2.1  实验动物数量分析  实验过程中无动物死亡脱失，全部样本进入结果分析。

2.2  骨骼肌拉伤模型的验证  大鼠腓肠肌经腓肠肌拉断仪拉伤后，在拉伤处(小腿后侧)明显可见有凹陷及淤青(图2)。从外观上看，符合腓肠肌拉伤情形。

2.3  拉伤后肌纤维微结构的变化  光镜下骨骼肌肌纤维苏木精-伊红染色结果表明，对照组大鼠腓肠肌完整，肌纤维排列有序，结构清晰；拉伤后2 d腓肠肌肌纤维有多处拉断，拉伤处肌纤维排列紊乱，有炎性细胞聚集(图3)。

2.4  拉伤后各时相转化生长因子β1表达的变化  表1、图4结果显示：与对照组相比，损伤的骨骼肌内转化生长因子β1蛋白表达在伤后2 d明显增加(P < 0.05)，7 d再次出现显著差异(P < 0.05)，上升持续至21 d达峰值(P < 0.01)，28 d有所减少但差异仍有显著性意义(P < 0.05)。

2.5  拉伤后各时相结缔组织生长因子表达的变化  表1、图5结果显示，与对照组相比，损伤的骨骼肌内结缔组织生长因子蛋白表达在伤后明显增加且在2 d达到峰值(P < 0.01)，随后虽波动性下降，但恢复周期内各时相差异均有显著性意义(P < 0.05)。

2.6  拉伤后各时相MMP-1表达的变化  表2、图6结果显示，与对照组相比，损伤的骨骼肌内MMP-1蛋白表达在伤后即刻立即增加，4 d达高峰，而后逐渐下降，2，4，14 d表现出明显差异(P < 0.05)，后期波动平缓并恢复至对照水平。

2.7  拉伤后各时相TIMP-1表达的变化  表2、图7结果显示，与对照组相比，损伤的骨骼肌内TIMP-1蛋白表达在伤后初期无显著差异(P > 0.05)，7 d起明显增加(P < 0.05)，缓慢上升至21 d达峰值，28 d有所减少但仍明显高于对照组(P < 0.05)。

2.8  拉伤后各时相MMP-1/TIMP-1比值的变化  表3、图8结果显示，与对照组相比，损伤的骨骼肌内MMP-1/ TIMP-1蛋白比值在伤后2，4 d明显增加(P < 0.05)，之后逐渐减少甚至略低于对照水平，但差异无显著性意义(P > 0.05)。

骨骼肌损伤是最常见的运动损伤，并且对初级保健和运动医学提出了挑战。运动员可能通过各种途径损伤肌肉，包括直接创伤(例如撕裂、拉伤和挫伤)和间接损伤(与缺血和神经功能障碍有关) ^[1]。损伤后可发展为局部炎症反应、肌纤维再生及纤维化等病理趋势，直接干扰肌肉愈合效果及其功能型收缩。各种生长因子在骨骼肌再生修复中起着特定的作用，转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)是骨骼肌纤维化的启动因子^[2]，可以调控多种组织损伤反应。刘洪柏等^[3]研究报道，转化生长因子β1能够明显增强损伤肌组织卫星细胞的增殖分化，促进骨骼肌成纤维细胞表达。结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)是介导转化生长因子β1调节组织纤维化通路的下游顺位效应因子，负责细胞外基质的合成积聚。研究表明抑制转化生长因子β1表达可以减少结缔组织生长因子合成，诱导成肌细胞向成纤维细胞转化，对组织纤维化起促进作用^[4-5]。

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是降解细胞外基质中I/III型胶原蛋白的关键水解酶家族^[6]，调控肌卫星细胞的增殖和迁移。MMP-1能活化转化生长因子β1，对细胞外基质中胶原的沉积和降解起重要的调节作用。机体内存在天然的MMPs家族抑制剂，其中基质金属蛋白酶组织抑制因子(tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs)通过与活化阶段的pro-MMPs或活化后的MMPs结合成稳定复合物而发挥抑制作用^[7]。多数情况下，由于纤维化的形成和肌纤维再生不足，骨骼肌损伤的恢复通常是不完全的^[8-9]，形成的瘢痕组织总是机械力较差，妨害组织执行正常纤维的功能，进而拖累运动表现。

此次研究拟观察急性拉伤后不同时间点骨骼肌内上述纤维化因子的表达趋势，为骨骼肌损伤后的修复干预手段提供科学参考。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  随机对照动物实验。

1.2  时间及地点  实验于2016年进行，动物饲养、建模在北京体育大学实验动物中心进行，组织取样及指标检测在北京体育大学骨骼肌实验室内完成。

1.3  材料  112只6周龄雄性SD大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，批准号为SYXK(京)2016-0033，SPF级，体质量(186.25±8.37) g。饲养、建模过程中维持室温(22±2) ℃，相对湿度40%-55%，12/12 h循环照明拟昼夜交替。大鼠进入饲养室后分笼饲养，不对饮食饮水做特殊控制，适应环境3 d后进行后续实验。实验通过北京体育大学运动科学实验伦理委员会批准。

1.4  方法

1.4.1  动物分组  112只雄性SD大鼠随机分为对照组(n=56)和拉伤组(n=56)，每组根据不同的伤后取材时间又随机分为7个亚组(n=8)，即刻组、2 d组、4 d组、7 d组、14 d组、21 d组和28 d组。

1.4.2  骨骼肌拉伤建模  按大鼠体质量腹腔注射5%水合氯醛(4 mL/kg)进行麻醉，大鼠仰卧位固定且踝关节游离，2根连接电刺激仪的银针电极分别刺入腓肠肌的肌腹两端，50 V电压刺激胫后肌群强直收缩致踝关节趾屈，后迅速使用“大鼠腓肠肌肌肉拉伤试验机”(专利号ZL 2012 2 0466604.1)以0.55 m/s的速率反向牵拉(图1)，迫使踝关节以25.56 r/s的角速度背屈，腓肠肌离心收缩造成腓肠肌一次性急性拉伤。

1.4.3  组织取样与保存  按照各组对应时相，根据大鼠体质量腹腔注射10%水合氯醛(4 mL/kg)进行麻醉，手术分离仰卧固定的大鼠伤肢腓肠肌，取剔除筋膜和脂肪后的损伤部位小块肌腹，异戊烷快速冷冻备用制作石蜡切片和苏木精-伊红染色；其余可用组织包裹锡纸暂入液氮保存，后转移到-80 ℃冰箱备以蛋白测试。

1.4.4  指标测定与方法

苏木精-伊红染色观察骨骼肌损伤模型可靠性：用冷冻超薄切片机(Leica，Nussloch， Germany)把预备的肌组织样品横切为10 μm的薄片置于载玻片上(-22 ℃)。切片依次入甲醇固定1.5 min；苏木素染色3 min；1%盐酸乙醇分化    5 s；氨水返蓝5 min；伊红染1 min；梯度乙醇脱水；二甲苯透明；树胶封固。用显微镜(麦克奥迪)观察各样本的4角及中央共5个视野区域的肌纤维并获取图片(10×10倍数)。

Western blot检测骨骼肌纤维化因子的表达水平：液氮研磨冻存的肌肉样品后称取0.1 g并混入预冷的裂解液(1︰9)，冰浴中匀浆后静置半小时，离心取上清       (12 000 r/min，4 ℃，20 min)。BCA法检测蛋白浓度混入5倍上样缓冲液(4︰1)，沸水浴5 min变性固定。使用5%积层胶和12%分离胶，取20 μg蛋白样品于积层胶80 V，分离胶120 V条件下电泳，以预染蛋白marker鉴定电泳时间。湿转法转膜90 min(300 mA，90 min；5%BSA封闭液，室温)。同样浓度的封闭液稀释一抗转化生长因子β1 (1︰4 000)、结缔组织生长因子(1︰5 000)、MMP-1    (1︰5 000)、TIMP-1(1︰5 000)、GAPDH(1︰4 000)以及二抗(1︰10 000)，抗体购于CST和北京赛诺博生物技术中心。以ECL发光剂在室温下的凝胶成像系统中化学发光，分析蛋白条带灰度值，以GAPDH为内参。

1.5  主要观察指标  包括骨骼肌肌纤维结构，以及骨骼肌纤维化因子转化生长因子β1、结缔组织生长因子、MMP-1和TIMP-1的表达水平。

1.6  统计学分析  采用SPSS 20.0软件分析数据并用x(_)±s表示结果。单因素方差分析法(One-way ANOVA)检验对照组和拉伤组内7个不同时相4种纤维化调控蛋白的表达水平，设置显著性水平为α=0.05。

3.1  大鼠腓肠肌拉伤建模  通过步进电机及相关控制器操作 “大鼠腓肠肌肌肉拉伤试验机”(专利号ZL 2012 2 0466604.1)以模拟人小腿肌肉的普通拉伤力学原理，进行无明显外创的肌肉拉伤。大鼠腓肠肌经拉伤操作后，在牵拉部位明显可见凹陷及淤青，观察结果符合腓肠肌一般拉伤情形。对照组光镜下观察可见骨骼肌肌纤维完整，排列规则且结构清晰；拉伤组骨骼肌纤维有多处断裂，拉伤处肌纤维排列紊乱，有炎性细胞聚集，可初步判定拉伤模型建制成功。值得注意的是，此次研究在确认模型建立状态时仅对样本进行随机抽查，可能存在局限。

3.2  骨骼肌的运动损伤  骨骼肌由长圆柱形的多核肌管细胞有序阵列组成，在日常人体活动中发挥重要的动力作用。肌组织的损伤可源于身体运动期间经历的机械应力或遗传疾病导致的肌纤维脆性增加，其中骨骼肌的运动损伤多发生在离心运动中，占所有运动相关损伤的35%- 55%^[10]。多数类型肌肉损伤的修复机制是相似的，包括3个阶段^[11]：损伤和炎症阶段(1-3 d)，修复阶段(三四周)和重塑阶段(3-6个月)，最后2个阶段往往重叠。

第一阶段^[12-13]，当肌肉受伤时，肌纤维破裂并坏死，血肿形成，此时炎症细胞由于血管破裂可以自由地侵入损伤部位，最终转化为巨噬细胞，巨噬细胞通过吞噬作用去除坏死的肌纤维，并且与成纤维细胞一起产生生长因子、细胞因子和趋化因子等信号。尤其，细胞外基质中的生长因子在组织受损时变得活跃，如成纤维细胞生长因子(FGF)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、胰岛素样生长因子2(IGF-2)、转化生长因子β、肝细胞生长因子(HGF)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素6(IL-6)等可激活肌源性前体，也就是卫星细胞。

修复阶段由2个伴随过程组成^[14-16]：首先是肌纤维的再生，依赖于肌纤维基底层下存在的卫星细胞增殖分化为成肌细胞，肌纤维两端之间在受损后形成的间隙将被新成肌细胞填充；第2个过程由纤维蛋白和纤连蛋白形成结缔组织瘢痕，瘢痕组织赋予肌肉力量以抵抗收缩，并且是成纤维细胞侵入肉芽组织的靶位。然而，成纤维细胞过度增殖会在肌肉损伤处形成致密的瘢痕组织，不仅干扰修复，可能中断肌肉再生并且在第3阶段导致受损肌肉的不完全功能恢复。在最后的重塑阶段^[14-16]，新生肌纤维成熟，瘢痕组织被重组并收缩。

整个过程通过不同的机制协调^[17]，如细胞和细胞、细胞和基质相互作用以及细胞外分泌因子。例如，肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子、白细胞介素1和白细胞介素6可以刺激卫星细胞活性；成纤维细胞生长因子可以激活卫星细胞，也可以抑制其分化。此次研究主要观察了转化生长因子β1、结缔组织生长因子、MMP-1和TIMP-1四种纤维化调控因子在骨骼肌急性拉伤后28 d恢复过程中的变化趋势。

3.3  转化生长因子1/结缔组织生长因子在骨骼肌拉伤中的作用  转化生长因子β1是多功能细胞因子超家族成员之一，诱导细胞外基质合成与积聚，在调节正常生理过程如胚胎发育、骨骼成型和机体免疫反应中起重要作用^[18]。结缔组织生长因子是转化生长因子β1下游的纤维化标志物和介导者，在多种器官疾病的致纤维化过程中调控转化生长因子β1的许多功能，而在肌肉疾病中，过表达的结缔组织生长因子和转化生长因子β1是生成进行性瘢痕的主要因 素^[19]。有研究表明这种功能与SMAD2/3、MAPK及PKC等信号通路的活化紧密相关^[20-22]。

早期研究证实转化生长因子β1可促使一些再生肌纤维降解并转化为肌成纤维细胞，使细胞外基质中胶原过度合成，加重受损骨骼肌中纤维化的形成^[23]。LI等^[24-25]在其多个研究中指出，受损骨骼肌中转化生长因子β1的表达具有时间依赖性，在损伤后3-5 d内达到一次峰值，然后在损伤的中后期再次达到峰值，第2次峰值似乎与纤维化的形成和无效的肌肉再生有关^[24]。此外，在损伤后14 d用抗纤维化药物阻断转化生长因子β1表达的第2个峰时，可以促进受损肌肉的组织学和生理学改善^[26-27]。同样地，此次研究结果显示，骨骼肌转化生长因子β1蛋白含量在拉伤后两度攀升，分别于2 d和21 d出现两次峰值(P < 0.05)，7-21 d持续上升，28 d处于下降阶段但仍明显高于对照组(P < 0.05)，这提示转化生长因子β1在损伤的骨骼肌组织初期开始高表达，且具有时间依赖性。鉴于转化生长因子β1对纤维组织增生的明显调节作用，可推测转化生长因子β1迅速参与了骨骼肌伤后炎症反应的病理生理过程，并启动了肌组织的纤维化发展。

结缔组织生长因子参与纤维化的诱导和进展、伤口愈合和几种纤维退行性疾病的瘢痕形成^[28-29]。在大多数组织中，正常条件下结缔组织生长因子几乎不表达，然而其水平与纤维化的程度以及严重性密切相关，如皮肤和肺肾肝等的纤维化、晚期动脉粥样硬化病变以及肌营养不良    症^[28-32]。已有研究者通过评估抑制结缔组织生长因子表达的可能性证实了其可用性的降低与纤维化的减少有关^[33]。另有报道认为结缔组织生长因子可以诱发炎症反应^[34-36]，并且在心肌细胞和黏膜细胞中诱导了促炎细胞因子如肿瘤坏死因子α、白细胞介素6和MCP1的表达。

CABELLO-VERRUGIO等^[37]指出，被骨骼肌收缩时释放的[Ca²⁺]所增加的线粒体中的活性氧(ROS)介导了成肌细胞中结缔组织生长因子的表达，证实结缔组织生长因子参与活性氧诱导的骨骼肌损伤。TALL等^[38]认为，结缔组织生长因子可刺激成纤维细胞活化增殖，与转化生长因子β1具有促纤维化协同作用，且表现为伴随性表达。此次研究得到相似结论，骨骼肌结缔组织生长因子蛋白含量在拉伤后2 d达峰值(P < 0.01)，之后虽逐步下降，但拉伤后28 d仍显著高于对照组  (P < 0.05)。作者推测拉伤短时间内激活了结缔组织生长因子的表达，标志骨骼肌纤维化的生成。此外，结果中结缔组织生长因子的表达在伤后2 d即出现整个恢复期的唯一峰值，且高于转化生长因子β1，作者推测损伤初期结缔组织生长因子高表达放大了转化生长因子β1的纤维化启动功能，进一步促进肌卫星细胞的增殖迁移，推动肌组织向纤维化方向发展。

3.4  MMP-1/TIMP-1在骨骼肌拉伤中的作用  MMPs蛋白内切水解酶家族可按照成员不同的跨膜结构域分类，其中胶原酶MMP-1具有分解胶原蛋白I/III型的功能^[39]。MMPs家族在健康组织的发育过程中对重塑阶段，即细胞外基质的降解有重要调控作用，包括降解整个细胞外基质的成分、控制组织结构和平衡^[40]。其中MMP-1的表达升高可以减少细胞外基质沉积，缓解组织纤维化程度。MMPs活性受机体内蛋白水解级联反应与该家族的抑制剂调控，TIMPs是其中最重要的一种负性天然调节物，除干预细胞外基质降解外还具有抗细胞凋亡作用^[41]。目前已鉴定的TIMPs有4种类型：TIMP-1，TIMP-2，TIMP-3和TIMP-4，来源广泛可由多种细胞在不同条件下分泌，尽管TIMPs可以抑制任何类型的MMPs，相应抑制水平存在差异^[42]。活体内MMPs/TIMPs比率的稳态对蛋白分解程度及持续时间起关键调控作用^[43]。

已有研究证实在口腔黏膜纤维化的人体模型和肾纤维化的动物模型病理过程中^[44-46]，通过改变MMP-1水平可有效抑制纤维化的发展，并观察到MMP-1和TIMP-1表达在同一时相存在的明显高低反差，这与此次研究结果类似。此次研究中，MMP-1表达在骨骼肌伤后2 d起明显增加(P < 0.05)，4 d达到峰值(P < 0.01)，提示MMP-1在骨骼肌组织的损伤早期被激活并参与炎症反应；14 d再次发现的高水平表达显示炎症过程仍有部分存在并接近完成。鉴于MMP-1降解瘢痕组织的作用，可推测损伤初期MMP-1抑制了纤维组织发生发展。同时，损伤肌组织内TIMP-1含量初期无明显变化，这表明TIMP-1的形成较慢。7 d起开始高表达并持续至28 d(P < 0.05)，这提示TIMP-1参与到骨骼肌损伤修复过程并发生了对MMP-1活性水平升高的反应，细胞外基质降解失衡。

当由MMP-1及其抑制剂TIMP-1控制的细胞外基质的降解和置换之间存在平衡时，会发生结缔组织的修复和新生，即MMP-1/TIMP-1之间的比率代表细胞外基质的平衡，是两种因子各自表达水平的重要补充^[47]。ULRICH等^[48]对胶囊纤维化疾病的研究发现，仅MMPs和TIMPs的各自含量都没有实际变化，只有比值水平的平衡发生了变化，而这种不平衡导致了细胞外基质的积聚，从而降低组织的顺应性。王世强等^[49]研究发现，16周大强度运动致大鼠心肌纤维化模型中，心肌组织TIMP-1表达明显增加，MMP-1变化不明显，说明MMP-1/TIMP-1比值降低可以诱导心肌纤维化。WRIGHT等^[50]研究指出，衰老大鼠的纤维化肌组织中MMP-1和TIMP-1显著高表达，MMP-1/TIMP-1平衡失调。此次研究中骨骼肌伤后2 d和4 d时相 MMP-1/TIMP-1表达比率明显提高(P < 0.05)，后期与对照水平的差异消失，提示伤后初期细胞外基质降解与合成失衡，而后MMP-1表达逐渐受TIMP-1抑制，对骨骼肌纤维化的消除作用逐渐减弱，组织经历内部调节后向结缔组织的修复再生方向发展。此次研究仅观察了一次急性拉伤后腓肠肌内纤维化主要调控因子的表达水平变化，后续研究应进一步观察探讨不同恢复干预手段对骨骼肌纤维化进程的调节机制，以及相关通路的下游因子变化，为有效的康复措施提供理论基础和实践依据。

结论：骨骼肌拉伤恢复进程中，转化生长因子β1/结缔组织生长因子蛋白通路激活，趋于骨骼肌纤维化的发生发展；同时，MMP-1和TIMP1先后被激活，参与骨骼肌的修复过程。

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文题释义：

纤维化：骨骼肌损伤修复进程包括依赖于成肌细胞激活和分化的肌纤维再生和胶原纤维进行持续合成和降解的结缔组织重塑两部分，这2个过程同时进行，相互支持又相互竞争制约。二者协调性是损伤肌肉修复质量的关键，当这2个过程速度吻合时，骨骼肌损伤完全修复；当结缔组织合成速度超过肌纤维再生时，形成瘢痕组织，骨骼肌纤维化。

纤维化因子：多种细胞因子在骨骼肌再生修复过程中调节纤维化的发生发展。转化生长因子(TGF-β)能够刺激成肌细胞转化为肌成纤维细胞，是促纤维化因子。结缔组织生长因子(CTGF)是介导转化生长因子β促纤维化作用的直接下游效应因子，主要参与纤维重塑。基质金属蛋白酶(MMPs)可以调控肌卫星细胞的增殖和迁移并调节细胞外基质中胶原的沉积和降解，是纤维化消除因子。基质金属蛋白酶组织抑制因子(TIMPs)是体内天然的基质金属蛋白酶家族抑制分子，被视作纤维化抑制因子。

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转化生长因子β1是多功能细胞因子超家族成员之一，诱导细胞外基质合成与积聚，在调节正常生理过程如胚胎发育、骨骼成型和机体免疫反应中起重要作用。结缔组织生长因子是转化生长因子β1下游的纤维化标志物和介导者，在多种器官疾病的致纤维化过程中调控转化生长因子β1的许多功能，而在肌肉疾病中，过表达的结缔组织生长因子和转化生长因子β1是生成进行性瘢痕的主要因素。

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