脂多糖为主要牙周刺激因子，而自噬的机制有很多，此次实验只是选择了其中最经典的一条，是否还存在其他通路还需要进一步检测。糖尿病的发病率逐年上升，了解牙周炎影响糖尿病发展的机制可能为牙周炎和糖尿病防治提供新的见解。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

高糖状态下脂多糖介导βtc6细胞自噬的机制

Lipopolysaccharides mediate autophagy of mouse insulinoma βtc6 cells in high glucose state

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