跑台运动改善自发性2型糖尿病模型小鼠心肌纤维化中的作用途径

doi:10.12307/2022.225

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (8): 1210-1215.doi: 10.12307/2022.225

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跑台运动改善自发性2型糖尿病模型小鼠心肌纤维化中的作用途径

陈祥和1，刘波1，杨康2，陆鹏程1，余慧琳1

1扬州大学体育学院，江苏省扬州市 225127；2江苏省苏北人民医院康复科，江苏省扬州市 225001

收稿日期:2020-11-11 修回日期:2020-11-14 接受日期:2021-02-14 出版日期:2022-03-18 发布日期:2021-11-02
作者简介:陈祥和，男，1986年生，山东省临沂市人，汉族，2016年华东师范大学毕业，博士，副教授，主要从事运动促进健康的生物学机制研究。
基金资助:
中国博士后科学基金资助(2019M661957)，项目负责人：陈祥和；中国博士后科学基金特别资助(2021T140580)，项目负责人：陈祥和；扬州大学“青蓝工程”优秀青年骨干教师项目，项目负责人：陈祥和

Treadmill exercise improves the myocardial fibrosis of spontaneous type 2 diabetic mice: an exploration on the functional pathway

Chen Xianghe1, Liu Bo1, Yang Kang2, Lu Pengcheng1, Yu Huilin1

1College of Physical Education, Yangzhou University, Yangzhou 225127, Jiangsu Province, China; 2Department of Rehabilitation, the Northern Jiangsu People's Hospital, Yangzhou 225001, Jiangsu Province, China

Received:2020-11-11 Revised:2020-11-14 Accepted:2021-02-14 Online:2022-03-18 Published:2021-11-02
About author:Chen Xianghe, MD, Associate professor, College of Physical Education, Yangzhou University, Yangzhou 225127, Jiangsu Province, China
Supported by:
the China Postdoctoral Science Foundation, No. 2019M661957 (to CXH); Special Project of China Postdoctoral Science Foundation, No. 2021T140580 (to CXH); Yangzhou University “Qinglan Project” for Outstanding Young Teachers (to CXH)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
miR-29a：作为microRNAs家族成员，其可负向调控转化生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)的激活，进而作用于膜上具有丝氨酸-苏氨酸激酶活性的TGF-β1Ⅰ型(TβRⅠ)和Ⅱ型(TβRⅡ)跨膜受体。TβRⅡ，TβRⅠ被认为是活化素样受体激酶，磷酸化TGF-β1下游信号蛋白Smad2和Smad3后，并使其与Smad4形成磷酸化复合基团，并迅速转移入核，介导靶基因Ⅰ型胶原表达来转导TGF-β1信号，从而调控心肌纤维化发生、发展。
Smads家族蛋白：在将转化生长因子β信号从细胞表面受体传导至细胞核的过程中起到关键性作用，且不同的Smad介导不同的转化生长因子β家族成员的信号转导。转化生长因子β作为配体形成的受体复合物，激活Smads进入核内，共同激活或抑制它们调节的靶基因的转录。
背景：2型糖尿病伴发心肌间质纤维化，虽然miR-29a密切调控TGF-β1/Smads途径，但有关该信号通路调控2型糖尿病心肌间质纤维化的相关研究尚鲜有报道。研究表明运动能改善2型糖尿病心肌纤维化。
目的：探究不同方式运动对自发性2型糖尿病小鼠(KK-Ay小鼠)心肌纤维化的影响及miR-29a/TGF-β1途径在此过程中的分子调控作用。
方法：24只10周龄SPF级雄性KK-Ay小鼠适应性喂养1周后，随机分为KK-Ay对照组(8只)、KK-Ay游泳组(8只)和KK-Ay跑台组(8只)，8只10周龄C57BL/6J小鼠作为正常对照组(8只)。KK-Ay小鼠进行高脂膳食，C57BL/6J小鼠喂以普通饲料。KK-Ay游泳组和KK-Ay跑台组小鼠分别利用游泳和跑台运动进行8周训练。结束后，取小鼠左心室室壁，利用Masson染色检测心肌纤维化程度变化；利用RT-PCR法检测心肌中相关因子mRNA表达；利用ELISA和Western-blotting分别检测心肌中相关因子蛋白水平和蛋白表达。实验方案经扬州大学体育学院动物实验伦理委员会批准，动物伦理编号为YZU-TYXY-31。
结果与结论：①与正常对照组相比，KK-Ay对照组小鼠心肌间质纤维化程度显著；心肌中miR-29a mRNA表达和蛋白水平均显著下降，且转化生长因子β1、Smad3、Smad4、Ⅰ型胶原的mRNA表达和p-Smad2、p-Smad3、p-Smad4蛋白表达均显著上调(P < 0.05或P < 0.01)，转化生长因子β1和Ⅰ型胶原蛋白水平显著升高(P < 0.05或P < 0.01)；②与KK-Ay对照组相比，KK-Ay游泳组小鼠心肌纤维化无显著性变化，心肌中转化生长因子β1 mRNA和蛋白水平、Smad4 mRNA表达显著下降(P < 0.05)；KK-Ay跑台组小鼠心肌纤维化程度改善显著，心肌中miR-29a mRNA表达和蛋白水平均上升(P < 0.05)，转化生长因子β1、Smad2、Smad3和Ⅰ型胶原 mRNA表达及转化生长因子β1、Ⅰ型胶原蛋白水平显著下降 (P < 0.05)，p-Smad2、p-Smad3和p-Smad4蛋白表达显著下调(P < 0.05或P < 0.01)；④结果说明，2型糖尿病小鼠心肌间质纤维化程度严重；跑台运动可通过上调2型糖尿病小鼠心肌中miR-29a来抑制TGF-β1/Smads途径进而改善心肌纤维化，但游泳运动效果不显著。

https://orcid.org/0000-0002-8696-8674 (陈祥和)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 跑台, 游泳, 2型糖尿病, 心肌纤维化, miR-29a

Abstract: BACKGROUND: For type 2 diabetes mellitus accompanied by myocardial interstitial fibrosis, although miR-29a closely regulates the transforming growth factor (TGF)-β1/Smads pathway, little is reported about this signaling pathway regulating myocardial interstitial fibrosis in type 2 diabetes. Existing studies have shown that exercise can improve myocardial fibrosis in type 2 diabetes.
OBJECTIVE: To investigate the effect of different kinds of exercises on myocardial fibrosis in spontaneous type 2 diabetic mice (KK-Ay mice) and the molecular regulation of miR-29a/TGF-β1 pathway in this process.
METHODS: Twenty-four KK-Ay mice, 10 weeks of age, were adaptively fed for 1 week, and randomly divided into KK-Ay control group (KC; 8 mice), KK-Ay swimming group (KY; 8 mice) and KK-Ay treadmill group (KP; 8 mice). Another eight C57BL/6J mice, 10 weeks of age, were selected as normal control group (ZC). KK-Ay mice were given a high-fat diet, and C57BL/6J mice were fed with common feed. The mice in the KY and KP groups were trained for 8 weeks by swimming and running exercise, respectively. Afterwards, the wall of the left ventricle of the mouse was taken, and the change of myocardial fibrosis was detected by Masson staining. The mRNA expression of relevant factors in the myocardium was detected by RT-PCR; the protein level and expression of the relevant factors in the myocardium were detected by ELISA and western blot, respectively. The study protocol was approved by the Animal Ethics Committee of Physical Education School of Yangzhou University with an approval No. YZU-TYXY-31.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the ZC group, the KC group had a significant degree of myocardial interstitial fibrosis; miR-29a mRNA expression and protein level in the myocardium were significantly reduced and TGF-β1, Smad3, Smad4, type I collagen mRNA expression and p-Smad2, p-Smad3, p-Smad4 protein expression were significantly up-regulated (P < 0.05 or P < 0.01), and TGF-β1 and type I collagen protein levels were significantly increased (P < 0.05 or P < 0.01). Compared with the KC group, no significant change in myocardial fibrosis was observed in the KY group; the expression of TGF-β1 and Smad4 mRNAs in the myocardium was significantly down-regulated and the TGF-β1 protein level was significantly reduced (P < 0.05), and other related indicators were not significantly changed. The degree of myocardial fibrosis in the KP group was significantly improved; miR-29a mRNA expression and protein level in the myocardium increased (P < 0.05), TGF-β1, Smad2, Smad3 and COL1 mRNA expression and TGF-β1, COL1 protein levels decreased significantly (P < 0.05 or P < 0.01), and p-Smad2, p-Smad3 and p-Smad4 protein expression was significantly down-regulated (P < 0.05). Compared with the KY group, the myocardial fibrosis of the KP group was significantly improved; miR-29a mRNA expression and protein level in the myocardium were significantly increased (P < 0.05), TGF-β1, COL1 mRNA expression and protein level were significantly reduced (P < 0.05), and p-Smad2, p-Smad3 and p-Smad4 protein expression was significantly down-regulated (P < 0.05 or P < 0.01). To conclude, type 2 diabetic mice have severe myocardial fibrosis. Treadmill exercise inhibits the TGF-β1/Smads pathway by up-regulating miR-29a in the myocardium of T2DM mice to improve myocardial fibrosis, but swimming exercise has no significant effect.

Key words: treadmill, swimming, type 2 diabetes mellitus, myocardial fibrosis, miR-29a

中图分类号:

陈祥和, 刘波, 杨康, 陆鹏程, 余慧琳. 跑台运动改善自发性2型糖尿病模型小鼠心肌纤维化中的作用途径[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1210-1215.

Chen Xianghe, Liu Bo, Yang Kang, Lu Pengcheng, Yu Huilin. Treadmill exercise improves the myocardial fibrosis of spontaneous type 2 diabetic mice: an exploration on the functional pathway[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(8): 1210-1215.

图/表（结果） 4

2.1 实验动物数量分析实验选用KK-Ay小鼠24只和C57BL/6J小鼠8只，实验过程无脱失，全部进入结果分析。
2.2 运动对2型糖尿病小鼠心肌纤维化的影响在Masson染色中心肌间质胶原纤维呈蓝色，细胞质、血管平滑肌细胞等呈红色。由图1所示，与正常对照组相比，KK-Ay对照组小鼠心肌间质纤维化程度严重；与KK-Ay对照组相比，KK-Ay游泳组小鼠心肌间质纤维化程度变化不显著，KK-Ay跑台组小鼠心肌间质纤维化被显著改善；并且，与KK-Ay游泳组相比，KK-Ay跑台组小鼠心肌间质纤维化亦被显著改善。

2.3 运动对2型糖尿病小鼠心肌中相关因子mRNA表达的影响由图2可知，与正常对照组相比，KK-Ay对照组小鼠心肌中miR-29a mRNA表达下调(P < 0.05)，TGF-β1、Smad3、Smad4和Ⅰ型胶原mRNA表达均上调(P < 0.05或P < 0.01)，而Smad2 mRNA表达差异无显著性意义(P > 0.05)；与KK-Ay对照组相比，KK-Ay游泳组小鼠心肌中TGF-β1和Smad4 mRNA表达下调(P < 0.05)，miR-29a、Smad2、Smad3和Ⅰ型胶原的mRNA表达呈变化趋势但差异均无显著性意义(均P > 0.05)；KK-Ay跑台组小鼠心肌中miR-29a mRNA表达上调(P < 0.05)，TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4和Ⅰ型胶原mRNA表达均显著下调(均P < 0.05)；与KK-Ay游泳组相比，KK-Ay跑台组小鼠心肌中miR-29a mRNA表达上调(P < 0.05)，TGF-β1和Ⅰ型胶原mRNA表达显著下调(均P < 0.05)，但Smad2、Smad3和Smad4的mRNA表达变化均差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.4 运动对2型糖尿病小鼠心肌中相关因子蛋白水平的影响由图3可知，与正常对照组相比，KK-Ay对照组小鼠心肌中miR-29a蛋白水平显著降低(P < 0.05)，TGF-β1和Ⅰ型胶原蛋白水平显著升高(P < 0.01，P < 0.05)；与KK-Ay对照组相比，KK-Ay游泳组小鼠心肌中miR-29a蛋白水平呈升高趋势但差异无显著性意义(P > 0.05)，TGF-β1蛋白水平显著下降(P < 0.05)，而Ⅰ型胶原蛋白水平变化不显著(P > 0.05)；KK-Ay跑台组小鼠心肌中miR-29a蛋白水平显著升高(P < 0.05)，TGF-β1和Ⅰ型胶原蛋白水平亦显著下降(P < 0.01，P < 0.05)；与KK-Ay游泳组相比，KK-Ay跑台组小鼠心肌中miR-29a蛋白水平显著升高(P < 0.05)，TGF-β1和Ⅰ型胶原蛋白水平显著降低(均P < 0.05)。

2.5 运动对2型糖尿病小鼠心肌中相关因子蛋白表达的影响由图4所示，与正常对照组相比，KK-Ay对照组小鼠心肌中p-Smad2、p-Smad3和p-Smad4蛋白表达显著上调(P < 0.01)。与KK-Ay对照组相比，KK-Ay游泳组小鼠心肌中p-Smad2、p-Smad4和p-Smad3蛋白表达变化均不具有显著性(P > 0.05)；KK-Ay跑台组小鼠心肌中p-Smad2、p-Smad3和p-Smad4蛋白表达显著下调(P < 0.05)；与KK-Ay游泳组相比，KK-Ay跑台组小鼠心肌中p-Smad2、p-Smad3和p-Smad4蛋白表达均显著下调(P < 0.05)。

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引言

心肌纤维化(亦称心肌钙化)，其区别于冠状动脉粥样硬化和高血压所诱发的心肌性疾病，呈现心肌细胞肥大、间质纤维化等病理表征[1]。2型糖尿病心肌病作为临床上的常见病，其发病机制复杂，主要症状为早期心室舒张功能障碍，随后的心室收缩功能下降，最后为充血性心竭[2]。研究发现，心肌纤维化作为2型糖尿病心肌病发生的病理生理学基础，是导致2型糖尿病高病死率的原因之一[3]。然而，miR-29a作为microRNAs家族成员，其可负向调控转化生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)激活，进而作用于膜上具有丝氨酸-苏氨酸激酶活性的TGF-β1Ⅰ型(TβRⅠ)和Ⅱ型(TβRⅡ)跨膜受体。TβRⅡ，TβRⅠ被认为是活化素样受体激酶，磷酸化TGF-β1下游信号蛋白Smad2和Smad3后，并使其与Smad4形成磷酸化复合基团，并迅速转移入核，介导靶基因Ⅰ型胶原表达来转导TGF-β1信号，从而调控心肌纤维化发生、发展[4]。2型糖尿病伴发心肌间质纤维化，虽然miR-29a密切调控TGF-β1/Smads途径，但有关该信号通路调控2型糖尿病心肌间质纤维化的相关研究尚鲜有报道。miR-29a作为2型糖尿病小鼠纤维化心肌中差异表达的16个miRNAs之一，其编码与纤维化相关的细胞外基质，促进胶原蛋白分泌，介导2型糖尿病引起的心肌纤维化[5-6]。探究TGF-β1/Smads途径调控2型糖尿病心肌纤维化的相关研究中，发现吡格列酮改善2型糖尿病大鼠心肌纤维化的分子机制与该途径被抑制密切相关[7]。当2型糖尿病心肌中TGF-β1表达上调，Smad2/3磷酸化并上调心肌Ⅰ型胶原蛋白表达，导致心肌纤维化发生[8-9]。运动作为改善2型糖尿病心肌纤维化的重要手段，其调控机制与抑制TGF-β1/Smads途径和基质金属蛋白酶9蛋白表达密切相关[10-11]。miR-29a/TGF-β1途径是调控心肌纤维化发生的关键机制，那么探讨其在运动后2型糖尿病伴发纤维化心肌中的表达对于揭示运动改善2型糖尿病心肌纤维化作用机制显得尤为关键。基于以上，此次研究拟利用跑台和游泳两种运动方式对KK-Ay小鼠(自发性2型糖尿病小鼠)进行8周干预，并利用Masson染色、RT-PCR、ELISA和Western-bloting技术对相关指标进行检测，从形态结构、mRNA和蛋白3个层面上揭示2型糖尿病小鼠心肌纤维化程度变化以及miR-29a/TGF-β1途径在不同方式运动改善2型糖尿病小鼠心肌纤维化中的调控作用。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。
1.2 时间及地点实验于2019年9月至2020年5月在扬州大学体育学院实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 SPF级10周龄雄性KK-Ay小鼠(是在KK小鼠基础上转入黄色肥胖基因Ay而成的一种2型糖尿病小鼠模型)24只，SPF级雄性10周龄C57BL/6J小鼠8只，实验动物均购自北京华阜康生物科技有限公司，许可证号：SCXK京2014-0004。适应性喂养1周后，随机将KK-Ay小鼠分为KK-Ay对照组(8只)、KK-Ay游泳组(8只)和KK-Ay跑台组(8只)；C57BL/6J小鼠设为正常对照组(8只)。KK-Ay小鼠喂以高脂饲料(蔗糖14.0%、酪蛋白12.2%、猪油14.9%、预混料2.1%和麦芽糊精2.2%、繁殖鼠料54.6%)、C57BL/6J小鼠喂以标准饲料(高脂饲料和标注饲料均购自北京华阜康生物科技有限公司)。自由饮水，昼夜比12∶12。
1.3.2 试剂 miR-29a、TGF-β1(上海恒远生物科技有限公司)；Ⅰ型胶原(Abcam)；Ⅰ抗[p-Smad2(Ser465/Ser467)、p-Smad3 (Ser423/Ser425)、p-Smad4(Ser485/Ser491]均为CST产品；Ⅱ抗(上海生工)。
1.4 实验方法
1.4.1 实验动物训练正常对照组和KK-Ay对照组小鼠笼中自由活动。KK-Ay游泳组小鼠采用Ploug方案，进行中等强度游泳训练：第1周第1，2天游泳25 min、第3，4天游泳35 min、第5，6天游泳50 min，第2周开始每天游泳50 min，每周6 d，共8周[12]。游泳训练池规格为60 cm×60 cm×50 cm(长×宽×高)，水深40 cm，水温(30±2) ℃，无负重[13]。KK-Ay跑台组小鼠采用Bedford方案，进行中等强度跑台训练：第1周前第1，2天跑台训练25 min、第3，4天训练35 min、第5，6天训练50 min，速度均为14 m/min，第2周开始每天训练50 min，速度保持不变，每周6 d，共8周[14]。
1.4.2 实验取材 8周训练结束24-48 h内，取左心室室壁，生理盐水漂洗，除去血液，滤纸吸干水分后分为4部分(分别用于各指标检测)，置于1.5 mL离心管中，先于液氮速冻后再存于-80 ℃冰箱以备来检测相关指标。
1.4.3 Masson染色检测小鼠心肌纤维化程度心肌组织经 40 g/L多聚甲醛固定24 h后，乙醇梯度脱水、透化、浸蜡并进行石蜡包埋。然后，按6 μm标准进行切片。脱蜡、复水后，铬化处理并蒸馏水洗，用Regaud苏木精染液染核、水洗，Masson丽春红酸性复红液染色，2%冰醋酸水溶液浸洗并1%磷钼酸水溶液分化、苯胺蓝染色，0.2%冰醋酸水溶液浸洗。乙醇梯度脱水、二甲苯透明，封固。利用奥林巴斯荧光倒置显微镜进行拍照。
1.4.4 RT-PCR检测心肌相关因子miR-29、TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4、Ⅰ型胶原mRNA的表达取左心室壁，研磨后利用Trizol提取总DNA，严格按照Takara反转录和定量试剂盒说明书操作，将RNA反转为cDNA，利用已设计好的引物进行定量检测，见表1。miR-29a利用S-Poly(T) plus miRNA检测试剂盒进行提取和定量测定。内参为β-actin。

1.4.5 ELISA检测心肌中相关因子miR-29a、TGF-β1及Ⅰ型胶原蛋白水平心肌组织匀浆后，按14 000 r/min×10 min离心后，取上清，严格按照已购置miR-29a、TGF-β1和Ⅰ型胶原试剂盒和ELISA法相关步骤进行操作，采用Tecan Infinite F200/M200型多功能酶标仪分别在420，550 nm等波长处对3种蛋白水平的吸光度值进行检测，并计算各细胞因子蛋白水平。所有样本采用平行管测定。
1.4.6 Western-bloting检测心肌中相关因子p-Smad2、p-Smad3和p-Smad4蛋白的表达取心肌进行组织研磨。按14 000 r/min×
20 min于低温离心机中离心，取上清，利用BCA法测定蛋白含量。调整水平到同一标准后进行电泳、转膜。结束后，孵Ⅰ抗[p-Smad2(Ser465/Ser467)、p-Smad3(Ser423/Ser425)和p-Smad4(Ser485/Ser491)，稀释比例为1∶1 000]和Ⅱ抗，洗膜结束后利用Alpha凝胶成像系统进行显影拍照并利用自带软件进行相关数据分析。
1.5 主要观察指标 ①Masson染色检测小鼠心肌纤维化程度；② RT-PCR检测miR-29、TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4、Ⅰ型胶原mRNA表达；③ELISA检测miR-29a、TGF-β1及Ⅰ型胶原蛋白水平；④Western-bloting检测相关因子p-Smad2、p-Smad3、p-Smad4蛋白表达。
1.6 统计学分析利用Excel对相关检测数据进行统计后，并利用SPSS 20.0对正常对照组和KK-Ay对照组进行独立样本t检验，对KK-Ay对照组、KK-Ay游泳组和KK-Ay跑台组3组进行单因素方差分析。P < 0.05和P < 0.01分别表示差异有显著性意义和差异有非常显著性意义。

讨论

3.1 2型糖尿病小鼠心肌纤维化及运动作用的影响 2型糖尿病心肌病作为其重要并发症，病理表征呈现心肌间质纤维化，导致心功能不全甚至心力衰竭发生[15]。该领域是当前生命医学的焦点，当利用Masson染色法对2型糖尿病小鼠心肌进行染色时，发现小鼠心肌间质中胶原蛋白过量沉积，心肌细胞损伤严重，心肌间质纤维化明显[16]。Li等[17]在利用KK-Ay小鼠探究氧化应激对心肌细胞纤维化的影响时，发现钠葡萄糖共转运蛋白2激活2型糖尿病小鼠心肌细胞氧化应激水平，导致心肌间质中因胶原蛋白表达过多，纤维化发生。此次研究中，与正常对照组相比，KK-Ay对照组小鼠心肌Masson染色发现，其心肌间质纤维化程度严重，与前人研究结论相一致。分析其机制，与此次研究KK-Ay对照组小鼠心肌中miR-29a表达下调后可激活TGF-β1/Smads途径，从而促进Ⅰ型胶原表达和蛋白沉积密切相关；另外，2型糖尿病小鼠心肌细胞中Nrf2/ARE信号途径[18]、RhoA/Rho酶(ROCK)被激活后促进Ⅰ型胶原蛋白在心肌间质中沉积，从而导致心肌间质纤维化[19]。
运动是一种绿色、有效的改善2型糖尿病心肌纤维化手段，当对利用高脂喂养加腹腔注射小剂量链脲佐菌素构建的2型糖尿病大鼠模型进行运动干预后，发现12周、5 d/周递增负荷的游泳训练(第1周15 min，按15 min/周递增，直至90 min/d)可显著改善2型糖尿病大鼠心肌纤维化水平[20]。明文娟[11]研究证实，爬梯抗阻训练亦可显著改善2型糖尿病小鼠心肌纤维化程度。此次研究中，与KK-Ay对照组相比，KK-Ay游泳组小鼠心肌纤维化程度改善不显著，而KK-Ay跑台组小鼠的心肌纤维化程度显著改善，且与KK-Ay游泳组相比，KK-Ay跑台组心肌纤维化被显著改善。表明，与游泳运动相比，跑台运动可显著改善2型糖尿病小鼠心肌纤维化，这与前人研究发现游泳可显著改善2型糖尿病心肌纤维化存在差异。分析其原因，可能与此次研究采用的游泳模式的每次训练和持续总时间均较短有关。较之游泳运动，跑台运动对心肌所造成力学刺激可激活2型糖尿病小鼠心肌组织晚期糖基化终末产物水平、氧化应激和核因子κB p65蛋白表达水平以及抑制TGF-β1、肿瘤坏死因子α等关键因子表达[20-22]。然而，以上因子表达变化均抑制Ⅰ型胶原表达及其调控作用，减少Ⅰ型胶原蛋白分泌产生，从而改善2型糖尿病心肌纤维化程度。
3.2 运动对2型糖尿病小鼠心肌中miR-29a/TGF-β1途径的影响 miR-29a不仅可介导靶基因PPARδ/β调控心肌肥大，亦影响心肌纤维化发生。近来发现，miR-29a可与TGF-β1 N端信号肽作用并与膜上TβRⅡ胞浆区丝氨酸/苏氨酸激酶区结合，导致TβRⅠ的Gs位点磷酸化，促进下游Smad2和Smad3磷酸化并与Smad4形成磷酸化异源三聚体，转移入核后调控靶基因Ⅰ型胶原转录，改善心肌纤维化[23-24]。VARUN等[25]研究发现，Ⅰ型胶原作为TGF-β1/Smads途径下游靶基因，其可通过影响胶原蛋白在心肌间质中的合成、分泌和沉积来调控2型糖尿病心肌纤维化发生。然而，生命医学领域内有关miR-29a介导TGF-β1/Smads途径调控Ⅰ型胶原来影响2型糖尿病心肌纤维化的相关研究尚待补充。此次研究中，KK-Ay对照组小鼠心肌中miR-29a表达下调且TGF-β1、Smad3、Smad4和Ⅰ型胶原 mRNA表达上调，而Smad2 mRNA表达变化不显著；但是，p-Smad2和p-Smad3、p-Smad4的蛋白发生磷酸化被激活，且TGF-β1、Ⅰ型胶原蛋白水平显著升高。Smad2 mRNA表达和p-Smad2磷酸化水平变化差异，表明Smad2作用发挥是在其磷酸化后，而不是转录水平。以上研究结果提示，2型糖尿病小鼠心肌中miR-29a表达下调后，TGF-β1/Smad途径激活并上调靶基因Ⅰ型胶原表达，且该途径中Smad2/3/4磷酸化形成复合基团，这与前人研究发现其是在磷酸化水平上发挥作用相一致。当miR-29a/TGF-β1途径激活后促进心肌间质中Ⅰ型胶原蛋白表达，导致2型糖尿病小鼠心肌纤维化发生，这也解释了此次研究中的Masson染色结果变化。分析其机制，2型糖尿病小鼠心肌中miR-29a表达下调后激活TGF-β1/Smads途径与2型糖尿病小鼠心肌中维生素D3和胰岛素样生长因子表达下调有关[26-27]。维生素D3和胰岛素样生长因子可协同导致胰岛素受体失活，下调心肌中miR-29a表达并激活下游TGF-β1/Smads途径[28]，而敲除2型糖尿病小鼠心肌中miR-37和miR-133后，通过共刺激因子B7-H3抑制miR-29a表达[29]。Wu等[30]研究发现，KK-Ay小鼠的高糖环境可导致心肌中miR-29a表达下调，但其调控机制在此研究中并未阐述。
运动在改善2型糖尿病心肌纤维化上的作用已被前人研究和此次研究所证实[10，31]。miR-29a作为一类内源基因调控的非编码单链RNA分子，其可调控心肌纤维化发生[32]，后续研究发现其作用机制与介导的TGF-β1/Smads信号途径密切相关[33]。但有关运动通过影响2型糖尿病小鼠心肌中miR-29a/TGF-β1途径进而改善心肌纤维化的相关研究鲜有报道。此次研究中，与KK-Ay对照组相比，KK-Ay游泳组miR-29a mRNA表达和蛋白水平变化均不具有显著性；TGF-β1和Smad4 mRNA表达下调及TGF-β1蛋白水平下降，但其下游p-Smad2、p-Smad3和p-Smad4蛋白磷酸化变化及靶基因Ⅰ型胶原的mRNA和蛋白表达均不显著。说明，8周游泳运动对KK-Ay小鼠心肌中miR-29a/TGF-β1途径的作用不显著，TGF-β1出现显著变化可能与其存在其他生物学作用有关。在KK-Ay跑台组中，miR-29a mRNA表达和蛋白水平显著上升，TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4、Ⅰ型胶原 mRNA表达和TGF-β1、Ⅰ型胶原蛋白水平显著下降，并且p-Smad2、p-Smad3和p-Smad4蛋白磷酸化水平显著下调。当与KK-Ay游泳组相比时，发现KK-Ay跑台组小鼠心肌中miR-29a mRNA表达和蛋白水平显著上升，TGF-β1和Ⅰ型胶原 mRNA表达显著下调，Smad2、Smad3和Smad4的mRNA表达虽然不显著，但p-Smad2、p-Smad3和p-Smad4蛋白表达及TGF-β1、Ⅰ型胶原蛋白水平均显著下降。提示，与游泳运动相比，跑台运动可显著上调KK-Ay小鼠心肌中miR-29a表达，从而抑制TGF-β1及其下游Smad2、Smad3和Smad4磷酸化并形成异源三聚体，使得心肌中Ⅰ型胶原表达下调。以上结果充分解释了此次研究中KK-Ay游泳组和KK-Ay跑台组的Masson染色结果变化。究其原因，同等运动量下，跑台运动改善2型糖尿病小鼠胰岛素敏感性的作用效果显著优于游泳[34]，胰岛素敏感性的提高激活胰岛素受体，进而上调miR-29a并抑制TGF-β1/Smads[35]；并且，跑台运动可通过下调2型糖尿病小鼠心肌中脂肪因子——CTRP6表达直接作用于miR-29a[36]；亦可通过激活自噬关键因子Bax、Bcl-2蛋白来活化p53，而p53可通过其羟基端SH3区域来上调miR-29a[37-38]。运动在改善2型糖尿病小鼠能量代谢紊乱上具有重要作用，而AMPK作为调控能量代谢关键因子，表达下调后其α亚基N端Ser/Thr激酶区的一保守苏氨酸(Thr-172)位点与miR-29a的C端结合并可激活其在心肌中表达，从而抑制TGF-β1/Smads途径，减少胶原蛋白分泌产生，进而改善心肌纤维化。
结论：2型糖尿病小鼠心肌中miR-29a表达下调可激活TGF-β1/Smad途径，导致心肌纤维化发生。跑台运动可上调2型糖尿病小鼠心肌中miR-29a后抑制TGF-β1/Smad途径，减少胶原蛋白产生来改善心肌纤维化，游泳运动作用不显著。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

跑台运动改善自发性2型糖尿病模型小鼠心肌纤维化中的作用途径

Treadmill exercise improves the myocardial fibrosis of spontaneous type 2 diabetic mice: an exploration on the functional pathway

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