2.1   实验动物数量分析   选取雄性SD大鼠55只，分为4组，其中正常组10只，在整个实验过程中无脱失；链脲佐菌素20，35，50 mg/kg分别15只，用于2型糖尿病建模。其中链脲佐菌素20，35 mg/kg组在造模过程中分别死亡3只，链脲佐菌素50 mg/kg组在造模过程中死亡5只，剩余34只全部纳入实验结果进行分析。
2.2   不同剂量链脲佐菌素对成模率和存活率的影响   3个模型组入组各15只大鼠，在第4周链脲佐菌素注射后，链脲佐菌素20 mg/kg组分别于第5，6，7周死亡大鼠1只，至第8周检测时存活12只；链脲佐菌素35 mg/kg组于第5周死亡大鼠2只，第7周死亡1只，至第8周检测时存活12只；链脲佐菌素50 mg/kg组于第5周死亡大鼠3只，第6，7周各死亡1只，至第8周检测时存活10只。相较于链脲佐菌素35 mg/kg组(中间剂量)，链脲佐菌素50 mg/kg组(高剂量)大鼠存活率较低(P < 0.05)。而成模率方面，相较于链脲佐菌素35 mg/kg组，链脲佐菌素20 mg/kg组(低剂量)大鼠的成模率较低(P < 0.05)，见表1。通过统计分析发现，链脲佐菌素35 mg/kg组成模率和存活率均较高，稳定性较好。



2.3   一般情况   与正常组相比，模型组大鼠建模前初始体质量无明显差异。正常组大鼠体质量增加，血糖平稳；模型组大鼠在链脲佐菌素注射3 d后，出现多饮、多尿、多食的典型糖尿病症状。第4 周时模型组大鼠精神萎靡，活动度降低，体质量明显升高(P < 0.01)，空腹血糖升高(P < 0.01)；与正常组大鼠相比，第8周时模型组大鼠皮毛光泽度晦暗，活动度及精神状态明显变差，体质量下降(P < 0.05)，空腹血糖明显升高(P < 0.01)，均≥16.7 mmol/L。链脲佐菌素20，35，50 mg/kg组间体质量相比，差异无显著性意义(P > 0.05)；但在第4周时，链脲佐菌素50 mg/kg组的血糖明显高于另外两组(P < 0.05)；第8周时，链脲佐菌素35 mg/kg组血糖水平上升，与链脲佐菌素50 mg/kg组相比差异无显著性意义(P > 0.05)，仅链脲佐菌素20 mg/kg组血糖水平明显低于链脲佐菌素50 mg/kg组(P < 0.05)，见表2。



2.4   胰岛素水平、胰岛素抵抗指数及糖耐量检测结果   与正常组相比，模型组大鼠的血清胰岛素水平和胰岛素抵抗指数均明显升高(P < 0.01)；与链脲佐菌素50 mg/kg组相比，链脲佐菌素20 mg/kg组胰岛素水平和胰岛素抵抗指数均明显降低(P < 0.05)，链脲佐菌素35 mg/kg组仅胰岛素抵抗指数较低(P < 0.05)，见表3。



与正常组相比，模型组大鼠各时间点的血糖和曲线下面积值均显著升高(P < 0.01)，但链脲佐菌素20，35，50 mg/kg组间相比差异无显著性意义(P > 0.05)，见表4。



2.5   尿流动力学结果   与正常组相比，链脲佐菌素20，35，50 mg/kg组大鼠的膀胱容量、残余尿量增加(P < 0.05)，最大膀胱内压明显降低(P < 0.01)，膀胱顺应性增大较明显(P < 0.01)，但链脲佐菌素20，35，50 mg/kg组间相比差异无显著性意义，见表5。



从典型膀胱压力曲线图可见，随着生理盐水灌注，正常组大鼠储尿期压力无明显变化，曲线平稳，排尿期逼尿肌反射正常；而链脲佐菌素20，35，50 mg/kg组模型大鼠排尿期容量阈值明显延迟，排尿前(充盈期)有不稳定的自发收缩，出现多次不规律的较小的压力波动，曲线不平稳，表明这3组大鼠存在膀胱逼尿肌收缩失稳或感觉过敏，见图1。



2.6   膀胱一般情况及湿质量   正常组大鼠膀胱呈梨形，膀胱壁光滑有弹性，残余尿少见；而链脲佐菌素20，35，50 mg/kg组模型大鼠膀胱大体观察可见明显增大，膀胱壁增厚弹性降低。与正常组大鼠相比，链脲佐菌素20，35，50 mg/kg组模型大鼠膀胱湿质量显著增加(P < 0.01)；与链脲佐菌素20 mg/kg组相比，链脲佐菌素35 mg/kg和50 mg/kg组大鼠膀胱湿质量较大(P < 0.05)，见表6。



2.7   光镜下膀胱结构变化   正常组可见肌纤维束排列清晰整齐，肌束间充满弹性纤维，肌细胞大小和形态正常，结构紧密。而链脲佐菌素20，35，50 mg/kg组细胞间隙明显增大，形态各异，肌纤维排列紊乱、层次欠清晰，组织水肿明显，伴血管充血，呈微血管破裂出血趋势。详见图2，3。

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糖尿病作为一种代谢性疾病已在世界范围内广泛流行，并具有多种并发症，包括视网膜病变、神经病变和肾功能受损等[1]。据统计，全球约有4.15亿人患有糖尿病，占世界成年人口的1/11，预计到2040年，全球糖尿病患者将增至6.42亿[2]。作为最常见的糖尿病类型，2型糖尿病的特点是持续性高血糖，这是由胰岛素分泌不足和靶细胞对胰岛素敏感性降低引起的[3]，约80%的患者有泌尿系统症状，包括尿潴留、尿失禁、尿频和尿急等[4]。糖尿病神经源性膀胱(diabetic neurogenic bladder，DNB)是泌尿系统一种常见的糖尿病性神经病变表现，其主要特征是膀胱感觉神经受损，逼尿肌收缩力降低，膀胱容量和残余尿量增加，是糖尿病多见又难缠的并发症[5]。目前研究认为，DNB的发生发展与糖尿病导致的膀胱周围末梢神经受损、继发的神经细胞凋亡、神经轴突变性、神经纤维脱髓鞘及神经再生修复障碍有关[6]。据文献资料显示，糖尿病患者DNB的患病率为40%-80%，即使在血糖控制良好的情况下，DNB的发生率仍为25%，进一步的研究表明，15年以上糖尿病患者DNB的发病率高达50%[7-9]。虽然DNB在亚太地区的发病率不断上升，但由于其发病机制不明确，尚无有效的治疗方法[10]，故给患者生活质量和社会经济都带来了巨大的压力。此外，有关DNB的自然史和生理病理学信息非常有限，实际上对DNB的研究明显落后于糖尿病的其他并发症，从而阻碍了DNB合适治疗方法的研发[11]。因此，建立一种合适的DNB动物模型，对探究DNB的发病机制和治疗方法具有重要意义。链脲佐菌素高脂饮食诱导的糖尿病大鼠模型常被用于研究2型糖尿病的并发症和降糖疗效，已被证明是最合适的2型糖尿病大鼠模型[12-14]。一些关于DNB的研究已经在1型糖尿病的动物模型中进行，但应用链脲佐菌素高脂饮食方法构建稳定的2型糖尿病DNB大鼠模型报道较少[15]。对于DNB大鼠模型的制备，目前尚未有统一的标准造模方法，并且对所构建的模型未进行深入的评价研究。故此次实验旨在通过链脲佐菌素高脂饮食法构建2型糖尿病DNB大鼠模型，并对该模型从多方面进行鉴定，以期为DNB的临床治疗提供理论基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1   设计   随机对照动物实验，各组之间指标比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD检验。
1.2   时间及地点   实验于2020年3月至2021年2月在成都中医药大学附属医院动物实验中心完成。
1.3   材料
1.3.1   实验动物   SPF级雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，13-15周龄，体质量180-220 g，购自成都达硕实验动物公司，许可证号：SYXK(川)2019-189。将大鼠置于标准条件下，(21±       2) ℃，40%-70%相对湿度，12 h明暗循环，食物和饮用水可自由摄取。
1.3.2   主要试剂及仪器   链脲佐菌素(美国Sigma公司)，柠檬酸缓冲液(美国Sigma公司)，戊巴比妥钠(美国Sigma公司)，血糖仪及血糖试纸(美国强生公司)，胰岛素 ELISA检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)，尿动力仪及微量灌注泵(PHD22/2000，美国Harvard仪器)，BP210S 电子天平(赛多利斯有限公司)，TGL-16G 台式离心机(上海安亭仪器厂)，高速低温离心机(德国HERAEUS)，生理压力传感器(美国Harvard仪器)。
1.4   方法
1.4.1   分组及造模   适应性喂养1周后，将55只大鼠按随机数字表法分为正常组(n=10)和模型组(n=45)。禁食20 h后，检测各组大鼠尾静脉空腹血糖。正常组大鼠予以常规饲料喂养，成分为玉米、豆粕、鱼粉、酵母粉、面粉、食盐、植物油、维生素和矿物元素等(北京科澳协力饲料有限公司)。模型组大鼠高脂饲料喂养以诱导胰岛素抵抗，成分为常规饲料58.5%，胆固醇1%，蛋黄粉10%，蔗糖20%，猪油10%，胆酸钠0.5%(北京科澳协力饲料有限公司)。4周后(实验第28天)，根据一次性腹腔链脲佐菌素注射剂量的不同，模型组再分为链脲佐菌素20，35，50 mg/kg组，分别单次腹腔注射相应剂量链脲佐菌素(以pH 4.5柠檬酸缓冲液1∶1 配制成 10 g/L 的溶液)建模，正常组大鼠腹腔注射等剂量的柠檬酸缓冲液。所有实验程序均按照国家科学技术部制定并经成都中医药大学附属医院医学伦理委员会批准的《实验动物护理和使用建议》进行。
1.4.2   成模标准   根据相关研究报道，8周后空腹血糖≥ 16.7 mmol/L且尿流动力学检测显示膀胱容量增高、最大膀胱内压降低、残余尿量增多、膀胱顺应性升高，膀胱质量增高，光镜下肌纤维排列紊乱，纤维组织增生，细胞间隙增大、水肿，血管充血破裂，炎细胞浸润等均提示2型糖尿病DNB模型大鼠造模成功[16-20]。

1.5   主要观察指标
1.5.1   一般情况观察   观察动物的摄食量、饮水量、尿量、精神状态、皮毛光泽度，在 0，4，8 周分别记录链脲佐菌素20，35，50 mg/kg组和正常组大鼠的体质量及空腹血糖。
1.5.2   血清胰岛素及糖耐量检测   第8周采用ELISA法测定血清胰岛素水平，并计算胰岛素抵抗指数：空腹血糖水平 (mmol/L)×空腹胰岛素水平(mIU/L)/22.5[21] 。再进行糖耐量检测，灌胃给予50%葡萄糖溶液2 g/kg，使用血糖仪检测大鼠灌胃后0，15，30，60，120 min的血糖值，计算葡萄糖曲线下面积[22]。
1.5.3   尿流动力学检测   8周后(实验第56天)检测正常组大鼠及链脲佐菌素20，35，50 mg/kg组中的2型糖尿病模型大鼠(以空腹血糖≥16.7 mmol/L为成模标准)。采用戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，大鼠仰卧位固定，按压腹部以排空膀胱内尿液。通过尿道缓慢将导尿管插入膀胱，导尿管经三通阀分别与生理压力传感器和微量灌注泵相连。以  0.3 mL/min的速率将生理盐水注入膀胱，进行充盈性膀胱内压检测。记录并比较各组尿流动力学参数：膀胱容量、最大膀胱内压、残余尿量、膀胱顺应性。
1.5.4   膀胱湿质量检测   尿流动力学检测结束后，迅速切除膀胱，肉眼观察膀胱大体情况，并使用电子天平进行称质量。
1.5.5   苏木精-伊红染色   膀胱湿质量检测结束后，解剖出膀胱组织，并于体积分数10%中性甲醛溶液固定24 h，石蜡包埋，苏木精-伊红染色。先在100倍视野下观察膀胱组织大体形态，后在400倍视野下观察逼尿肌结构。
1.6   统计学分析   数据处理采用SPSS 17.0软件，所有结果以x±s表示。各组之间体质量、血糖、胰岛素、胰岛素抵抗指数、糖耐量、膀胱湿质量、尿流动力学参数等指标比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD检验，以P ≤ 0.05为差异有显著性意义。

糖尿病是内分泌系统最常见的慢性疾病，其中2型糖尿病患者数高达90%[23]。DNB作为常见的2型糖尿病并发症，其发病率为25%-87%[24]。DNB若治疗不当，轻则严重影响患者生活质量，重则可能导致包括败血症和急性肾功能衰竭等在内的严重全身疾病[25]，但由于其发病机制尚不明确，故缺乏有效的防治手段。目前的治疗方案仅是在控制血糖的基础上进行保守干预，营养神经抗氧化以缓解泌尿系统损伤[4]，但疗效欠佳；而现涉及DNB研究的动物模型构建又不够准确、高效，因此构建一种稳定高效的2型糖尿病DNB模型以揭示DNB的发病机制，筛选有效的治疗手段。
2型糖尿病的病理基础及主要特征是胰岛素抵抗和胰岛细胞损伤导致的胰岛素分泌相对不足[26]。目前公认的是，链脲佐菌素注射仅能特异性损伤胰岛β细胞从而引起胰岛素分泌缺陷以诱发糖尿病[27]，但其发病机制和病理变化更接近1型糖尿病，与2型糖尿病有着明显差异。2 型糖尿病是由于包括高脂饮食在内的多种原因诱发的胰岛素抵抗，继而不可逆地损伤了胰岛β细胞，从而引起胰岛素分泌从相对不足向绝对不足转变。目前研究认为2型糖尿病造模所需的链脲佐菌素注射剂量与高脂饮食喂养时间有关，高脂饮食诱导的时间越久，引起的胰岛素抵抗越明显，需要的链脲佐菌素剂量也就越少[28]。因而，此次研究采用高脂饲料喂养结合链脲佐菌素单次腹腔注射的方法，先诱导大鼠超重肥胖产生胰岛素抵抗，再加单次链脲佐菌素注射以损伤胰岛β细胞导致胰岛素分泌缺陷，这样结合诱导出的大鼠模型能更好地模拟人类 2 型糖尿病的典型发病机制及生理特征。
此次研究采用了链脲佐菌素高脂饮食方法，对SD大鼠进行了为期8周的2型糖尿病DNB造模干预。从一般情况结果可见，模型组大鼠在高脂饲料喂养4周后，出现多饮、多尿、多食的症状，皮毛光泽度日渐晦暗，体质量急剧增长，明显高于正常组大鼠(P < 0.01)，说明高脂饲料喂养后，模型组大鼠已经具备了2型糖尿病的病理基础，出现了明显的肥胖。在链脲佐菌素注射4周后，模型组大鼠体质量下降，低于正常组(P < 0.05)，出现了消瘦症状，符合糖尿病“三多一少”的重要体征。其中，链脲佐菌素50 mg/kg组第4周的血糖明显高于链脲佐菌素20 mg/kg及35 mg/kg组，这可能是由于链脲佐菌素高剂量(50 mg/kg)注射后引起的。并且，造模前正常组和模型组大鼠血糖无明显差异，在链脲佐菌素高脂饮食干预后，模型大鼠血糖、胰岛素和胰岛素抵抗指数均明显高于正常组(P < 0.01)，各时间点的血糖和曲线下面积值均显著升高(P < 0.01)。综合说明，2型糖尿病模型大鼠造模成功。
尿流动力学作为DNB诊断和疗效评价的金标准，能够科学地对膀胱功能状态进行客观、定量评估。此次研究通过尿流动力学检查发现，造模8周后，模型组大鼠出现膀胱容量和残余尿量增多，膀胱内压减小，顺应性升高。这与临床上DNB患者的尿流动力学结果一致，提示逼尿肌收缩无力，反射减弱[29]。这可能是由于长期高血糖环境引起的Na+-K+-ATP酶代谢紊乱，神经轴突受损，神经代谢功能失调，膀胱感觉下降，导致膀胱容量增多；由于神经突触功能被破坏，诱发无序的肌电反应，膀胱逼尿肌-括约肌协调作用失调，排尿困难，出现膀胱残余尿量增多；同时，由于肌细胞代谢障碍，膀胱收缩力降低，顺应性增加[30]。相关研究也发现糖尿病大鼠膀胱逼尿肌条的兴奋性减弱，收缩力小于正常大 鼠[31]，膀胱顺应性升高，残余尿增多、膀胱容量增大以及膀胱湿质量增加[32]，这些均与此次研究结果一致。此次研究通过测定膀胱湿质量来判断2型糖尿病大鼠是否发生膀胱肥大，3组模型大鼠膀胱质量均较正常组显著增加(P < 0.01)，这可能是由于糖尿病动物为了适应膀胱容量增加而出现的物理性代偿，或者高糖环境下氧化应激剧增的启动过程[16]。最新研究发现，DNB大鼠光镜下膀胱逼尿肌肌束紊乱、断裂，结构疏松，间隙明显扩大，水肿，淋巴细胞浸润，肌束间胶原纤维减少，小血管充血[33]。与此次研究苏木精-伊红染色结果一致，模型组大鼠较正常组大鼠肌纤维排列紊乱并伴有明显的血管充血。总得来说，2 型糖尿病影响患者的膀胱功能，产生神经源性病变，导致各种膀胱功能障碍，如急迫、频繁、失禁、排尿困难和尿潴留[34]。此次研究在链脲佐菌素高脂饮食诱导的模型大鼠中也可以观察到类似的变化，形态学和功能学均提示膀胱受损、逼尿肌功能紊乱，证明2型糖尿病DNB大鼠模型造模成功。
先前有研究报道，高脂饲料喂养6 至8 周后腹腔注射小剂量的链脲佐菌素(30-35 mg/kg)，2型糖尿病肾病动物模型的成模率可达79%[35]；大鼠高脂饲料喂养结合小剂量的链脲佐菌素(30-35 mg/kg)注射4个月后可复制人类2型糖尿病神经源性膀胱模型[36]；大鼠高脂饲料长期喂养结合链脲佐菌素注射(35 mg/kg)诱导2 型糖尿病模型成模率可达87.5%[37]。由于链脲佐菌素给药途径、模型建立标准、模型种类的差异都会造成所需链脲佐菌素的剂量不同[38]。因此，为了探究2型糖尿病DNB模型的最佳造模剂量，此次实验设立了高中低3个链脲佐菌素剂量组，结果发现链脲佐菌素35 mg/kg组的存活率和成模率均较高，成模率可达80%。高脂饮食已被用于建立啮齿类动物代谢综合征或2型糖尿病前期模型，其症状为肥胖、胰岛素抵抗和糖耐量受损。   35 mg/kg的链脲佐菌素注射也是糖尿病动物造模的常用剂量，但是，这两者造模都很难发展成典型的2型糖尿病[39-40]。因此，在前人研究基础上[41-42]，此次研究使用结合了高脂饮食诱导胰岛素抵抗和链脲佐菌素低剂量35 mg/kg注射以减少胰岛素合成和分泌的动物模型，更好的模仿人类2型糖尿病的症状，高效稳定的诱导并发症DNB的出现。此次研究说明高脂饮食8周结合链脲佐菌素(35 mg/kg)单次腹腔注射大鼠耐受性良好，是2型糖尿病DNB造模较为简便、稳定的方法，对进一步研究该病的机制及新药开发具有非常重要的意义。
展望：尿流动力学检测是DNB诊断的常用方法，但该法有创、成本较高、操作难度较大，因此急需一种简便的检测手段用于基础实验。神经源性膀胱指南提出经腹部B超测定膀胱残余尿量是最简单可行的膀胱功能评估手段，经腹部超声检测用来评估膀胱整体功能及尿潴留情况，会更适合作为DNB的初筛检测[43]。目前经腹部超声检测多用于大鼠原位膀胱癌的鉴定[44]，涉及DNB的动物超声检测研究较少。经腹部超声测量作为大鼠活体检测的可靠方法，若运用于DNB的动物研究，可以更直观地评估膀胱的形态学变化(膀胱壁厚度、状态及膀胱形状、大小、回声异常情况等)。
目前苏木精-伊红染色仍为DNB形态学诊断的基本技术，但此法无法精确判断DNB逼尿肌受损与发病时间的关系。有研究采用电镜观察DNB大鼠膀胱逼尿肌超微结构的变化，发现4周时逼尿肌平滑肌细胞间隙缩小，神经细胞减少，线粒体肿胀甚至消失，并且这种变化至第12周时加重[45]。由此推测糖尿病早期也可能出现逼尿肌功能失常，随着病程延长，神经纤维受损严重，神经肌肉传导障碍，逼尿肌收缩功能紊乱，最终发展为DNB。但由于影响神经和膀胱功能的因素复杂多变，因此DNB在糖尿病早期并无明显症状，给DNB的防治带来了极大的困难。而采用电镜观察DNB模型大鼠的膀胱逼尿肌超微结构，能够为早期无症状DNB提供科学准确的形态学分析。对界定DNB分期，研究DNB进展与具体时间的相关性提供依据，可作为诊断亚临床型DNB的佐证。
出人意料的是，关于DNB动物模型膀胱逼尿肌在体外的收缩和舒张反应研究甚少，尤其是在2型糖尿病和抗糖尿病治疗中[46]。虽然在多种糖尿病动物模型中，膀胱收缩与舒张功能的紊乱都有报道，但目前尚不清楚这些差异是反映了动物模型、物种或年龄的差异，还是仅仅反映了研究结果的有限稳健性[47]。已有研究使用电场刺激法测定正常大鼠和糖尿病大鼠膀胱肌条的神经源性收缩反应[48]。因此，进一步的研究可以采用电生理方法检测糖尿病动物模型膀胱逼尿肌条离体的活性和收缩力，以期为DNB动物模型组织工程研究提供新的思路。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：
糖尿病神经源性膀胱：是泌尿系统一种常见的糖尿病性神经病变表现，其主要特征是膀胱感觉神经受损，逼尿肌收缩力降低，膀胱容量和残余尿量增加。其发生发展与糖尿病导致的膀胱周围末梢神经受损、继发的神经细胞凋亡、神经轴突变性、神经纤维脱髓鞘及神经再生修复障碍有关。
评价建模方法的意义：糖尿病神经源性膀胱的发病率不断上升，但其发病机制不明确，相关自然史和生理病理学信息匮乏，科学研究明显落后于糖尿病其他并发症，尚无有效的治疗方法，故给患者生活质量和社会经济都带来了严重的负担。因此，构建一种稳定高效的2型糖尿病神经源性膀胱模型对促进临床治疗手段的筛选极具意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

糖尿病神经源性膀胱是泌尿系统一种常见的糖尿病性神经病变表现，其主要特征是膀胱感觉神经受损，逼尿肌收缩力降低，膀胱容量和残余尿量增加。随着受泌尿系统功能障碍困扰的2型糖尿病患者数量剧增，认识到DNB是糖尿病多见又难缠的并发症是至关重要的。目前研究认为，DNB的发生发展与糖尿病导致的膀胱周围末梢神经受损，继发的神经细胞凋亡、神经轴突变性、神经纤维脱髓鞘及神经再生修复障碍有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程#br#

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