2.1  实验动物数量分析  纳入健康SPF级SD大鼠25只，实验过程中排除不符合血糖标准的大鼠3只和因高血糖死亡的大鼠4只，最终18只纳入结果分析。 2.2  RT-PCR检测各组大鼠肾脏组织中MicroRNA-130b的表达水平  糖尿病肾病+1,25(OH)₂D3组及糖尿病肾病+花生油组MicroRNA-130b的表达水平明显低于正常对照组(1.05±0.19，0.35±0.22，1.69±0.29，P < 0.01)；糖尿病肾病+1,25(OH)₂D3组MicroRNA-130b水平明显高于糖尿病肾病+花生油组(P < 0.01)，见图1。



2.3  RT-PCR、Western blot及免疫组织化学检测各组大鼠肾脏组织中转化生长因子β1的表达  糖尿病肾病+ 1,25(OH)₂D3组及糖尿病肾病+花生油组转化生长因子β1 mRNA及蛋白的表达明显高于正常对照组(P < 0.01)；糖尿病肾病+1,25(OH)₂D3组转化生长因子β1 mRNA及蛋白的表达明显低于糖尿病肾病+花生油组(P < 0.01)见表2，图2-4。

2.4  肾脏组织形态学及病理学观察 2.4.1  苏木精-伊红染色结果显示，正常对照组肾小球、鲍曼囊腔及肾小管形态规则  糖尿病肾病+1,25(OH)₂D3组肾小球形态较规则，细胞数增多，肾小球鲍曼囊腔逐渐缩小，肾小管水肿；糖尿病肾病+花生油组肾小球形态不规则，鲍曼囊腔壁层及脏层粘连，肾小管水肿伴部分坏死，见图5。



2.4.2  Masson染色结果  正常对照组大鼠肾脏呈大量红染的正常肾脏组织；糖尿病肾病+1,25(OH)₂D3组大鼠肾脏组织呈局灶状蓝染的胶原纤维沉积；糖尿病肾病+花生油组肾脏组织内出现大量蓝染的胶原纤维和少量红染的正常肾脏组织，见图6。

糖尿病肾病是长期高血糖状态引起的肾脏组织的病变，是造成终末期慢性肾病肾功能衰竭的最主要因素，其肾脏的主要改变包括肾小球的超滤过和肾小球肥大、肾小球基膜的增厚、系膜基质的沉积以及尿蛋白排泄率的增加，最终发展成为肾小球硬化^[1-2]。而转化生长因子β1 (transforming growth factor β1，TGF-β1)则在细胞外基质沉积肾脏纤维化的过程中发挥重要作用，可通过各种细胞内信号蛋白激酶和细胞因子促进纤维化的产生^[3-5]。1,25(OH)₂D3具有抑制肾素血管紧张素系统、抗炎、减少蛋白尿作用，可通过调节转化生长因子β1改善糖尿病肾病肾脏的纤维化程度^[6-7]。目前国内外研究显示，MicroRNA在多种肾脏疾病中起重要调节作用,它是一类内源性非编码的单链小分子RNA，其长度为19-24个核苷酸，是目前最大的真核非编码调控RNA基因家族，可以通过结合目的mRNA的3’端非编码区(3’-UTR)来阻滞蛋白翻译或转录。约60%的人类蛋白质编码基因受到miRNA的调控^[8]，并参与糖尿病肾病纤维化过程^[9-10]。其中MicroRNA-130家族与多种器官肿瘤、脂肪细胞的分化、脑卒中等病变有关^[11-13]，MicroRNA130a-3p可抑制肝星状细胞活化阻止非酒精性肝纤维化过程^[14]。        

近期研究表明，血清中MicroRNA-130b的高表达可以抑制转化生长因子β1、结缔组织生长因子等促纤维化因子在人体内的表达，从而防止肾脏纤维化，而2型糖尿病合并肾脏损伤患者血清中的MicroRNA-130b表达水平下降，表明了血清中的MicroRNA-130b有可能对2型糖尿病患者肾脏的损伤具有调控作用^[15-16]。MicroRNA-130b还可调节肾小球系膜细胞中转化生长因子β1诱导的糖尿病肾病肾脏的纤维化过程^[17]。为改善糖尿病肾病患者的预后状况，探索糖尿病肾病的致病机制，为治疗糖尿病肾病提供新的思路，研究将链脲佐菌素诱导的2型糖尿病肾病大鼠与正常组大鼠进行比较^[18]，观察糖尿病肾病大鼠组与正常大鼠组肾脏组织中MicroRNA-130b、转化生长因子β1及纤维化程度是否存在变化，应用1,25(OH)₂D3干预糖尿病肾病大鼠后，探讨1,25(OH)₂D3是否影响其MicroRNA-130b、转化生长因子β1的表达水平及改善糖尿病肾病肾脏纤维化程度。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  随机对照动物实验。

1.2   时间及地点  实验于2018年5月到2019年1月在新疆医科大学动物实验中心及新疆医科大学临床研究院代谢性疾病实验室完成。

1.3  材料  健康清洁级雄性SD大鼠,体质量180-220g,由武汉云克隆科技股份有限公司提供,动物生产和使用许可证号分别为DCXR(鄂)2018-0021；SYXK(鄂)2013-0069。

1.4  实验方法

1.4.1  造模方法及模型构建  25只健康清洁级雄性SD大鼠，适应性喂养1周后，随机分为正常对照组6只，糖尿病肾病模型组19只。

正常对照组给予普通饲料；糖尿病肾病模型组给予高脂高糖饲料(购自北京博泰宏达生物技术有限公司)喂养8周，待体质量增长到400-450 g时腹腔注射链脲佐菌素      30 mg/kg，后继续予高脂高糖饲料喂养，3 d后尾静脉取血，测随机血糖≥16.7 mmol/L，提示糖尿病造模成功^[19]。持续给予糖尿病肾病模型组高脂高糖饲料喂养及血糖监测，4周后24 h尿白蛋白排泄率>20 mg且尿糖阳性提示糖尿病肾病造模成功^[5]。在糖尿病肾病大鼠模型组中，注射链脲佐菌素后血糖水平不符合造模标准3只，因高血糖死亡4只。将患有糖尿病肾病的12只模型大鼠随机分为2组，每组均6只：糖尿病肾病+1,25(OH)₂D3组给予骨化三醇[(1,25(OH)₂D3溶于0.05 mL花生油，0.03 μg/(kg·d)]；糖尿病肾病+花生油组给予等量的花生油灌胃。37 d后麻醉下处死大鼠，留取大鼠肾脏，4 ℃生理盐水洗净、称质量，将肾脏组织放入保存液中，于-80 ℃冰箱中保存。

(1)转化生长因子β1 mRNA表达水平：PCR反应总体系20 μL，PCR扩增条件：95 ℃变性10 min，60 ℃退火1 min，95 ℃延伸15 s，40个循环，每个样本设3复孔，内参照β-actin。

(2)MicroRNA-130b表达水平：PCR反应总体系20 μL，PCR扩增条件：94 ℃变性15 min，55 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，40个循环，每个样本设3复孔,内参照has-U6 (TIANGEN公司)。

实验结果由Bio-Rad荧光定量分析软件读取，各组中转化生长因子β1的mRNA及MicroRNA-130b的表达水平的定量计算用2^-∆∆Ct来表示(CT为循环数)。

1.4.3  Western blot检测大鼠肾脏组织转化生长因子β1的表达  取适量液氮冻存的大鼠肾脏组织，加入含磷酸酶抑制剂和蛋白酶的裂解液，超声破碎后在4 ℃下14 000 r/min离心15 min，收集上清液，BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度，取变性蛋白20 μg/孔，10%的十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳后按湿转法将产物转印到聚偏氟丙烯(PVDF)膜上，使用含体积分数5%牛血清蛋白室温条件下封闭2 h，加入一抗(转化生长因子β 1∶1 000；GAPDH  1∶5 000)在4 ℃条件下孵育过夜，TBST洗膜3次后加入HRP标记IgG(1∶10 000)在室温条件下孵育2 h，洗膜3次，采用高敏化学发光法(ECL)处理后用凝胶定量分析系统检测蛋白含量，以所得条带的吸光度与内参照GAPDH吸光度的比值代表表达量。

1.4.4  肾脏组织病理学及免疫组织化学染色

(1)肾脏形态学及病理学观察：肾脏组织浸泡于40 g/L多聚甲醛中固定48 h后，常规石蜡包埋、切片，行苏木精-伊红染色，着重观察肾小球、肾小囊及肾小管的形态改变。采用Masson染色，光镜下观察肾脏结构及肾脏纤维化程度，若肾组织呈现蓝染，则证明该区域存在肾脏纤维化，若呈红染，则提示为正常肾脏组织。

(2)各组大鼠肾脏皮髓质组织转化生长因子β1的蛋白表达水平：肾组织标本固定48 h，石蜡包埋，免疫组织化学操作依说明书进行，采用PBS代替一抗作为阴性对照，阳性着色为棕黄色颗粒。

1.5  主要观察指标  ①各组大鼠肾脏组织中MicroRNA- 130b的表达水平；②各组大鼠肾脏组织中转化生长因子β1 mRNA及蛋白的表达水平；③各组大鼠肾脏组织形态学变化及纤维化程度。

转化生长因子β1是常见的致纤维化因子，可调节细胞的增生和分化以及细胞外基质(ECM)的生成,在糖尿病肾病中起着重要的作用^[20-23]。近期有研究发现中国人群中的2型糖尿病及糖尿病肾病患者转化生长因子β1高水平与2型糖尿病及2型糖尿病肾病的易感性及蛋白尿相关，且转化生长因子β1的T等位基因和TT基因型是2型糖尿病肾病发病的保护因子，CC基因型是2型糖尿病肾病易感性的危险因子^[24]。MicroRNA现成为近年来研究的热点，可抑制靶基因的表达，并逐渐成为早期糖尿病肾病的治疗靶点^[25-27]。目前MicroRNA-130b在多类肿瘤领域的研究较为广泛，如膀胱癌、胶质瘤等，可能成为研究的潜在治疗靶点^[28-29]。近期有研究提出RAB34与MicroRNA-130b可作为胰腺癌的分子标志物，且MicroRNA-130b调控RAB34表达可能与胰腺癌的发生有关^[30]。在人类卵巢上皮交界性肿瘤和恶性肿瘤中MicroRNA-130b-3p过表达可降低胞苷单磷酸激酶水平，抑制上皮性卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭，且该过程受转化生长因子β1信号通路的控制^[31]。研究表明，在2型糖尿病患者中MicroRNA-130b表达水平呈降低趋势^[32]。另有研究发现，MicroRNA-130b-Snail轴在促进上皮间充质转化和糖尿病肾病肾小管间质纤维化进展中存在作用，同时提出靶向MicroRNA-130b可作为一种潜在的糖尿病肾病治疗靶点^[33]。

此次研究运用腹腔注射链脲佐菌素成功建立糖尿病肾病大鼠模型，并在此模型基础上探讨MicroRNA-130b及转化生长因子β1是否与糖尿病肾病大鼠肾脏纤维化病变相关，及1,25(OH)₂D3对糖尿病肾病大鼠肾脏组织MicroRNA-130b、转化生长因子β1表达水平及肾脏纤维化程度的影响。结果发现，糖尿病肾病+1,25(OH)₂D3组及糖尿病肾病+花生油组MicroRNA-130b的表达水平明显低于正常对照组(P < 0.01)，而糖尿病肾病+1,25(OH)₂D3组及糖尿病肾病+花生油组转化生长因子β1mRNA、蛋白的表达水平及肾脏纤维化程度明显高于正常对照组(P < 0.01)，提示MicroRNA-130b、转化生长因子β1可能参与糖尿病肾病病变过程，且MicroRNA-130b在糖尿病肾病进展过程中可能起到保护作用，但具体作用机制仍有待研究。同时有研究证实，活性维生素D3具有抗炎、抗纤维化和抗蛋白尿的特征，可减少蛋白尿和降低尿转化生长因子β1水平，对延缓糖尿病肾病的进展有较好的作用^[34-35]。在糖尿病肾病大鼠模型中，活性维生素D3可通过抑制转化生长因子β1改善糖尿病肾病纤维化^[6]。此次研究则在发现MicroRNA-130b、转化生长因子β1可能参与糖尿病肾病病变过程的前提下，进一步探索活性维生素D3对糖尿病肾病大鼠肾脏组织MicroRNA-130b、转化生长因子β1表达水平及肾脏纤维化程度的影响。结果显示，糖尿病肾病+1,25(OH)₂D3组MicroRNA-130b水平明显高于糖尿病肾病+花生油组(P < 0.01)，而糖尿病肾病+1,25(OH)₂D3组转化生长因子β1mRNA、蛋白的表达水平及肾脏纤维化程度明显低于糖尿病肾病+花生油组(P < 0.01)。提示1,25(OH)₂D3对糖尿病肾病大鼠肾脏组织MicroRNA-130b、转化生长因子β1表达水平具有影响作用，1,25(OH)₂D3在上调糖尿病肾病大鼠肾脏MicroRNA-130b表达的同时可下调转化生长因子β1的表达水平，进一步提示1,25(OH)₂D3可能通过MicroRNA-130b调节转化生长因子β1的表达水平，改善糖尿病肾病肾脏病变及纤维化过程。        综上所述，研究通过动物实验发现糖尿病肾病大鼠肾脏组织MicroRNA-130b、转化生长因子β1的表达水平及肾脏纤维化程度存在变化，且1,25(OH)₂D3可上调糖尿病肾病大鼠肾脏MicroRNA-130b表达，同时下调转化生长因子β1的表达，改善肾脏组织结构紊乱及纤维化程度，提示1,25(OH)₂D3可能通过MicroRNA-130b调节糖尿病肾病肾脏转化生长因子β1的表达水平，进而改善糖尿病肾病的发展过程。但1,25(OH)₂D3在治疗糖尿病肾病的过程中对MicroRNA-130b、转化生长因子β1及MicroRNA-130b与转化生长因子β1之间是否存在调节作用、其具体调节机制尚未明确，仍是进一步研究的方向。
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文题释义：

MicroRNA-130b：microRNA(miRNA)是一种内源性小分子RNA，由21-25个核苷酸组成，可通过与靶基因mRNA的3’UTR或者CDS序列配对，促进mRNA的降解或抑制其翻译，从而抑制靶基因的表达，其中MicroRNA-130b与多脏器的多种病变有关，在糖尿病的进程中MicroRNA-130b与早期肾脏损伤具有一定的关系，可能成为糖尿病患者早期肾脏损害以及肾脏损害严重程度的新的生物学标志。

背景：1,25(OH)₂D3在糖尿病肾病的发展过程中发挥着重要调节作用。

MicroRNA现成为近年来研究的热点，可抑制靶基因的表达，并逐渐成为早期糖尿病肾病的治疗靶点。目前MicroRNA-130b在多类肿瘤领域的研究较为广泛，如膀胱癌、胶质瘤等，可能成为研究的潜在治疗靶点。近期有研究提出RAB34与MicroRNA-130b可作为胰腺癌的分子标志物，且MicroRNA-130b调控RAB34表达可能与胰腺癌的发生有关。研究表明，在2型糖尿病患者中MicroRNA-130b表达水平呈降低趋势。

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