不同组织部位诱导膜血管化及成骨因子表达的比较

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1937

中国组织工程研究 ›› 2020, Vol. 24 ›› Issue (5): 667-672.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1937

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不同组织部位诱导膜血管化及成骨因子表达的比较

李树源¹，周琦石²，李悦²，周宏亮¹，杨佳宝¹，胡柽¹

¹广州中医药大学第一临床医学院，广东省广州市 510405；²广州中医药大学第一附属医院，广东省广州市 510405

收稿日期:2019-04-08 修回日期:2019-04-17 接受日期:2019-05-23 出版日期:2020-02-18 发布日期:2020-01-08
通讯作者: 周琦石，广州中医药大学第一附属医院一骨科，广东省广州市 510405
作者简介:李树源，男，1991年生，山西省汾阳市人，汉族，广州中医药大学第一临床医学院在读硕士，主要从事创伤骨科研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(81674001)

Comparisons of induced membrane vascularization and osteogenic factor expression in different tissue sites

Li Shuyuan¹, Zhou Qishi², Li Yue², Zhou Hongliang¹, Yang Jiabao¹, Hu Cheng¹

¹The First Clinical Medical College, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China; ²First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China

Received:2019-04-08 Revised:2019-04-17 Accepted:2019-05-23 Online:2020-02-18 Published:2020-01-08
Contact: Zhou Qishi, First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China
About author:Li Shuyuan, Master candidate, The First Cliical Medical College, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81674001

摘要/Abstract

摘要：

文题释义

诱导膜技术：又称膜诱导技术、Masquelet技术，1986年由Masquelet等最先提出并使用，是一种重建超临界尺寸骨缺损的有效方法。该技术在清创后所形成的骨缺损处植入骨水泥占位器，以形成一层生物膜，并在所形成的膜内进行植骨对骨缺损进行二次重建。该技术修复大段骨缺损具有重建时间短、骨愈合率高、并发症发生率较低等优势，其疗效已经被广泛证实。

血管内皮生长因子：是一种生长因子，在血管生成中发挥重要作用。血管内皮生长因子与血管内皮表面的特异性受体结合，可以促进内皮细胞的增殖、迁移，并可增加局部毛细血管的通透性，促使纤维蛋白原渗出，为血管内皮细胞的迁移和血管形成提供基质。在促进骨愈合方面，血管内皮生长因子通过促进血管增生，协调软骨细胞的消长、细胞外基质的改建，加快软骨内成骨。血管内皮生长因子还可以趋化并促进成骨细胞的分化，使碱性磷酸酶活性增强，局部钙盐沉积增加，促进骨愈合。

背景：研究发现在皮下、肌肉等部位植入聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥也可形成诱导膜，膜内同样具有微血管的形成并分泌多种成骨因子。

目的：比较皮下、肌肉、股骨骨缺损处诱导膜内血管化程度和成骨因子表达的差异。

方法：将36只雄性SD大鼠(购自广州中医药大学实验动物中心)随机分为3组，分别在后肢皮下、肌肉内、股骨骨缺损处植入聚甲基丙烯酸甲酯抗生素骨水泥占位器，每组12只。植入6周后，取出骨水泥周围的诱导膜，苏木精-伊红染色观察诱导膜组织形态结构变化，Western Blot印迹方法、RT-qPCR法、免疫组织化学染色法检测诱导膜中骨形态发生蛋白2、转化生长因子β1、血管内皮生长因子的表达情况。实验获得广州中医药大学动物实验伦理委员会批准，批准号：20181101006。

结果与结论：①苏木精-伊红染色显示3组均可形成诱导膜，但骨缺损组诱导膜组织切片外层血管数量较肌肉组、皮下组多，靠近骨水泥侧的内层成纤维细胞和肌纤维细胞数量较肌肉组、皮下组多；②免疫组织化学染色显示，骨缺损组骨形态发生蛋白2、转化生长因子β1、血管内皮生长因子阳性表达最多，皮下组最少；③Western Blot与RT-qPCR检测显示，骨缺损组骨形态发生蛋白2、转化生长因子β1、血管内皮生长因子表达均多于肌肉组、皮下组(P < 0.001)；④结果表明，不同的周围组织条件对诱导膜的组织结构和成骨因子表达有重要影响，在骨缺损处植入聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥可提高诱导膜的形成质量，膜内新生血管更丰富，骨生长因子的表达量更多。

ORCID: 0000-0003-1405-0765(李树源)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 诱导膜, 聚甲基丙烯酸甲酯, 皮下, 肌肉, 股骨骨缺损, 血管, 骨形态发生蛋白2, 转化生长因子β1, 血管内皮生长因子, 骨重建

Abstract:

BACKGROUND: Studies have found that polymethylmethacrylate bone cement implanted in the subcutaneous region, muscle and other parts can form induced membrane. The induced membrane favors vascularization and secretes multiple osteogenic factors.

OBJECTIVE: To investigate the differences in the level of vascularization and the expression of osteogenic factors in the induced membrane among subcutaneous region, muscle and femoral bone defects.

METHODS: Thirty-six male SD rats (purchased from the Experimental Animal Center of Guangzhou University of Chinese Medicine) were randomly divided into three groups (n=12/group). PolymethyImethacrylate antibiotic cement spacers were implanted in the subcutaneous tissue, muscle and femoral bone defects of the hind limbs. At 6 weeks after implantation, the induced membrane around the bone cement was removed. The change in membrane morphology was observed by hematoxylin-eosin staining. Expression of bone morphogenetic protein-2, transforming growth factor-β1 and vascular endothelial growth factor in the induced membrane was detected by western blot, RT-qPCR and immunohistochemistry. This study was approved by Animal Ethics Committee, Guangzhou University of Chinese Medicine, China (approval No. 20181101006).

RESULTS AND CONCLUSION: Hematoxylin-eosin staining showed that induced membrane formed in each group. The number of vessels in the outer layer of the membrane tissue section was higher in the femoral bone defect groups than that in the muscle and subcutaneous tissue group. The number of fibroblasts and myofibroblasts in the inner layer close to the bone cement was higher in the femoral bone defect group than in the muscle and subcutaneous tissue groups. Immunohistochemical staining revealed that bone morphogenetic protein-2, transforming growth factor-β1 and vascular endothelial growth factor expression levels were highest in the femoral bone defect group and lowest in the subcutaneous tissue group. Western blot and RT-qPCR showed that bone morphogenetic protein 2, transforming growth factor β1 and vascular endothelial growth factor expression levels were significantly higher in the femoral bone defect group than in the muscle and subcutaneous tissue groups (P < 0.001). These findings suggest that different surrounding tissue conditions have different important influences on tissue structure and osteogenic factor expression in the induced membrane. Polymethylmethacrylate bone cement implanted in the femoral bone defects can improve the quality of induced membrane formation, lead to a larger amount of newly formed vessels and higher osteogenic factor expression in the induced membrane.

Key words: induced membrane, polymethyImethacrylate, subcutaneous, muscle, femoral bone defect, vessel, bone morphogenetic protein 2, transforming growth factor β1, vascular endothelial growth factor, bone remodeling

中图分类号:

李树源, 周琦石, 李悦, 周宏亮, 杨佳宝, 胡柽. 不同组织部位诱导膜血管化及成骨因子表达的比较[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(5): 667-672.

Li Shuyuan, Zhou Qishi, Li Yue, Zhou Hongliang, Yang Jiabao, Hu Cheng. Comparisons of induced membrane vascularization and osteogenic factor expression in different tissue sites[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2020, 24(5): 667-672.

图/表（结果） 5

2.1 诱导膜的形态结构苏木精-伊红染色显示3组均可形成诱导膜，且诱导膜从靠近骨水泥的一侧开始向外依次呈现出成纤维细胞、肌纤维细胞、胶原纤维-血管网-肌肉的规则形态结构，但从光学显微镜下观察到骨缺损组诱导膜病理组织切片外层血管数量较肌肉组、皮下组多，分布也更加密集(箭头所示)，诱导膜靠近骨水泥侧的内层成纤维细胞和肌纤维细胞数量较肌肉组、皮下组更多，排列更为致密，见图2。

2.2 各组相关因子蛋白表达量的比较分析各组Western Blot蛋白免疫印迹条带的灰度值，结果表明各组诱导膜内骨形态发生蛋白2、转化生长因子β1、血管内皮生长因子蛋白表达量比较有明显差别，与皮下组、肌肉组相比，骨缺损组诱导膜内的3种因子的蛋白表达量更高(P < 0.001)；而皮下组与肌肉组比较无明显差异(P > 0.05)，见图3。上述结果表明，诱导膜内蛋白分泌量受所处周围组织条件的影响，骨缺损区组织环境可能更有利于诱导膜的形成，所诱导的生物膜3种骨生长因子表达量更多。

2.3 各组相关因子mRNA相对表达量的比较图4分别是骨形态发生蛋白2、转化生长因子β1、血管内皮生长因子qPCR基因扩增和熔解曲线，各因子基因扩增曲线4个阶段较明显，包括基线期、指数增长期、线性增长期和平台期，各管扩增曲线基线基本平直，无明显下降或上扬趋势，曲线拐点清楚，整体平行性较好，表明各管扩增效率相似；各蛋白熔解曲线均为单峰，无双峰存在，说明扩增产物具有特异性，引物设计合理，不存在引物二聚体或非特异性扩增。

RT-qPCR结果提示与皮下组、肌肉组相比，骨缺损组诱导膜内的骨形态发生蛋白2、转化生长因子β1、血管内皮生长因子的mRNA相对表达量更高(P < 0.001)；皮下组与肌肉组比较无明显差异(P > 0.05)，见图5。上述结果与Western Blot实验结果基本相似。

2.4 各组骨生长因子免疫组织化学结果比较光学显微镜下分析各组免疫组织化学染色切片，蓝色点状结构代表成纤维细胞或肌纤维细胞的细胞核，棕色部分代表各蛋白阳性表达区域，其中骨缺损组诱导膜内棕色区域染色较深，大致呈条带状簇集分布，表明骨缺损处填充的聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥所诱导的生物膜膜内骨形态发生蛋白2、转化生长因子β1、血管内皮生长因子阳性表达较较肌肉组、皮下组更明显，见图6。上述结果与Western Blot及RT-qPCR实验结果基本一致。

参考文献

[1] CATAGNI MA,AZZAM W,GUERRESCHI F,et al.Trifocal versus bifocal bone transport in treatment of long segmental tibial bone defects.Bone Joint J. 2019;101-B(2):162-169.
[2] LI JJ,DUNSTAN CR,ENTEZARI A,et al. A Novel Bone Substitute with High Bioactivity, Strength, and Porosity for Repairing Large and Load-Bearing Bone Defects.Adv Healthc Mater. 2019;8(8):e1801298.
[3] PIACENTINI F,CEGLIA MJ,BETTINI L,et al. Induced membrane technique using enriched bone grafts for treatment of posttraumatic segmental long bone defects.J Orthop Traumatol. 2019;20(1):13.
[4] GUPTA S,MALHOTRA A,JINDAL R,et al. Role of Beta Tri-calcium Phosphate- based Composite Ceramic as Bone-Graft Expander in Masquelet's- Induced Membrane Technique.Indian J Orthop. 2019;53(1): 63-69.
[5] WANG J,YIN Q,GU S,et al.Induced membrane technique in the treatment of infectious bone defect: A clinical analysis.Orthop Traumatol Surg Res.2019;105(3):535-539.
[6] DEBAUN MR,STAHL AM,DAOUD AI,et al. Preclinical induced membrane model to evaluate synthetic implants for healing critical bone defects without autograft.J Orthop Res. 2019;37(1):60-68.
[7] TOTH Z,ROI M,EVANS E, et al. Masquelet Technique: Effects of Spacer Material and Micro-topographyon Factor Expression and Bone Regeneration.Ann Biomed Eng. 2019;47(2):174-189.
[8] GIOTIKAS D,TARAZI N,SPALDING L,et al.Results of the Induced Membrane Technique in the Management of Traumatic Bone Loss in the Lower Limb: ACohort Study.J Orthop Trauma. 2019;33(3):131-136.
[9] MASQUELET AC,KISHI T,BENKO PE,et al.Very long-term results of post-traumatic bone defect reconstruction by the induced membrane technique.Orthop Traumatol Surg Res. 2019;105(1):159-166.
[10] CUI T, LI J, ZHEN P, et al.Masquelet induced membrane technique for treatment of rat chronic osteomyelitis.Exp Ther Med. 2018;16(4): 3060-3064.
[11] PELISSIER PH, MASQUELET AC, BAREILLE R ,et al.Induced membranes secrete growth factors including vascular and osteoinductive factors and could stimulate bone regeneration.J Orthop Res. 2004;22(1):73-79.
[12] HENRICH D, SEEBACH C, NAU C, et al.Establishment and characterization of the Masquelet induced membrane technique in a rat femur critical-sized defect model.J Tissue Eng Regen Med. 2016;10(10): E382-E396.
[13] LI A, RIEVESCHL NB, CONTI FF, et al.Long-Term Assessment of Macular Atrophy in Patients with Age-Related Macular Degeneration Receiving Anti-Vascular Endothelial Growth Factor.Ophthalmol Retina. 2018;2(6): 550-557.
[14] HOSODA Y, MIYATA M, UJI A, et al.Novel Predictors of Visual Outcome in Anti-VEGF Therapy for Myopic Choroidal Neovascularization Derived Using OCT Angiography. Ophthalmol Retina.2018;2(11):1118-1124.
[15] KOLOSTOVA K, TALTYNOV O, PINTEROVA D, et al.Tissue repair driven by two different mechanisms of growth factor plasmids VEGF and NGF in mice auricular cartilage: regeneration mediated by administering growth factor plasmids.Eur Arch Otorhinolaryngol. 2012;269(7):1763-1770.
[16] ZHANG R, LIANG Y, WEI S.The expressions of NGF and VEGF in the fracture tissues are closely associated with accelerated clavicle fracture healing in patients with traumatic brain injury.Ther Clin Risk Manag. 2018;14:2315-2322.
[17] MANZANO-MORENO FJ, COSTELA-RUIZ VJ, MELGUIZO-RODRÍGUEZ L, et al. Inhibition of VEGF gene expression in osteoblast cells by different NSAIDs.Arch Oral Biol.2018;92:75-78.
[18] HU K, OLSEN BR.Osteoblast-derived VEGF regulates osteoblast differentiation and bone formation during bone repair.J Clin Invest. 2016;126(2):509-526.
[19] D’AMORE PA.Vascular endothelial cell growth factor-a not just for endothelial cells anymore. Am J Pathol.2007;171(1):14-18.
[20] YOON SJ, YOO Y, NAM SE, et al. The Cocktail Effect of BMP-2 and TGF-β1 Loaded in Visible Light-Cured Glycol Chitosan Hydrogels for the Enhancement of Bone Formation in a Rat Tibial Defect Model.Mar Drugs. 2018;16(10):351.
[21] ASPARUHOVA MB, CABALLÉ-SERRANO J, BUSER D, et al. Bone-conditioned medium contributes to initiation and progression of osteogenesis by exhibiting synergistic TGF-β1/BMP-2 activity l.Int J Oral Sci. 2018;10(4):20.
[22] JEONG SY, HONG JU, SONG JM, et al.Combined effect of recombinant human bone morphogenetic protein-2 and low level laser irradiation on bisphosphonate-treated osteoblasts.J Korean Assoc Oral Maxillofac Surg.2018;44:259-268.
[23] AQUINO-MARTÍNEZR, ARTIGAS N, GÁMEZB, et al. Extracellular calcium promotes bone formation from bone marrow mesenchymal stem cells by amplifying the effects of BMP-2 on SMAD signalling. PLoS One. 2017; 12(5): e0178158.
[24] MANIKANDAN M, ABUELREICH S, ELSAFADI M, et al.NR2F1 mediated down-regulation of osteoblast differentiation was rescued by bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) in human MSC. Differentiation. 2018;104:36-41.
[25] DANG LHN, KIM YK, KIM SY, et al.Radiographic and histologic effects of bone morphogenetic protein-2/hydroxyapatite within bioabsorbable magnesium screws in a rabbit model.J Orthop Surg Res.2019;14(1): 117.
[26] RUEHLE MA, KRISHNAN L, VANTUCCI CE, et al.Effects of BMP-2 dose and delivery of microvascular fragments on healing of bone defects with concomitant volumetric muscle loss.J Orthop Res.2019; 37(3):553-561.
[27] CANNADA LK.A Randomized Controlled Trial Comparing rhBMP-2/ ACS vs. Autograft for the Treatment of Tibia Fractures with Critical Size Defects.J Orthop Trauma. 2019 Apr 19. doi: 10.1097/BOT. 0000000000001492. [Epub ahead of print]
[28] 苏佳灿,曹烈虎,石长贵,等.骨生长因子[M].上海:第二军医大学出版社, 2015:58.

引言

材料方法

1.1 设计对比观察动物实验。

1.2 时间及地点实验于2018年12月至2019年4月在广州中医药大学实验动物中心和岭南医学研究中心完成。

1.3 材料骨水泥理化性能见表1。

实验动物：选取SPF级健康的10周龄雄性SD大鼠36只，体质量200-240(220.2±21.3) g，购自广州中医药大学实验动物中心，许可证号：SCXK(粤)2013-0020，实验动物合格证号：44005800004755。按照随机数字表法将SD大鼠随机分为3组，分别为皮下组、肌肉组、骨缺损组，每组12只。所有实验动物均由广州中医药大学SPF级动物房饲养，实验室温度22-24 ℃，相对湿度60%-70%，光暗周期为12 h/12 h，由广州中医药大学实验动物中心提供的饲料进行喂养，适应性饲养1周后开始进行实验。实验获得广州中医药大学动物实验伦理委员会批准，批准号：20181101006。

实验用主要试剂与仪器：40 g/L多聚甲醛固定液(北京Biosharp公司，批号1704464)；注射用青霉素钠(华北制药股份有限公司，160×10⁴ U/瓶，国药准字H13020655)；定制6孔不锈钢钢板、1.5 mm皮质骨自攻螺钉(东莞市横沥燎原模具加工店)；苏木精-伊红染色液(广州凯秀贸易有限公司，批号：16051837)；超声细胞破碎仪(上海天呈科技有限公司)；垂直电泳仪及转移系统(BIO RAD)；微量分光光度K280(北京凯奥科技有限公司)；RNase free EP管、RNase free吸头(Thermo)，PCR管(Axygen)；JS-power300电泳仪、培清JS-780全自动凝胶成像分析仪(上海培清科技有限公司)，Trizol(美国Invitrogen公司)；BX53生物显微镜(日本Olympus公司)等。

1.4 实验方法

1.4.1 动物模型的建立实验大鼠术前禁食12 h，予4×10⁴U青霉素钠术前肌肉注射，以50 g/L水合氯醛腹腔注射麻醉，麻醉起效后右后肢剃毛备皮，大鼠取左侧卧位，显露右后肢，消毒、铺无菌洞巾：①皮下组：沿股骨外侧纵形切开皮肤，切口约1 cm，轻柔分离至皮下筋膜，将术前预制的4 mm的圆柱形抗生素骨水泥块放置皮下空间内，生理盐水冲洗术口后，以3-0丝线缝合皮肤，见图1A；②肌肉组：沿股骨外侧纵形切开皮肤、浅筋膜、深筋膜，切口约1 cm，逐层分离肌肉，分离股直肌与股外侧肌，将预制的4 mm圆柱形抗生素骨水泥块放至肌肉之间，逐层缝合筋膜和皮肤，见图1B；③骨缺损组：沿股骨外侧自股骨大转子至股骨外侧髁纵形切开皮肤、筋膜，切口约2.5 cm，分离皮下肌肉，显露股骨外侧面。于股骨前外侧放置定制的6孔钢板，远近端分别于2枚皮质骨自攻螺钉固定钢板，在股骨干中央位置用线锯进行截骨，截骨长度为4 mm。骨缺损区以预制的长度为4 mm的圆柱形抗生素骨水泥嵌入填充，生理盐水反复冲洗后逐层缝合切口，见图1C。

1.4.2 术后处理术后3 d内，每日予4×10⁴ U青霉素钠肌肉注射，预防感染，单笼饲养至术口愈合。

1.4.3 标本采集与处理术后6周诱导膜形成后，以50 g/L水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，常规消毒铺巾，沿原手术入路切开，剥离取出诱导膜。每组分别取6只大鼠的诱导膜组织，放入体积分数10%甲醛溶液中固定24 h，每组其余大鼠的诱导膜组织取出后放入冻存管，立即液氮保存。

1.5 主要观察指标

诱导膜组织形态结构的观察：取出于甲醛溶液中固定的诱导膜组织，经脱水、石蜡包埋等处理后，用组织切片机对诱导膜组织进行连续切片，切片厚度为5 μm。随后将蜡片平铺于载玻片上，再将切片放于恒温摊片烤片机中68 ℃烤片，苏木精-伊红染色法对诱导膜切片进行染色，封固后，光学显微镜下观察诱导膜的形态结构及其血管数量。

相关因子蛋白含量测定及表达情况：①取出冻存管内的诱导膜组织，采用Western Blot蛋白免疫印迹法进行骨形态发生蛋白2、转化生长因子β1、血管内皮生长因子蛋白含量测定。经样品的裂解、离心、蛋白提取、电泳、转模、封闭、抗体孵育等流程后，将孵育膜拿至暗房进行孵育反应。加入胶片富士感光胶片，压片2 min，显影3 min，定影10 min。内参蛋白质为GAPDH。使用ImageJ软件分析各个条带的灰度值，并进行统计分析；②将组织切片后，进行免疫组织化学染色，观察不同组织部位诱导的膜内骨形态发生蛋白2、转化生长因子β1、血管内皮生长因子的表达情况。

相关因子mRNA的表达：取出冻存管内的诱导膜组织，采用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-qPCR)法检测骨形态发生蛋白2、转化生长因子β1、血管内皮生长因子mRNA的表达。引物序列为：R-骨形态发生蛋白2-F：CCG CTG TCT TCT AGT GTT GCT，R-骨形态发生蛋白2-R：GAT AAG GGG CGC GAT GCC；R-转化生长因子β1-F：ACT CCC AGA AAA GCA AGC AA，R-转化生长因子β1-R：CGA GCA GGA ATG AGA AGA GG；R-血管内皮生长因子-F：GGG AGC AGA AAG CCC ATG AA，R-血管内皮生长因子-R ：AGA TGT CCA CCA GGG TCT CA。内参基因为ACTB，其引物序列为：R-ACTB-F：TCA GCA AGC AGG AGT ACG ATG，R-ACTB-R：GTG TAA AAC GCA GCT CAG TAA CA。各组样本mRNA的相对表达量=2^-^∆∆Ct。

1.6 统计学分析所有数据均采用Stata 12.0软件进行分析，骨形态发生蛋白2、转化生长因子β1、血管内皮生长因子蛋白含量及其mRNA的表达等计量资料以x(_)±s表示，满足正态分布后，3组之间均数的比较采用单因素方差分析，若差异有显著性意义，则再采用Bonferroni检验法进行组间两两比较；对于不符合正态分布的计量资料，3组均数之间的比较采用非参数Kruskal-Walls检验法，P < 0.05表示差异有显著性意义。

讨论

大段骨缺损的治疗一直以Ilizarov牵张成骨技术为主，膜诱导技术的出现为修复大段骨缺损提供了一种新的方法^[1^，^5]。膜诱导技术的核心是骨水泥周围生成诱导膜，诱导膜的优势主要体现在：①从机械力学角度看，诱导膜可以阻止周围组织长入骨缺损区，在为植骨提供一个“囊袋状”空间结构的同时，保护植骨骨质不被周围组织吸收^[6]；②从组织学角度看，诱导膜由大量成纤维细胞和胶原基质组成，胶原纤维与骨长轴平行排列，膜上有丰富的微血管，血管垂直于骨干长轴走行并向骨缺损区生长，可为植骨的生成提供丰富的血供^,7]；③从生物化学角度看，诱导膜可表达3种已知的生长因子，包括血管内皮生长因子、骨形态发生蛋白2和转化生长因子β1，这些骨生长因子对成骨细胞的增殖、分化和骨愈合至关重要^[8-9]。

诱导膜为机体对异物(聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥)进行免疫排斥反应而形成^[10]，理论上讲，诱导膜所处体内微环境的改变会对膜的组织学和生物化学特性产生影响。PELISSIER等^[11]将聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥植入家兔皮下和骨缺损处诱导膜的生成，植入后2，4，6，8周分别取材，进行病理组织学研究、定性和定量免疫化学检测，评估血管形成和生长因子的表达，发现两组组织形态结构相似，但对照组(皮下组织)各时间点血管内皮生长因子、转化生长因子β1、骨形态发生蛋白2浓度均较低。HENRICH等^[12]的大鼠实验发现，股骨缺损周围诱导的膜形态特征与皮下诱导的膜形态特征基本相似，但骨缺损处诱导的膜通常结构更致密；4，6周取材时，骨缺损周围诱导膜的细胞数明显高于皮下的诱导膜(P < 0.05)，4-6周时皮下诱导膜中的血管化程度会降低；Western blot分析显示，4周时骨缺损诱导膜中骨形态发生蛋白2含量明显高于皮下膜(P < 0.05)；骨水泥填充后2，4周，骨缺损处转化生长因子β1含量较皮下处明显升高(P < 0.05)；2周时，骨缺损诱导膜中血管内皮生长因子含量多于皮下诱导膜(P < 0.05)，从而认为骨缺损周围的环境比皮下环境更能刺激诱导膜内新生血管的形成和成骨因子的分泌。

此次实验结果与此有相似之处，皮下、肌肉和骨缺损处均可形成肉眼可见的诱导膜，且呈现出相似的形态结构，但从光学显微镜下观察到骨缺损处形成的诱导膜膜内血管化程度更明显，纤维细胞的数量更多，排列更致密。血管化程度较高的原因主要与骨缺损部位血管内皮生长因子的表达量较高有关。血管内皮生长因子在血管生成中发挥重要作用^[13-14]，其与血管内皮表面的特异性受体结合，可以促进内皮细胞的增殖、迁移，并可增加局部毛细血管的通透性，促使纤维蛋白原渗出，为血管内皮细胞的迁移和血管形成提供基质^[15]。在促进骨愈合方面，血管内皮生长因子通过促进血管增生，协调软骨细胞的消长、细胞外基质的改建，加快软骨内成骨^[16]。血管内皮生长因子还可以趋化并促进成骨细胞的分化，使碱性磷酸酶活性增强，局部钙盐沉积增加，促进骨愈合^[17-18]。而骨缺损处诱导膜内的血管内皮生长因子表达量较皮下、肌肉内更高的原因，主要与血管内皮生长因子的来源有关，成纤维细胞生长因子、血小板、白细胞介素1、转化生长因子β1等细胞和生长因子均可上调血管内皮生长因子的在体表达。此外，早期血肿形成、血肿局部缺氧的环境也可增加血管内皮生长因子的分。血管内皮生长因子的表达与缺氧呈剂量依赖关系^[19]，皮下、肌肉、骨缺损部位植入骨水泥后，随着血肿的形成均可形成局部缺氧的微环境，且这些组织部位均含有上调血管内皮生长因子的细胞因子及生长因子。但骨缺损区除了可通过释放这些调节介质的途径来上调血管内皮生长因子的表达外，不同时期骨折端的间充质干细胞、软骨细胞、成骨细胞可直接大量分泌血管内皮生长因子，促进新生血管的生成。因此，骨缺损区的诱导膜内血管内皮生长因子的来源更广，最终促成的微血管也更丰富。HENRICH等^[12]认为Stro-1阳性细胞是膜内血管内皮生长因子的主要产生细胞，而在皮下形成的膜中Stro-1阳性细胞缺失，因而血管内皮生长因子表达明显降低。

转化生长因子β1是“转化生长因子β超家族”成员之一，可以刺激间充质干细胞的增殖、分化，促进成骨细胞、成软骨细胞的增殖及细胞外基质的合成，诱导膜内成骨和软骨内成骨^[20-21]。骨形态发生蛋白2也属于“转化生长因子β超家族”成员之一，在众多促进间充质母细胞分化的生长因子中，骨形态发生蛋白2是最具潜力的诱导因子，能促进骨髓基质细胞分化为成骨细胞^[22]。这一作用主要是骨形态发生蛋白2通过激活Smad蛋白细胞内信号传导通路，诱导细胞核内的靶基因转录及蛋白表达这一经典的信号传导通路来发挥其生物活性^[23]。骨形态发生蛋白2还可上调成骨细胞中血管内皮生长因子的表达，促进血管的生成^[24]。目前，不断有基础研究和临床报道证实了通过外源性植入骨形态发生蛋白2治疗骨折和骨不连的效果^[25-27]。此次实验发现，骨缺损处诱导膜内分泌的骨形态发生蛋白2、转化生长因子β1较肌肉、皮下更明显(P < 0.05)。原因在于，骨是转化生长因子β1最主要的组织来源^[28]，骨折时血肿内的血小板、炎性细胞(单核、巨噬细胞)、成骨细胞和软骨细胞等可以释放和合成大量的转化生长因子β1，骨愈合早期由血小板释放，整个骨愈合过程中则由软骨细胞和成骨细胞合成，成骨细胞是骨组织中转化生长因子β1的主要合成细胞。而骨形态发生蛋白2主要存在于皮质骨、周围及中枢神经系统组织中，骨形态发生蛋白家族的大部分成员在软骨内成骨区表达。因此，骨缺损处的诱导膜内转化生长因子β1、骨形态发生蛋白2骨生长因子的表达较皮下和肌肉处更明显。

此次实验的局限性在于：①对不同组织部位诱导膜的血管化程度、细胞、基质密度的评估，单凭镜下观察具有主观性，且缺乏定量分析，具体差异程度不能精确评估，存在一定偏倚；②根据已有的文献报道诱导膜内成骨因子的表达量在不同时期存在波动，下一步还应该对不同时间段诱导膜的血管化和成骨因子的表达做出动态比较；③虽然不同组织部位诱导膜的血管化及细胞密度有区别，但厚度、面积、机械强度等物理特征也应进行多方面评估。

综上所述，作为骨水泥与周围组织发生免疫排斥反应所形成类似于滑膜组织的结构，诱导膜不单具有机械性阻隔周围瘢痕组织、避免植骨吸收的作用，诱导膜内丰富的微血管系统和大量的骨生长相关因子是诱导膜技术的核心，也是植骨后修复骨缺损的关键。诱导膜这些微血管的生成和成骨因子的表达受骨水泥所处周围组织条件的影响，在骨缺损处植入聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥，膜内新生血管更丰富、骨生长因子的表达量更多，诱导膜的质量更高。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

不同组织部位诱导膜血管化及成骨因子表达的比较

Comparisons of induced membrane vascularization and osteogenic factor expression in different tissue sites

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[1]	顾霞, 赵敏, 王平义, 李一梅, 李文华. 低氧诱导因子1α与低氧相关疾病信号通路的关系[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1284-1289.
[2]	袁美, 张新新, 郭祎莎, 毕霞. 循环microRNA在血管性认知障碍诊断中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1299-1304.
[3]	宋黎明, 苏海龙. 意外滑移后滑移腿肌肉力的反应特性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1184-1189.
[4]	王梦婷, 古艳萍, 任文博, 覃倩, 白冰怡, 廖远朋. 运动干预功能障碍人群血流限制训练的文献热点可视化分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1264-1269.
[5]	刘聪, 刘肃. miR-17-5p调控低氧诱导因子1α介导脂肪细胞分化及血管生成的分子机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1069-1074.
[6]	赵敏, 冯柳祥, 陈垚, 顾霞, 王平义, 李一梅, 李文华. 低氧环境下外泌体可作为疾病的标志物[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1104-1108.
[7]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.
[8]	张雯雯, 金颂峰, 赵国梁, 宮丽鸿. 复方中药稳斑汤减少同型半胱氨酸诱导大鼠心肌微血管内皮细胞凋亡的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 723-728.
[9]	聂慧娟, 黄织春. 转化生长因子β1诱导心肌成纤维细胞转分化过程中Hedgehog信号通路的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 754-760.
[10]	马子越, 巨啸晨, 张磊, 孙荣鑫. 保留与不保留残端重建前交叉韧带后移植物腱骨愈合的比较[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 582-587.
[11]	叶海民, 丁凌华, 孔维豪, 黄祖泰, 熊龙. 多级微管结构骨支架载体促进成骨成血管作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 621-625.
[12]	邢浩, 张永红, 王栋. 长骨大段骨缺损修复方法的优势与不足[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(3): 426-430.
[13]	姜涛, 马磊, 李志强, 寿玺, 段明军, 吴硕, 马创, 魏琴. 血小板衍生生长因子BB诱导骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3937-3942.
[14]	徐晓明, 陈艳, 宋倩, 袁露, 顾加明, 张丽娟, 耿洁, 董坚. 人胎盘间充质干细胞凝胶促进SD大鼠放射性皮肤损伤的愈合[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3976-3980.
[15]	王秋霏, 顾叶, 彭育沁, 薛峰, 巨荣, 朱锋, 王熠军, 耿德春, 徐耀增. 人工假体磨损颗粒作用下Wnt/β-catenin信号通路对成骨细胞的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(24): 3894-3901.