坐骨神经慢性卡压损伤模型大鼠背根神经节纤维化改变

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2741

中国组织工程研究 ›› 2020, Vol. 24 ›› Issue (29): 4686-4691.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2741

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坐骨神经慢性卡压损伤模型大鼠背根神经节纤维化改变

黎琴文，梁杰，王冬梅，尚峥辉

三峡大学人民医院，宜昌市第一人民医院骨科，湖北省宜昌市 443000

收稿日期:2019-11-19 修回日期:2019-11-22 接受日期:2019-12-19 出版日期:2020-10-18 发布日期:2020-09-15
通讯作者: 尚峥辉，博士，主任医师。三峡大学人民医院，宜昌市第一人民医院骨科，湖北省宜昌市 443000
作者简介:Shang Zhenghui, MD, Chief physician, Department of Orthopedics, the People’s Hospital of China Three Gorges University/the First People’s Hospital of Yichang, Yichang 443000, Hubei Province, China
基金资助:
宜昌市医疗卫生科研项目(A19-301-19)

Fibrotic changes in rat dorsal root ganglion following chronic sciatic nerve compression

Li Qinwen, Liang Jie, Wang Dongmei, Shang Zhenghui

Department of Orthopedics, the People’s Hospital of China Three Gorges University/the First People’s Hospital of Yichang, Yichang 443000, Hubei Province, China

Received:2019-11-19 Revised:2019-11-22 Accepted:2019-12-19 Online:2020-10-18 Published:2020-09-15
Contact: 黎琴文，男，1987年生，江西省人，汉族，硕士，主治医师。
About author:Li Qinwen, Master, Attending physician, Department of Orthopedics, the People’s Hospital of China Three Gorges University/the First People’s Hospital of Yichang, Yichang 443000, Hubei Province, China
Supported by:
the Medical Research Project of Yichang, No. A19-301-19

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

组织纤维化：是结缔组织过度增生和细胞外基质沉积的结果，纤维化过程是一个异常的、不受控制的组织修复过程，其中组织损伤和自身免疫疾病是导致组织纤维化的主要因素，过度的组织纤维化最终导致组织结构和功能改变。

慢性神经卡压损伤：指周围神经在特定部位受到慢性卡压引起的相应神经功能障碍。

背景：既往的研究主要集中于周围神经慢性卡压损伤所导致的靶器官——骨骼肌萎缩及其纤维化发生的机制研究，关于周围神经慢性卡压损伤信号向上引起背根神经节功能改变的研究较少。

目的：观察大鼠坐骨神经慢性卡压损伤对背根神经节纤维化的影响。

方法：按照Mackinnon设计的方法制备大鼠坐骨神经慢性卡压模型，术后3周，分别取大鼠坐骨神经卡压侧和对侧L₄_-₆背根神经节，采用RT-PCR、Western blot及免疫荧光检测大鼠卡压侧和对照侧背根神经节内转化生长因子β1、结缔组织生长因子及胶原蛋白Ⅰ的表达变化。

结果与结论：①损伤3周后，相比于对照侧，背根神经节内转化生长因子β1、结缔组织生长因子及胶原蛋白Ⅰ的mRNA及蛋白表达均具有相同的升高趋势(P < 0.05)；②损伤3周后，大鼠卡压侧和对照侧背根神经节内转化生长因子β1和结缔组织生长因子主要表达在背根神经元内和轴突内，而胶原蛋白Ⅰ主要表达在背根神经元和轴突的周围，形成包绕背根神经元和轴突的网状结构；③上述数据证实，大鼠坐骨神经慢性卡压损伤可以导致背根神经节纤维化的改变，并且背根神经节纤维化的改变可能与背根神经元内转化生长因子β1及结缔组织生长因子表达升高有关。

ORCID: 0000-0003-1632-0837(黎琴文)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 坐骨神经慢性卡压, 背根神经节, 转化生长因子β1, 结缔组织生长因子, 胶原蛋白Ⅰ, 纤维化, 组织工程

Abstract:

BACKGROUND: Chronic nerve compression leads to muscle atrophy and fibrosis. Previous studies mainly focus on its pathogenesis. However, little is known about the dorsal root ganglia (DRG) responses to chronic nerve compression injury.

OBJECTIVE: To investigate the effect of chronic sciatic nerve compression on fibrosis of the DRG.

METHODS: Animal models of chronic sciatic nerve compression were made in rats according to the method described by Mackinnon. L₄_-₆ ipsilateral and contralateral DRG were harvested 3 weeks post injury. Real-time

RT-PCR, immunofluorescence and western blot were performed to determine the expression levels of transforming growth factor-β, connective tissue growth factor, and collagen type I in ipsilateral and contralateral DRG.

RESULTS AND CONCLUSION: Three weeks after injury, the mRNA and protein expression of transforming growth factor-β, connective tissue growth factor and collagen type I were increased significantly in the ipsilateral DRG as compared with the contralateral DRG (P < 0.05). Transforming growth factor-β and connective tissue growth factor mainly expressed in DRG neurons and axons, while collagen type I formed a net structure that surrounded DRG neurons and axons. These findings indicate that chronic sciatic nerve compression can induce fibrotic changes in the DRG that appears to be associated with an increase in transforming growth factor-β and connective tissue growth factor expression in DRG neurons.

Key words: chronic sciatic nerve compression, dorsal root ganglia, transforming growth factor-β and connective tissue growth factor, collagen type I, fibrosis, tissue engineering

中图分类号:

黎琴文, 梁杰, 王冬梅, 尚峥辉. 坐骨神经慢性卡压损伤模型大鼠背根神经节纤维化改变[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(29): 4686-4691.

Li Qinwen, Liang Jie, Wang Dongmei, Shang Zhenghui. Fibrotic changes in rat dorsal root ganglion following chronic sciatic nerve compression[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2020, 24(29): 4686-4691.

图/表（结果） 4

1.4.3 背根神经节组织Real-time PCR检测用TRIzol 试剂从背根神经节组织中提取总RNA并反转录合成cDNA。使用SYBR Green Realtime PCR Master Mix试剂盒进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析。qRT-PCR反应在实时荧光定量PCR仪(Life Technologies公司)上进行。引物信息见表1。用 2^-^??Ct方法计算相对值。

2.2 大鼠坐骨神经卡压3周后背根神经节转化生长因子β1、结缔组织生长因子、胶原蛋白Ⅰ的mRNA相对表达水平变化为了证实坐骨神经慢性卡压后背根神经节是否发生细胞外基质沉积，取大鼠坐骨神经损伤3周后同侧的L₄_-₆背根神经节进行RT-PCR定量检测，结果显示，相比于对照侧，大鼠坐骨神经卡压3周后同侧的背根神经节内胶原蛋白Ⅰ的mRNA相对表达水平具有升高的表达趋势(P < 0.05)。同样检测发现，大鼠坐骨神经卡压3周后同侧背根神经节内转化生长因子β1、结缔组织生长因子的mRNA相对表达水平均具有相同趋势的升高(P < 0.05)，见图1。

2.3 大鼠坐骨神经卡压3周后背根神经节转化生长因子β1、结缔组织生长因子、胶原蛋白Ⅰ的相对蛋白表达水平变化为了进一步证实坐骨神经慢性卡压后背根神经节在蛋白水平上是否也发生细胞外基质沉积，取大鼠坐骨神经损伤3周后同侧的L₄_-₆背根神经节进行Western blot检测，与胶原蛋白Ⅰ的mRNA相对表达水平变化相似，大鼠坐骨神经卡压3周后卡压侧背根神经节胶原蛋白Ⅰ的相对蛋白表达水平较对照侧具有相同的升高趋势(P < 0.05)；同样检测结果显示，相比于对照侧，大鼠坐骨神经卡压3周后卡压侧背根神经节内转化生长因子β1、结缔组织生长因子相对蛋白表达水平均表达升高(P < 0.05)，见图2。

2.4 大鼠坐骨神经卡压3周后背根神经节转化生长因子β1、结缔组织生长因子及胶原蛋白Ⅰ免疫反应变化为了进一步显示转化生长因子β1、结缔组织生长因子、胶原蛋白Ⅰ在背根神经节内的亚细胞分布，取大鼠坐骨神经损伤3周后卡压侧和对照侧的L₄_-₆背根神经节进行免疫荧光检测。在荧光显微镜下，卡压侧和对照侧的背根神经节内均可见转化生长因子β1、结缔组织生长因子及胶原蛋白Ⅰ不同强弱程度的表达，其中，蓝色荧光为细胞核(DAPI)阳性着色，绿色荧光为转化生长因子β1、结缔组织生长因子及胶原蛋白Ⅰ阳性染色；卡压侧和对照侧背根神经节内转化生长因子β1和结缔组织生长因子主要表达在背根神经元内和轴突内，使得背根神经元呈现出胞浆染色、胞核不染色的圆形或椭圆形的形态，使得轴突呈实心小圆点染色的形态，然而卡压侧和对照侧的背根神经节内胶原蛋白Ⅰ主要表达在背根神经元和轴突的周围，而未见表达在背根神经元内和轴突内，形成包绕背根神经元和轴突的网状结构，见图3。

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引言

慢性神经卡压损伤指周围神经在特定部位受到慢性卡压引起的相应神经功能障碍，常见的慢性卡压损伤为腕管综合征、肘管综合征及旋后肌综合征等，最初表现为周围神经电生理改变及感觉神经功能异常，如果未得到有效的治疗，最后会导致感觉神经障碍进一步加重及运动障碍，经过手术治疗或保守治疗后其预后尚可，但是慢性神经卡压损伤导致的周围神经运动功能障碍的治疗效果却不尽如人意。在世界范围内，慢性神经卡压损伤影响到了数以百万计的人群，因此，详细了解慢性神经卡压损伤后各个阶段潜在的病理机制可以更好地管理慢性神经卡压损伤患者，并为他们提供合适诊治方法^[1]。

相比于周围神经急性损伤后直接导致华勒氏变，慢性神经卡压损伤早期可导致周围的施万细胞增殖和凋亡发生，增殖的施万细胞低表达髓磷脂蛋白，从而导致局部的脱髓鞘和髓鞘再生，伴随着局部神经纤维出芽，随着神经的持续损伤，最终也可观察到局部的华勒氏变性^[2-4]。尽管慢性神经卡压损伤普遍存在，但是有限的人体标本限制了实验进一步研究慢性神经卡压损伤后的病理变化，故而采用硅胶管套在SD大鼠坐骨神经周围建造的坐骨神经慢性卡压动物模型，可以很好地模拟人类慢性神经卡压损伤带来上述病理变化^[2-3]，也可以进一步研究慢性神经卡压损伤的上游中枢神经系统反应和下游支配靶器官——骨骼肌的病理变化。

研究表明，坐骨神经慢性卡压损伤可致卡压神经局部组织严重纤维化和其支配的骨骼肌纤维化^[3，5]，同时，损伤信号也可以逆行向上影响背根神经节内神经元表型变化及其功能改变，如神经元凋亡、神经元高度兴奋和痛觉过敏等^[6-9]。鉴于坐骨神经慢性卡压损伤可以对背根神经节产生各种影响，实验的目的在于探讨坐骨神经慢性卡压对背根神经节纤维化的影响，并且在坐骨神经慢性神经卡压的病理条件下，进一步探讨背根神经节细胞外基质过度沉积的病理机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点于2019年1月至6月在三峡大学人民医院实验室完成。

1.3 材料

实验动物：实验用鼠为七八周龄SD雄性大鼠30只，体质量250-300 g，由三峡大学实验动物中心提供。实验已通过三峡大学医学实验动物伦理委员会审批，伦理批准号2018030E。

1.4 实验方法

1.4.1 大鼠坐骨神经卡压模型构建^[10] 将30只大鼠用戊巴比妥(40 mg/kg)腹腔麻醉，大鼠右侧大腿背侧处备皮，消毒铺巾，沿右侧坐骨神经走形方向切开皮肤，分离臀肌，显露右侧坐骨神经，将内径1 mm、长1 cm硅胶管纵行切开后，套在显露的右侧坐骨神经周围，8-0缝线缝合硅胶管切开处，将卡压神经放回原处，逐层缝合肌肉、伤口，显露左侧坐骨神经后缝合伤口为对照组。

1.4.2 实验动物心脏灌流后背根神经节取材和分组

实验动物心脏灌流：造模后3周，将实验动物再次戊巴比妥(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，打开大鼠胸腔，暴露心脏，用留置针从左心室进针，针头穿至主动脉弓处，剪开右心耳，同时向主动脉内注入生理盐水直至右心耳流出清亮液体，再换40 g/L多聚甲醛500 mL先快后慢注入主动脉内，直到大鼠肝变白变硬。

心脏灌流后背根神经节取材：切开灌流后的大鼠背侧皮肤，暴露脊柱，去除脊柱两旁的肌肉、骨质等组织，用咬骨钳咬除脊柱背侧棘突、横突等骨质，打开髓腔暴露出椎管内的脊髓，牵出脊髓，用显微镊分别将双侧L₄_-₆背根神经节从椎管两侧的椎间孔中牵出，可见梭形膨大的背根神经节，截取背根神经节。

背根神经节分组：将大鼠右侧L₄_-₆背根神经节作为卡压侧；将同一大鼠坐骨神经卡压大鼠对应的左侧L₄_-₆背根神经节作为对照侧。

1.4.4 背根神经节组织免疫印迹法检测提取背根神经节组织总蛋白并定量后，将30 μg蛋白在含有0.1% SDS的12%聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离并转移到硝酸纤维素膜上。将膜在5%脱脂奶粉封闭缓冲液中4 ℃温育过夜，用抗以下蛋白质的抗体(兔抗多克隆抗体，Santa Cruz公司)检测(4 ℃过夜)：内参GAPDH(1∶10 000)、转化生长因子β1(1：500)、结缔组织生长因子(1∶1 000)、胶原蛋白Ⅰ (1∶5 000)，并用过氧化物酶缀合的二抗(1∶10 000；HRP标记山羊抗兔，KPL公司)室温下孵育30 min，最后放入X射线片夹中曝光、显影、定影，将胶片进行扫描存档，Alpha软件处理系统分析目标带/内参的光密度值比。

1.4.5 背根神经节组织免疫荧光检测背根神经节组织冰冻切片体积分数0.2%Triton 100-X浸泡30 min，PBS冲洗3次各5 min，山羊血清封闭，37 ℃孵育1 h，去血清，滴加一抗转化生长因子β1(1∶50)、结缔组织生长因子(1∶50)、胶原蛋白Ⅰ(1∶200)，4 ℃孵育24 h，PBS冲洗3次各5 min，阴性对照实验中，用PBS 代替一抗。滴加二抗(AlexaFluor488-标记羊抗兔-IgG、AlexaFluor594-标记羊抗兔-IgG)，37 ℃孵育1 h，PBS冲洗3次各5 min。阴性对照实验中，用PBS代替二抗。滴加DAPI溶液后，室温2 min，PBS冲洗3次各5 min，抗淬灭剂封固，正置荧光显微镜(Olympus公司)下每组随机选取5个非重叠视野进行观察并拍照保存。

1.5 主要观察指标大鼠坐骨神经卡压3周后背根神经节转化生长因子β1、结缔组织生长因子及胶原蛋白Ⅰ的mRNA和蛋白表达水平变化，及其在背根神经节组织亚细胞的分布。

1.6 统计学分析应用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，计量资料变量以x(_)±s表示，两组间数值比较采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

实验通过qRT-PCR及Western blot检测发现卡压侧背根神经节内胶原蛋白Ⅰ表达升高，胶原蛋白Ⅰ是组织分布最为广泛的胶原蛋白，也是构成神经结构完整性必不可少的部分，在周围神经构成中占胶原质量的80%以上^[¹¹^]，分析神经中Ⅰ型胶原蛋白的含量，能在一定程度上反映神经中胶原纤维的增生情况，因此，背根神经节内胶原蛋白Ⅰ表达升高可以说明神经慢性卡压损伤能在一定程度上引起背根神经节细胞外基质沉积和纤维化形成。慢性或者严重的组织损伤可导致细胞外基质过度沉积和纤维化形成^[1²^-1³^]，纤维化可广泛的发生在全身多种组织和器官中，例如肝、肺、肾、心脏、胰腺及皮肤等^[1⁴^-1⁶^]，过度的组织纤维化最终导致组织结构和功能改变^[1⁷^-1⁹^]，因此，坐骨神经慢性卡压损伤后背根神经节功能是否发生变化需进一步探讨。

实验通过qRT-PCR和Western blot检测卡压侧背根神经节内转化生长因子β1和结缔组织生长因子表达较对照侧升高，与卡压侧背根神经节内胶原蛋白Ⅰ表达具有相同的趋势。在分子水平上，转化生长因子β1、结缔组织生长因子及肿瘤坏死因子α等众多细胞因子都被报道参与了肌成纤维细胞的分化和纤维化的形成^[²⁰^-2²^]。目前认为，转化生长因子β1作为激活成纤维细胞最具潜在意义的细胞因子，参与了各组织器官的纤维化进程^[2³^-2⁴^]，其中转化生长因子β1/Smad信号转导通路对成纤维细胞激活、细胞外基质产生起重要作用^[2⁵^-2⁶^]。同时Smad增强子作用于结缔组织生长因子启动子启动结缔组织生长因子表达^[2⁷^-2⁹^]，使得结缔组织生长因子被作为转化生长因子β1介导纤维化的下游效应因子，在结缔组织生长因子基因敲除的动物模型上可以观察到弱化的纤维化^[³⁰^]，因此，实验推测转化生长因子β1/结缔组织生长因子信号轴在介导坐骨神经慢性卡压损伤对背根神经节细胞外基质沉积过程中发挥了重要作用。

实验通过背根神经节切片免疫荧光检测发现，坐骨神经慢性卡压损伤后，细胞因子转化生长因子β1和结缔组织生长因子主要表达在背根神经节的背根神经元内及其轴突内，而胶原蛋白Ⅰ主要表达在背根神经元和轴突的周围，形成包绕背根神经元和轴突的网状结构。据以往的研究显示，背根神经节内除神经元细胞以外，主要还包括成纤维细胞、卫星细胞/神经胶质细胞及许旺细胞等^[³¹^-3³^]，因此，对上述这种现象的出现实验猜测，在坐骨神经慢性神经卡压的病理条件下，背根神经节内成纤维细胞的增殖、肌成纤维细胞的分化参与了其纤维化的形成。结合实验的结果，作者猜测坐骨神经慢性损伤后转化生长因子β1可以从背根神经元分泌到细胞间隙^[3⁴^-3⁵^]，通过旁分泌途径促使潜在的肌成纤维细胞分化，最终导致背根神经节细胞外基质过度沉积^[3⁶^-3⁸^]，因此背根神经元细胞来源的转化生长因子β1可能为导致背根神经节纤维化病理改变的细胞因子之一。另外，结缔组织生长因子在周围组织纤维化诱导和维持的过程中发挥了关键性的作用，可以作为一种旁分泌性蛋白诱导邻近成纤维细胞胶原蛋白Ⅰ表达^[3⁹^-⁴⁰^]。结缔组织生长因子也可以通过自身CR结构域(Cysteine-rich domain)与转化生长因子β1在细胞外直接结合，从而通过激活转化生长因子β1信号轴在细胞外的生物功能间接影响背根神经节纤维化病理改变^[⁴¹^-⁴²^]。总之，在坐骨神经慢性损伤的病理条件下，背根神经节内成纤维细胞的增殖、肌成纤维细胞的分化是否参与了纤维化的形成有待探索，同样背根神经元细胞是否通过旁分泌致纤维化细胞因子诱导肌成纤维细胞分化并导致细胞外基质沉积需进一步实验探索。

实验可见坐骨神经慢性卡压损伤后背根神经节内胶原蛋白Ⅰ围绕背根神经元和轴突周围表达，可能会改变神经元的形态和影响神经元的功能，作为一类较为常见的周围神经疾病，神经卡压损伤后对患者的生活质量影响较大，但在治疗过程中极少关注可能由背根神经节纤维化病理改变带来的临床症状，比如支配区域皮肤感觉过敏等，了解其涉及的分子机制将有利于开展具有针对性的临床治疗研究。因此，实验的成果将可能为今后周围神经损伤后改善功能恢复的研究提供一个新的方向和为该类疾病的防治提供新的治疗途径。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

坐骨神经慢性卡压损伤模型大鼠背根神经节纤维化改变

Fibrotic changes in rat dorsal root ganglion following chronic sciatic nerve compression

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