骨水泥间隔器表面微观形貌改变对诱导膜内成骨因子表达的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2217

中国组织工程研究 ›› 2020, Vol. 24 ›› Issue (10): 1502-1507.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2217

• 组织工程骨及软骨材料 tissue-engineered bone and cartilage materials • 上一篇下一篇

骨水泥间隔器表面微观形貌改变对诱导膜内成骨因子表达的影响

李树源¹，周琦石²，李悦²，林知毅³，周宏亮¹，申震¹，胡柽¹，杨佳宝¹

¹广州中医药大学第一临床医学院，广东省广州市 510405；²广州中医药大学第一附属医院一骨科，广东省广州市 510405；³广州市番禺区中医院，广东省广州市 511400

收稿日期:2019-06-03 修回日期:2019-06-11 接受日期:2019-07-10 出版日期:2020-04-08 发布日期:2020-02-14
通讯作者: 周琦石，副教授，广州中医药大学第一附属医院一骨科，广东省广州市 510405
作者简介:李树源，男，1991年生，山西省汾阳市人，汉族，广州中医药大学第一临床医学院在读硕士，主要从事创伤骨科研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(81674001)

Effects of changes in surface morphology of bone cement spacer on the expression of bone growth factor in induced membrane

Li Shuyuan¹, Zhou Qishi², Li Yue², Lin Zhiyi³, Zhou Hongliang¹, Shen Zhen¹, Hu Cheng¹, Yang Jiabao¹

¹The First Clinical Medical College, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China; ²First Department of Orthopedics, First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China; ³Panyu Hospital of Chinese Medicine, Guangzhou 511400, Guangdong Province, China

Received:2019-06-03 Revised:2019-06-11 Accepted:2019-07-10 Online:2020-04-08 Published:2020-02-14
Contact: Zhou Qishi, Associate professor, First Department of Orthopedics, First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China
About author:Li Shuyuan, Master candidate, The First Clinical Medical College, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81674001

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥：为临床上常用的骨科植入材料，具有很大的抗压能力，抗压缩能力为97 MPa，也具有良好的生物相容性。1987年Galibert等首次报道用聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥来治疗椎体血管瘤，并将此技术称之为经皮椎体成形。1970年Buchholz首次应用载抗生素骨水泥控制关节感染，目前以聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥作为抗生素的缓释载体被广泛应用于人工全髋关节置换及骨髓炎的治疗。
转化生长因子β1：是具有多种功能的蛋白多肽，是“转化生长因子β超家族”成员之一，大量存在于骨组织与血小板中，可以刺激间充质干细胞的增殖、分化，并抑制间充质干细胞向脂肪细胞分化，也促进成骨细胞、成软骨细胞的增殖及细胞外基质的合成，诱导膜内成骨和软骨内成骨。

背景：目前国内外学者试图通过改变植入材料的种类和形貌、改良诱导膜厚度、光滑程度等机械化学性能来促进植骨生长。

目的：比较大鼠股骨骨缺损处不同表面粗糙程度聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥形成的诱导膜在膜内血管化程度和部分成骨因子表达的差异。

方法：取48只雄性SD大鼠(购自广州中医药大学实验动物中心)建立大鼠临界尺寸股骨缺损模型，按随机数字表法分为A、B、C、D组，分别在股骨骨缺损处植入表面粗糙度<1.5 µm、1.5-2.0 µm、5.0-7.0 µm、14.0-20.0 µm的聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥占位器。植入6周大鼠体内诱导膜形成后取出骨水泥周围的诱导膜，苏木精-伊红染色观察诱导膜病理组织形态结构变化，采用Western Blot印迹方法和免疫组织化学染色法对诱导膜中骨形态发生蛋白2、转化生长因子β1、血管内皮生长因子蛋白进行定量和定性分析。实验获得广州中医药大学动物实验伦理委员会批准，批准号：20181101006。

结果与结论：①苏木精-伊红染色显示，4种表面粗糙程度不同的骨水泥均可以形成较为规则的诱导膜，4组诱导膜之间血管化程度和细胞的数量大体相似；②Western Blot印迹检测显示，各组诱导膜内骨形态发生蛋2、转化生长因子β1、血管内皮生长因子蛋白平均含量基本相似(P > 0.05)；③免疫组织化学染色显示，各组诱导膜内骨形态发生蛋2、转化生长因子β1、血管内皮生长因子蛋白阳性表达基本相似(P > 0.05)；④结果表明，骨水泥表面粗糙程度改变对诱导膜的组织形态结构和骨形态发生蛋2、转化生长因子β1、血管内皮生长因子表达在6周时无明显影响。

ORCID: 0000-0003-1405-0765(李树源)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥, 表面形貌, 诱导膜, 微血管, 骨生长因子, 骨形态发生蛋2, 转化生长因子β1, 血管内皮生长因子

Abstract:

BACKGROUND: At present, scholars at home and abroad try to promote the growth of bone graft by changing the types and morphology of implant materials, and improving the thickness and smoothness of induced membrane.

OBJECTIVE: To compare the degree of vascularization and the expression of some osteogenic factors in the polymethylmethacrylate bone cement membrane with different surface roughness degrees at different femoral bone defects in rats.

METHODS: Forty-eight male Sprague-Dawley rats (purchased from the Experimental Animal Center of Guangzhou University of Chinese Medicine) were used to establish rat models of critical-size femur defect. These rat modes were then randomly divided into groups A, B, C and D. Polymethylmethacrylate bone cement occupiers with surface roughness < 1.5 μm, 1.5-2.0 μm, 5.0-7.0 μm, and 14.0-20.0 μm were implanted in the femoral bone defects, respectively. At 6 weeks after implantation of bone cement spacer, the induced membranes around bone cement were removed. The morphological changes of the induced membranes were observed by hematoxylin-eosin staining. Western blotting and immunohistochemical staining were used to detect bone morphogenetic protein 2, transforming growth factor beta 1 and vascular endothelial growth factor protein in the induced membranes for quantitative and qualitative analyses. This study was approved by the Animal Ethics Committee of Guangzhou University of Chinese Medicine, China (approval No. 20181101006).

RESULTS AND CONCLUSION: Hematoxylin-eosin staining showed that four kinds of bone cement with different surface roughness degrees could form a relatively regular induced membrane. The degree of vascularization and the number of cells in the induced membrane were similar among the four groups. Western blot analysis showed that the average levels of bone morphogenetic protein 2, transforming growth factor β1 and vascular endothelial growth factor protein were similar among four groups (P > 0.05). Immunohistochemical staining revealed that the positive expression of bone morphogenetic protein 2, transforming growth factor β1 and vascular endothelial growth factor protein was similar among four groups (P > 0.05). These findings suggest that the change of surface roughness of bone cement has no significant effect on the histomorphological structure of induced membrane and the expression of bone morphogenetic protein 2, transforming growth factor β1 and vascular endothelial growth factor in induced membrane at 6 weeks after implantation of bone cement spacer.

Key words: polymethylmethacrylate bone cement, surface morphology, induced membrane, microvessel, bone growth factor, bone morphogenetic protein 2, transforming growth factor β1, vascular endothelial growth factor

中图分类号:

李树源, 周琦石, 李悦, 林知毅, 周宏亮, 申震, 胡柽, 杨佳宝. 骨水泥间隔器表面微观形貌改变对诱导膜内成骨因子表达的影响[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(10): 1502-1507.

Li Shuyuan, Zhou Qishi, Li Yue, Lin Zhiyi, Zhou Hongliang, Shen Zhen, Hu Cheng, Yang Jiabao. Effects of changes in surface morphology of bone cement spacer on the expression of bone growth factor in induced membrane [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2020, 24(10): 1502-1507.

图/表（结果） 3

2.1 诱导膜形态结构观察结果光学显微镜下观察诱导膜病理组织苏木精-伊红染色切片，4种表面粗糙程度不同的骨水泥均可以形成较为规则的诱导膜，其结构大致表现为靠近骨水泥的内层为滑膜状上皮细胞，中间层为成纤维细胞、肌纤维细胞、胶原纤维等，远离骨水泥的外层为微血管和肌肉分布。4组诱导膜之间血管化程度和细胞的数量大体相似，见图3。

2.2 诱导膜Western Blot蛋白免疫印迹检测结果根据Western Blot蛋白免疫印迹条带的灰度值检测结果，各组诱导膜内血管内皮生长因子、骨形态发生蛋白2、转化生长因子β1蛋白平均含量基本相似，差异无显著性意义(P > 0.05)。但仍有细微差别，B、C组膜内血管内皮生长因子、骨形态发生蛋白2、转化生长因子β1的平均蛋白量均略大于A、D组(P > 0.05)。上述结果表明，骨水泥表面微观形貌的改变不会影响骨水泥植入6周时诱导膜内血管内皮生长因子、骨形态发生蛋白2、转化生长因子β1的蛋白表达量，见图4。

2.3 诱导膜免疫组织化学观察结果光学显微镜下观察各组诱导膜免疫组织化学染色图片，见图5，图中蓝色斑点状结构表示诱导膜内滑膜样上皮细胞、成纤维细胞镜或肌纤维细胞的细胞核，大致呈条带状或片状分布的棕色区域代表膜内血管内皮生长因子、骨形态发生蛋白2、转化生长因子β1蛋白的阳性表达。结果表明，B组、C组诱导膜内血管内皮生长因子、骨形态发生蛋白2、转化生长因子β1的阳性表达区域颜色深度、范围要略大于A组、D组，但各组之间并无明显差异。这与Western Blot蛋白定量结果相一致。

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引言

材料方法

1.1 设计对比观察动物实验。

1.2 时间及地点实验于2018年12月至2019年5月在广州中医药大学实验动物中心和岭南医学研究中心完成。

1.3 材料聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥理化性能，见表1。

实验动物：选取SPF级健康10周龄雄性SD大鼠48只，体质量240-280 g，平均(256.4±23.1) g，购自广州中医药大学实验动物中心，许可证号：SCXK(粤)2013-0020，实验动物合格证号：44005800004755。所有实验动物均由广州中医药大学SPF级动物房饲养，实验室温度22-24 ℃，相对湿度60%-70%，光暗周期为12 h/12 h，由广州中医药大学实验动物中心提供的饲料进行喂养，适应性饲养1周后开始进行实验。将48大鼠按随机数字表法分为A、B、C、D组，分别在股骨骨缺损处植入表面粗糙度<1.5 µm、1.5-2.0 µm、5.0-7.0 µm、14.0-20.0 µm的聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥占位器，每组12只。实验获得广州中医药大学动物实验伦理委员会批准，批准号：20181101006。

实验用主要试剂与仪器：苏木精-伊红染色液(广州凯秀贸易有限公司，批号：16051837)；蛋白提取液(碧云天生物)；十二羟硫酸钠(广州浩玛生物)；二硫苏糖醇、丙烯酰胺(Sigma)；四甲基乙二胺(广州浩玛生物)；过硫酸铵(国产广州化学试剂厂)；甘氨酸(鼎国)；甲醇(广州化学试剂厂、吐温-20(Tween-20)；40 g/L多聚甲醛固定液(北京Biosharp公司，批号1704464)；注射用青霉素钠(华北制药股份有限公司，160万单位/瓶，国药准字 H13020655)；定制6孔不锈钢钢板(东莞市横沥燎原模具加工店)；1.5 mm皮质骨自攻螺钉(东莞市横沥燎原模具加工店)；砂纸(鹰牌)；超声细胞破碎仪(上海天呈科技有限公司)；垂直电泳仪及转移系统(BIO RAD)；射线摄影暗匣(5X7英寸富士X光片发光暗盒，广州浩玛生物)；脱色摇床(Rotomix公司)；BX53 生物显微镜(日本Olympus公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 骨水泥的制备将聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥粉末和万古霉素按比例混合(每40 g骨水泥粉加入万古霉素4 g)后，加入液体并充分混匀，用注射器注入内表面光滑的管状模具内，静置凝固半小时后，形成表面光滑的圆柱状骨水泥，用骨剪剪取4个节段，其中1段不需砂纸打磨，为表面光滑的A组(<1.5 µm)，另外3段分别采用2 000，1 000，500目的砂纸打磨抛光，形成表面粗糙程度分别为 1.5-2.0 µm、5.0-7.0 µm、14.0-20.0 µm的表面形貌，为B组、C组、D组，于电子显微镜下放大200倍观察表面并拍摄图片，见图1。所有骨水泥经生理盐水清洗，体积分数75%乙醇擦拭和高温高压蒸汽灭菌后开始使用。

1.4.2 动物模型的建立实验大鼠术前禁食12 h，予4× 10⁴ U青霉素钠术前肌肉注射，以3%戊巴比妥钠(1.5 mL/kg)腹腔注射麻醉，麻醉起效后右后肢剃毛备皮，大鼠取左侧卧位，显露右后肢，消毒、铺无菌洞巾。沿股骨外侧自股骨大转子至股骨外侧髁纵形切开皮肤、筋膜，切口约3 cm，分离皮下肌肉，显露股骨外侧面。于股骨前外侧放置定制的6孔钢板，远近端分别于2枚皮质骨自攻螺钉固定钢板，在股骨干中央位置用线锯进行截骨，截骨长度为4 mm。骨缺损区以预制的长度为4 mm的圆柱形抗生素骨水泥块嵌入填充，A组使用表面光滑的骨水泥填充(<1.5 µm)，B组使用表面粗糙程度为1.5-2.0 µm的骨水泥填充，C组使用表面粗糙程度为5.0-7.0 µm 的骨水泥填充，D组使用表面粗糙程度为14.0-20.0 µm的骨水泥填充，使用3-0丝线捆绑骨水泥块于钢板上，生理盐水反复冲洗后逐层缝合切口，见图2。

术后3 d内，每组常规予4×10⁴ U青霉素钠肌肉注射，预防感染，单笼饲养至术口愈合。

1.4.3 标本采集与处理术后6周大鼠诱导膜形成后，以3%戊巴比妥钠(1.5 mL/kg)腹腔注射麻醉，常规消毒铺巾，沿原手术入路切开，剥离取出诱导膜。每组分别取4只大鼠的诱导膜组织放入体积分数10%甲醛溶液中固定24 h，每组其余大鼠的诱导膜组织取出后放入冻存管，立即液氮保存。

1.5 主要观察指标

诱导膜组织形态结构观察：取出于甲醛溶液中固定的诱导膜组织，经脱水、石蜡包埋等处理后，用组织切片机对诱导膜组织进行连续切片，切片厚度为5 μm。随后将蜡片平铺于载玻片上，再将切片放于恒温摊片烤片机中68 ℃烤片，用苏木精-伊红染色法对诱导膜切片进行染色，封固后在光学显微镜下观察诱导膜的形态结构及其血管密度。

生长因子蛋白含量测定：取出冻存管内的诱导膜组织，经样品的裂解、离心、蛋白提取等操作后，采用Western Blot蛋白免疫印迹法进行血管内皮生长因子、骨形态发生蛋白2、转化生长因子β1蛋白含量测定。经样品的电泳、转膜、封闭、抗体孵育等流程后，将孵育膜拿至暗房进行孵育反应。加入胶片富士感光胶片，压片2 min，显影3 min，定影10 min。内参蛋白质为GAPDH。使用Image J软件分析各个条带的灰度值，并进行统计分析。

免疫组织化学染色：将组织切片后，常规脱蜡至水。经孵育、蒸馏水冲洗、滴加抗体、PBS冲洗、显色剂显色，自来水冲洗、复染、脱水后封固。在光学显微镜下观察诱导膜膜内血管内皮生长因子、骨形态发生蛋白2、转化生长因子β1的表达情况。

1.6 统计学分析所有数据均采用Stata 12.0软件进行分析，生长因子蛋白含量等计量资料以x(_)±s表示，首先使用Levene检验判断数据是否为正态分布及方差齐性，满足条件后各组均数之间比较采用单因素方差分析，若差异有统计学意义，则再采用Bonferroni检验法进行组间两两比较，P < 0.05表示差异有显著性意义。

讨论

尽管Masquelet技术(诱导膜技术)在世界范围内得到了广泛的推广和临床应用^[10-11]，并对诱导膜技术进行了大量临床和基础研究，但诱导膜促进成骨方面的具体机制目前尚不明确，在植骨前对诱导膜的干预和处理也还没有明确的标准^[12]。

近年来，有学者试图通过改变一期骨缺损区填充材料的种类和形貌来改变诱导膜的形成性质，增强其成骨的能力^[13]。研究表明，植入物的表面特性会影响诱导膜的特性^[14-15]。从物理角度看，粗糙的植入材料可以提供更多的牵引力，减少材料周围组织运动，影响周围细胞黏附和基质形成，从而形成更薄的膜^[16]。诱导膜具有间隔屏障作用，薄膜会加快植骨区与周围软组织之间生长因子的传递^[17]。有研究表明，诱导膜内层靠近粗糙间隔物处有更发达的滑膜样改变和绒毛状增生，膜更为柔顺，而膜顺应性的改变可以改变整个骨力传递到膜内的单个细胞，进而影响细胞分化，间接调节骨修复^[18]；从生物化学角度看，细胞黏附是细胞增殖和分化的前提，而细胞的早期黏附与生物材料的表面形貌关系密切^[19-20]。聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥植入物表面粗糙的微环境，理论上有利于成纤维细胞、肌纤维细胞、滑膜上皮细胞、成骨细胞的伪足和细胞外基质的黏附，以及随后生长因子的表达与细胞的生长行为。

粗糙表面应是细胞可识别的微米、纳米级结构的表面，应以细胞的平均大小为参考。大多数细胞直径在10-20 µm之间，如成骨细胞直径为10-20 µm，当骨水泥表面凸起微结构之间的间距小于细胞直径时，更有利于细胞伪足和细胞外基质形成新的黏附，进行细胞迁移；相反，凸起之间的间距大于这些细胞的直径时，对于细胞个体而言均属于光滑表面，均不利于细胞黏附和细胞的生长行为。TOTH等^[21]对10周龄雄性SD大鼠构建6 mm股骨缺损，植入表面光滑(1 μm)或粗糙(8 μm)的聚甲基丙烯酸甲酯间隔物，4周后对膜区再生因子半定量表达进行分析，发现其结构和生化表达相似，但粗糙表面诱导的膜增加了白细胞介素6的表达水平，导致骨愈合效果降低。相对而言，聚甲基丙烯酸甲酯光滑表面诱导的膜可以更好地支持骨再生，后期骨愈合率更高。此次实验结果显示不同粗糙程度聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥所诱导的生物膜，在6周时血管内皮生长因子、骨形态发生蛋白2、转化生长因子β1表达方面存在一定差别，即1.5-2.0 μm、5.0-7.0 μm粗糙程度表面所诱导的膜膜内部分生长因子的表达量要略多于其余两组，但4组并无明显差异(P > 0.05)。从组织形态学上看，4组诱导膜内无论是新生血管的密度还是成纤维细胞、肌纤维细胞数量均相似。原因可能为：①骨水泥表面形貌的改变这一因素本身，对诱导膜细胞黏附和血管内皮生长因子、骨形态发生蛋白2、转化生长因子β1的分泌量影响较小；②诱导膜内骨生长因子在不同时间点呈现动态的表达过程^[22-24]，此次实验未能对各个时间段相关生长因子的表达进行评估，6周时各组膜内的血管内皮生长因子、骨形态发生蛋白2、转化生长因子β1表达可能正趋于相似状态；③骨水泥填充后大鼠患肢未进行制动，骨水泥周围软组织与骨水泥之间处于微动环境中，不利于成纤维细胞、成骨细胞等细胞的黏附和成骨因子的表达；④细胞伪足和细胞外基质的黏附与植入材料种类有关，聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥可能不利于细胞迁移，或存在更适合细胞迁移的植入材料；⑤研究方法中制造不同粗糙程度骨水泥采用砂纸打磨的方法可能略显粗糙，表面形貌的设计精确度不够理想，导致结果存在一定偏倚。

综上所述，作为周围组织对骨水泥发生免疫排斥反应所形成滑膜样的结构，不同表面形貌聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥间隔器所形成的诱导膜，在特定的时间段(6周时)诱导膜内血管化程度和血管内皮生长因子、骨形态发生蛋白2、转化生长因子β1的表达无明显差异。但受相关干扰因素的影响，该研究结果仍需进一步多时段动态评估，研究方法需要进一步改进。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

骨水泥间隔器表面微观形貌改变对诱导膜内成骨因子表达的影响

Effects of changes in surface morphology of bone cement spacer on the expression of bone growth factor in induced membrane

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