糖尿病模型小鼠拔牙后对颌牙牙合向伸长过程中根周骨密度及相关因子的变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1918

中国组织工程研究 ›› 2020, Vol. 24 ›› Issue (2): 242-247.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1918

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糖尿病模型小鼠拔牙后对颌牙牙合向伸长过程中根周骨密度及相关因子的变化

杨晓叶¹，李文晋^1，2，朱莉²，王瑜²，张双元¹

¹山西医科大学口腔医学院·口腔医院，山西省太原市 030001；²山西医科大学口腔医学院·口腔医院·山西医科大学第二医院，山西省太原市 030001

收稿日期:2019-04-02 修回日期:2019-04-12 接受日期:2019-04-30 出版日期:2020-01-18 发布日期:2019-12-25
通讯作者: 李文晋，副教授，山西医科大学口腔医学院•口腔医院•山西医科大学第二医院，山西省太原市 030001
作者简介:杨晓叶，女，1989年生，山西省朔州市人，汉族，硕士，主要从事口腔全科学研究。
基金资助:
山西省回国留学人员科研资助项目(2016-122)；山西省留学回国人员科技活动择优资助经费项目(晋财社<2017>19号)

Changes of bone mineral density and related factors during maxillary teeth occlusion after tooth extraction in diabetic mice

Yang Xiaoye¹, Li Wenjin^{1, 2}, Zhu Li², Wang Yu², Zhang Shuangyuan¹

¹Shanxi Medical University Stomatological College • Stomatological Hospital, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China; ²Shanxi Medical University Stomatological College • Stomatological Hospital • Second Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China

Received:2019-04-02 Revised:2019-04-12 Accepted:2019-04-30 Online:2020-01-18 Published:2019-12-25
Contact: Li Wenjin, Associate professor, Shanxi Medical University Stomatological College • Stomatological Hospital, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China; Shanxi Medical University Stomatological College • Stomatological Hospital • Second Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China
About author:Yang Xiaoye, Master, Shanxi Medical University Stomatological College • Stomatological Hospital, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China
Supported by:
the Research Project for Returned Overseas Students in Shanxi Province, No. 2016-122; the Project of Science and Technology Activities for Scholars Returning from Study in Shanxi Province, No. <2017>19

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

抗酒石酸酸性磷酸酶：是破骨细胞的标志性酶，为酸性磷酸酶的同工酶，绝大多数来源于破骨细胞，特异性的分布于破骨细胞胞浆中，染色酶活性部位为紫红色，核为阴性，为绿色，颜色反差大，易区分，特异性强。

骨连接蛋白：是一种非结构性的细胞外间质蛋白，分子质量较小，为高度进化的保守序列，基因位于人类第9号染色体，小鼠第11号染色体，由3个独立的区域组成：①末端酸性钙离子结合区域；②卵泡静止素同源的铜离子结合区域；③细胞外钙离子结合区域，其中最重要的功能是骨连接蛋白可以调节细胞外基质和基质金属蛋白酶的产生。

背景：牙列缺失是常见的口腔疾病，若得不到及时有效的治疗，就会出现邻牙倾斜、对颌牙伸长等不良影响，造成牙合紊乱以及牙合干扰，严重影响后期修复。尤其是糖尿病患者牙列缺失后，对颌牙在牙合向伸长过程中，糖尿病对其有何影响？骨连接蛋白在此过程如何变化？目前尚不清楚。

目的：通过建立糖尿病小鼠对颌牙牙合向伸长运动实验模型，研究糖尿病对小鼠牙齿牙合向伸长运动过程的影响。

方法：向C57 BL/6J小鼠(购买于山西医科大学动物实验中心)腹腔注射链脲佐菌素建立糖尿病模型，以腹腔注射柠檬酸钠缓冲液的小鼠为对照。取建模成功的糖尿病小鼠与对照组小鼠各30只，拔除右上颌3颗磨牙建立对颌牙牙合向伸长运动实验模型，术后0，3，6，9，12 d，取右侧下颌骨，利用Micro CT测量骨密度，抗酒石酸酸性磷酸酶染色计数破骨细胞数量，RT-qPCR检测骨连接蛋白基因的表达。实验方案经山西医科大学伦理委员会批准。

结果与结论：①随着时间的延长，两组右侧下颌骨的骨密度逐渐增加，糖尿病组术后3，6，9，12 d的骨密度低于对照组(P < 0.05)；②随着时间的延长，两组右侧下颌骨的破骨细胞数量逐渐增多，糖尿病组术后3，6，9，12 d的破骨细胞数量少于对照组(P < 0.05)；③随着时间的延长，两组右侧下颌骨的骨连接蛋白基因表达量逐渐升高，糖尿病组术后0，3，6，9，12 d的骨连接蛋白基因表达量高于对照组(P < 0.05)；④结果表明，糖尿病可降低牙齿牙合向伸长运动过程中的骨改建能力并提高骨连接蛋白基因表达。

ORCID: 0000-0003-0898-6073(杨晓叶)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 糖尿病小鼠, 牙齿牙合向伸长, Micro CT, 骨密度, 破骨细胞, 抗酒石酸酸性磷酸酶染色, 骨连接蛋白, RT-qPCR

Abstract:

BACKGROUND: Defective dentition is a common oral disease, if it is not treated in time, there will be adverse effects such as tilting of the adjacent teeth and elongation of the jaws, causing occlusal disorder and interference, which will seriously affect the later repair. Especially in the diabetic patients with dentition loss, the impacts of diabetes on the occlusal elongation of the jaw teeth, and how osteonectin changes in this process, are still unclear.

OBJECTIVE: To investigate the effect of diabetes on tooth occlusion and elongation in mice by establishing a model of the occlusion of the jaws in diabetic mice.

METHODS: A diabetic model was established by intraperitoneal injection of streptozotocin in C57 BL/6J mice (purchased from the Animal Experimental Center of Shanxi Medical University). The mice were intraperitoneally injected with sodium citrate buffer. Thirty mice with successful modeling and control mice were removed, and the three right maxillary molars were removed to establish an experimental model of the extensional movement of the maxillary teeth. After 0, 3, 6, 9 and 12 days, the right jaw was taken. The bone mineral density was measured by micro-CT. The number of osteoclasts was counted by tartrate resistant acid phosphatase staining. The expression level of osteonectin was detected by RT-qPCR. The study was approved by the Ethical Committee of Shanxi Medical University.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) With the time increasing, the bone mineral density of the right mandible in the two groups was gradually increased. The bone mineral density in the diabetic group was significantly lower than that in the control group at 3, 6, 9 and 12 days after surgery (P < 0.05). (2) With the time increasing, the number of osteoclasts in the right mandible of both groups was gradually increased. The number of osteoclasts in the diabetic group was significantly lower than that in the control group at 3, 6, 9 and 12 days after surgery (P < 0.05). (3) The expression level of osteonectin mRNA in the right mandible of both groups was gradually increased. The expression level of osteonectin mRNA in the diabetic group was significantly higher than that in the control group at 0, 3, 6, 9 and 12 days after surgery (P < 0.05). (4) These results indicate that diabetes can reduce the bone construction ability during the extensional movement and promote osteonectin mRNA expression.

Key words: diabetic mice, tooth occlusion elongation, micro-CT, bone mineral density, osteoclast, tartrate resistant acid phosphatase staining, osteonectin, RT-qPCR

中图分类号:

R459.9

R-332

R587.1

杨晓叶, 李文晋, 朱莉, 王瑜, 张双元. 糖尿病模型小鼠拔牙后对颌牙牙合向伸长过程中根周骨密度及相关因子的变化[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(2): 242-247.

Yang Xiaoye, Li Wenjin, Zhu Li, Wang Yu, Zhang Shuangyuan. Changes of bone mineral density and related factors during maxillary teeth occlusion after tooth extraction in diabetic mice[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2020, 24(2): 242-247.

图/表（结果） 6

参考文献

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引言

近年来随着中国经济的迅猛发展和人民生活水平的提高，糖尿病等内分泌疾病的发病率也越来越高，由此产生的严重并发症影响身体健康，受到了人们的重视。胰岛素是由体内胰岛B细胞分泌的蛋白质激素，可促进胶原蛋白的合成，在抑制胶原分解、碱性磷酸酶释放及促进骨形成中起着重要作用。糖尿病影响牙齿矿化发育、牙髓血供、牙周膜组织代谢和牙槽骨重建，因此推测糖尿病可能会影响牙齿牙合向伸长运动^[1-4]。

随着医疗技术的发展，以前很多牙体缺损需要拔除的患牙现在可成功修复得以保留，然而仍有许多因牙周病、损伤、颌骨疾病等原因造成的牙齿缺失，若不及时治疗会出现邻牙倾斜、对颌牙伸长等不良影响，造成牙合紊乱及牙合干扰，严重影响后期修复。牙齿的牙合向伸长这一概念最早是由OPPENHEIM^[5]提出的，其研究认为牙齿移动是根周骨组织吸收与重建相互作用的过程；1941年Joseph-Peter也提出牙齿生理性移动是根尖牙骨质和牙槽骨生长共同作用的结果，两者观点共同构成早期牙齿移动的理论基础。

骨连接蛋白是一种富含半胱氨酸的小分子糖蛋白，常分布于骨、软骨、成骨母细胞等部位^[6]。贾志红等^[7]实验证明大鼠中骨连接蛋白可调节成骨细胞的增殖、分化、成熟等过程，使新生骨形成，参与骨重建过程。与此同时，KOS等^[8]发现骨连接蛋白与糖尿病及其并发症也存在一定的关系。而在牙齿牙合向伸长过程中，骨连接蛋白起何种作用目前尚未见相关报道。目前关于牙齿移动的研究大多数集中在正畸牙齿水平方向的移动，关于牙齿牙合向运动的文献报道很少。实验通过建立糖尿病无对颌牙实验动物模型，观察糖尿病对颌牙牙合向伸长运动的影响，为临床上糖尿病牙列缺损提供相关理论依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计对照观察动物实验。

1.2 时间及地点实验于2018年4至11月在山西医科大学第二医院骨科实验室完成。

1.3 材料

实验动物：6周龄雄性C57 BL/6J小鼠80只，体质量19-25 g，购买于山西医科大学动物实验中，许可证号：SCXK(晋)2015-0001。饲养于22-25 ℃环境中，12 h日夜循环，可自由摄入饮水及食物。实验方案经山西医科大学伦理委员会批准。

实验用主要试剂及仪器：链脲佐菌素(上海索莱宝生物科技有限公司，100 mg/瓶)；柠檬酸固体粉剂、柠檬酸钠固体粉剂(天津市致远化学试剂有限公司，500 g/瓶)；抗酒石酸酸性磷酸酶染色试剂盒(上海索莱宝生物科技有限公司)；TRIzol Reagent试剂盒(上海力敏实业有限公司)；PrimeScript^TMRT Master Mix试剂盒(大连TaKaRa宝生物工程有限公司)；TB Green^TMPremix Ex Taq^TMⅡ试剂盒(大连TaKaRa宝生物工程有限公司)；Micro CT扫描机viva CT80(深圳市弗劳恩科技服务有限公司)；Centrifuge 5430R 多功能离心机(恒科贸易有限公司)；NanoDrop ND-2000超微量分光光度计(上海创萌生物科技有限公司)；SimpliAmp热循环仪(上海普迪生物技术有限公司)；QuantStudio 6 Flex实时荧光定量PCR系统(上海普迪生物技术有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 糖尿病实验动物模型建立 ①0.1 mol/L柠檬酸钠缓冲液配制：0.1 mol/L柠檬酸溶液(21.01 g/L)与0.1 mol/L柠檬酸钠溶液(29.41 g/L)以28∶22体积比配制定容至 100 mL，pH=4.0-4.5；②链脲佐菌素溶液配制：以0.1 mol/L预冷的柠檬酸钠缓冲液缓冲链脲佐菌素粉剂，配置1%链脲佐菌素(10 g/L)溶液，现配现用。

将80只小鼠随机分成2组，即糖尿病组(n=50)和对照组(n=30)，适应性饲养1周后，给予小鼠禁食10 h，可自由饮水，糖尿病组腹腔注射链脲佐菌素70 mg/kg，对照组腹腔注射等量的柠檬酸钠缓冲液，连续注射5 d。末次分别注射72 h后，开始剪尾血测血糖，测前禁食、禁水10 h，共行4次血糖检测，每周1次，当测得空腹血糖≥11.1 mmol/L时认为糖尿病小鼠模型建立成功，建模期间注意记录观察小鼠的饮水、进食、尿量及体质量变化。

1.4.2 对颌牙牙合向伸长模型建立在建立糖尿病小鼠模型后，随机选择30只小鼠组成糖尿病组，将糖尿病组和对照组小鼠以4%水合氯醛1 mL/kg麻醉后拔除右上颌三颗磨牙，右下颌磨牙自然生长，拔牙后所有小鼠给予自由饮水及进食，建立对颌牙牙合向伸长模型。将两组分别分成5个亚组，即0，3，6，9，12 d组，于对应时间处死小鼠。

1.5 主要观察指标

右侧下颌骨骨密度测量：取小鼠右侧下颌骨，去除多余软组织，置于Micro CT扫描机viva CT80中，对整个右侧下颌骨进行扫描重建，扫描系数为(像素分辨率为37 μm，光管电压70 kV，光管电流114 μA)，并应用分析软件Mimics Medical 17.0测量骨密度值，测量结果取各小组所有小鼠测得的骨密度平均值。

右侧下颌骨组织学分析：将右侧下颌骨置于40 g/L多聚甲醛溶液中固定24-48 h，水洗30 min，10%EDTA脱钙液脱钙45-50 d。骨组织脱钙完成后梯度乙醇脱水，石蜡包埋，切成4 µm厚切片，放入60 ℃烤箱，20 min后进行抗酒石酸酸性磷酸酶染色。将石蜡切片置于二甲苯溶液脱蜡，梯度乙醇水化，水洗晾干后，抗酒石酸酸性磷酸酶固定液4 ℃固定30 s-3 min，水洗稍晾干，入Trap孵育液，于37 ℃温箱浸染45-60 min，水洗，甲基绿染色液复染2.0-3.0 min，水洗，晾干，镜检，利用Scanscope扫描系统对染色后切片进行扫描，使用Spectrum软件分析切片，将糖尿病组与对照组各小组切片随机选择5个高倍视野(×400)对破骨细胞进行计数，由同一名操作员在相同环境下进行3次测量，取平均值。

骨连接蛋白表达的检测：以RT-qPCR法检测骨连接蛋白在两组小鼠下颌牙牙合向伸长过程中的表达差异。将剪碎的下颌骨在研钵中研磨至粉末状，期间不断加入液氮，采用TRIzol 法提取RNA并纯化，反转录cDNA。将9.5 μL的灭菌超纯水、1 μL的c DNA、各1 μL的特异性引物F、R (终浓度均为1 μmol/L，表1)和12.5 μL的TB Green^TM Premix Ex Taq^TM Ⅱ共混合成25 μL，放入定量PCR仪中进行扩增, 扩增程序为：预变性1个循环，95 ℃ 30 s；PCR反应40个循环，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s。程序运行结束后, 记录Ct值，计算各组骨连接蛋白的相对表达量(注：采用2^-∆∆Ct法)。

1.6 统计学分析所有数据采用SPSS 22.0软件进行分析，数据以x(_)±s表示。采用独立样本t 检验统计显著性，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

糖尿病作为一种慢性疾病，不仅对全身健康有很大影响，还会增加口腔内其他疾病的风险。如因糖尿病患者唾液减少，口腔内残留食物残渣不能有效清洁，罹患龋病的概率就会显著增加，并且口腔内大量的有害细菌定植繁殖，由此产生的慢性炎症会破坏牙龈、牙齿支持组织，甚至牙槽骨。研究表明与非糖尿病患者相比，糖尿病患者患口腔疾病的概率大^[9-13]，此次实验观察糖尿病对拔牙后对颌牙牙合向伸长过程的影响，为临床糖尿病牙列缺损患者治疗方案的实施提供相关理论依据。

目前诱导糖尿病动物模型的药物有链脲佐菌素和四氧嘧啶，因链脲佐菌素具有更高的小鼠成活率和成模稳定率而被学术界普遍接受，此次实验通过多次小剂量腹腔注射链脲佐菌素成功获得糖尿病小鼠模型。

LIU等^[14-15]提出牙齿移动是一种由机械力介导的独特复杂骨修复过程。NAKASONE等^[16]、IMAI等^[17]通过拔除小鼠上颌磨牙建立非咬合模型，发现下颌牙根周继发有骨重建现象出现。KITASE等^[18]认为骨细胞在局部和系统地调节矿物质平衡，并协调成骨细胞和破骨细胞活性，调节骨形成和再吸收的机械刺激反应。同时有研究发现，在生理水平下咬合力可维持骨细胞的活性，而病理状态下咬合力可导致骨细胞死亡，进而影响整体骨改建与重塑^[19-20]。LUAN等^[21]通过拔除无疾病小鼠上颌磨牙建立无对颌牙模型，得出下颌牙在无对颌牙情况下出现牙齿牙合向伸长，并且证明牙齿的伸长是根尖周新生牙骨质和牙槽骨共同作用的结果。不过这些研究大多只是在宏观上观察到牙齿在移动过程中伴随骨质变化，而未直接测量骨密度变化进行验证。本实验通过测量两组小鼠牙合向伸长过程中骨密度变化，结果发现糖尿病组和对照组小鼠下颌骨均有骨密度增高现象，但糖尿病组增量小于对照组。因胰岛素具有促进骨形成作用，而糖尿病小鼠缺乏胰岛素或胰岛素代谢障碍，故糖尿病小鼠拔牙后下颌骨骨改建能力弱于对照组小鼠。实

验通过测量小鼠在拔牙后对颌牙伸长过程中骨密度的变化，准确直接的得出拔牙后对颌牙在伸长过程中伴随着骨质的变化。

抗酒石酸酸性磷酸酶是破骨细胞的标志性酶，为酸性磷酸酶的同工酶，绝大多数来源于破骨细胞，特异性的分布于破骨细胞胞浆中，染色酶活性部位为紫红色，核为阴性，为绿色，颜色反差大，易区分，特异性强^[22-23]。故此次实验通过抗酒石酸酸性磷酸酶染色破骨细胞可以更加直接准确的说明糖尿病小鼠在对颌牙牙合向伸长过程中的破骨细胞变化。结果显示在牙齿牙合向伸长过程中，糖尿病组和对照组小鼠下颌骨破骨细胞数目逐渐增加，且糖尿病组破骨细胞数少于对照组，这与此次实验关于骨密度测量得出的结论互相佐证，证明在牙齿牙合向伸长过程中伴随着骨改建过程，破骨细胞和成骨细胞相互作用调节骨吸收与骨形成过程，使这一结论更加让人信服。

骨连接蛋白是一种非结构性的细胞外间质蛋白，分子质量较小，为高度进化的保守序列，其基因位于人类第9号染色体，小鼠第11号染色体，由3个独立的区域组成：①末端酸性钙离子结合区域；②卵泡静止素同源的铜离子结合区域；③细胞外钙离子结合区域，其中最重要的功能是骨连接蛋白可以调节细胞外基质和基质金属蛋白酶的产生。研究发现骨连接蛋白与组织分化、重塑、胚胎发育、组织修复及胰岛素抵抗密切相关^[24]。KOS等^[8^，^25]提出骨连接蛋白的水平和活性变化与骨质疏松症、糖尿病及其并发症有一定的联系。同样BRADSHAW等^[26]通过敲除小鼠骨连接蛋白基因发现小鼠出现骨质疏松现象。此次实验通过RT-qPCR对骨连接蛋白进行特异性扩增，发现糖尿病组骨连接蛋白扩增量大于对照组，推测可能是骨连接蛋白对胰岛素具有抵抗作用，呈现出较对照组的高表达量，同时，糖尿病组和对照组小鼠右侧下颌骨中骨连接蛋白扩增量在上颌牙拔除后0-12 d内均出现逐渐增加的趋势，提示骨连接蛋白在牙齿牙合向伸长运动中起着一定的作用，这可能与骨连接蛋白作为压力转化器影响其他细胞外基质的合成，并且调节细胞外基质与羟基磷灰石的结合以适应该过程有关。

总之，对颌牙牙合向伸长是牙根周围牙骨质和牙槽骨共同作用的过程，虽然糖尿病对骨质改建过程起阻碍作用，但是胰岛素具有促进骨形成的作用，糖尿病小鼠因缺乏胰岛素，同时骨连接蛋白协同胰岛素共同作用，使下颌骨骨质疏松更明显。目前此次实验只对糖尿病对牙齿牙合向伸长及骨连接蛋白在该过程如何变化进行观察研究，后续还需对骨连接蛋白基因进行敲除，观察下颌骨骨质疏松倾向能否减弱，是否还存在其他因子在牙齿牙合向伸长过程起作用等一系列工作。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

糖尿病模型小鼠拔牙后对颌牙牙合向伸长过程中根周骨密度及相关因子的变化

Changes of bone mineral density and related factors during maxillary teeth occlusion after tooth extraction in diabetic mice

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