2.2  各组大鼠创面愈合情况  见表1。对照组大鼠创面愈合速率快，至14 d已基本痊愈；而与对照组比较，糖尿病大鼠创面愈合明显减慢，各时间点差异均有显著性意义(P < 0.01)；在经过电刺激治疗后，糖尿病大鼠创面愈合加速，从第7天起差异有显著性意义(P < 0.05或P < 0.01)，治疗21 d后，大鼠创面愈合率能达到93.18%。

2.3  各组大鼠创面形态观察  见图1。对照组大鼠创面表皮加厚，炎性细胞浸润少，可见数目较多的成纤维细胞，毛细血管丰富；模型组创面可见明显的炎症细胞浸润，有部分血管生成，但数量较少，且血管管腔细窄；电刺激治疗后，糖尿病大鼠创面明显缩小，纤维细胞增多，呈细长梭状，新生血管数量较模型组明显增加，血管管腔变大。

2.4  各组大鼠血清中血管生成相关因子水平  与对照组比较，模型组大鼠血清中血管生成相关因子内皮型一氧化氮合酶、血管生成素1和血管内皮生长因子水平均显著降低(P < 0.05或P < 0.01)；经过电刺激治疗后，糖尿病大鼠血清内皮型一氧化氮合酶、血管生成素1和血管内皮生长因子水平均明显升高(P < 0.05或P < 0.01)。见表2。

2.5.1  大鼠创面血管生成素受体2、血管内皮细胞生长因子受体2定位表达  对照组大鼠创面组织血管丰富，血管管腔较大，血管生成素受体2、血管内皮细胞生长因子受体2阳性表达高，呈棕黄色，分布于血管周围；模型组大鼠血管数量明显减少，管腔狭窄，血管生成素受体2、血管内皮细胞生长因子受体2均呈弱性表达，积分吸光度值较对照组明显下降(P < 0.01)；经电刺激治疗21 d后，大鼠创面血管生成增加，管腔较大，血管生成素受体2、血管内皮细胞生长因子受体2阳性表达率较模型大鼠均显著升高(P < 0.01)。结果见图2，表3。

2.5.1  大鼠创面血管生成素受体2、血管内皮细胞生长因子受体2定位表达  对照组大鼠创面组织血管丰富，血管管腔较大，血管生成素受体2、血管内皮细胞生长因子受体2阳性表达高，呈棕黄色，分布于血管周围；模型组大鼠血管数量明显减少，管腔狭窄，血管生成素受体2、血管内皮细胞生长因子受体2均呈弱性表达，积分吸光度值较对照组明显下降(P < 0.01)；经电刺激治疗21 d后，大鼠创面血管生成增加，管腔较大，血管生成素受体2、血管内皮细胞生长因子受体2阳性表达率较模型大鼠均显著升高(P < 0.01)。结果见图2，表3。

2.5.2  大鼠创面血管生成素受体2、血管内皮细胞生长因子受体2蛋白表达  与对照组比较，模型组大鼠创面血管生成相关蛋白血管生成素受体2和血管内皮细胞生长因子受体2表达水平均显著降低(P < 0.01)；与模型组比较，电刺激治疗组血管生成素受体2和血管内皮细胞生长因子受体2蛋白水平均有明显提高(P < 0.05或P < 0.01)。见图3，表4。



2.5.2  大鼠创面血管生成素受体2、血管内皮细胞生长因子受体2蛋白表达  与对照组比较，模型组大鼠创面血管生成相关蛋白血管生成素受体2和血管内皮细胞生长因子受体2表达水平均显著降低(P < 0.01)；与模型组比较，电刺激治疗组血管生成素受体2和血管内皮细胞生长因子受体2蛋白水平均有明显提高(P < 0.05或P < 0.01)。见图3，表4。

     据国际糖尿病联盟(IDF)最新数据显示，2017年全球约有4.25亿糖尿病患者，其中中国糖尿病患者高达1.14亿，位列全球第一^[1]。糖尿病患者易产生多种并发症，其中，糖尿病性创面愈合障碍是由于患者体内高糖环境导致的皮肤创伤后形成的开放性创面在较长时间内难以愈合，患者常面临截肢的风险^[2-3]。糖尿病性创面愈合障碍的具体机制目前尚未完全阐明，主要集中在晚期糖基化终末产物相关学说、炎性浸润、外周神经功能障碍等^[4]。其中，糖尿病的高糖环境和创面局部的炎性环境能导致内皮祖细胞数量减少、功能降低，从而下调血管内皮生长因子和血管生成素1及其受体的表达，抑制新生血管的生成^[5-6]；而创面微血管生成障碍及功能丧失正是糖尿病创面难以愈合的关键因素^[7]。电刺激治疗是临床治疗创面损伤的常用手段之一，能有效促进损伤皮肤愈合，然其疗效机制研究甚少。研究通过构建糖尿病创面大鼠模型，采用电刺激干预治疗，以创面血管生成为切入点，探讨电刺激疗法对糖尿病创面愈合的影响及潜在机制，为其临床应用提供实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  随机对照动物实验。

1.2  时间及地点  实验于2017年3至10月在西南医科大学附属医院完成。

1.3  材料

1.3.1  实验动物  SPF级健康雄性SD大鼠42只，体质量为180-220 g，由上海斯莱克动物有限公司提供，许可证为SCXK(沪)2017-0005。实验期间大鼠均饲养在室温(24±2)℃、相对湿度(50±5)%、光/暗周期12 h/12 h的标准环境中。所有的实验过程均经西南医科大学实验动物管理伦理委员会批准进行，动物处理及实验操作过程均符合实验动物伦理要求。

1.3.2  试剂与主要仪器  链脲佐菌素(北京索莱宝)；内皮型一氧化氮合酶、血管生成素1、血管内皮生长因子酶联免疫吸附试剂盒(南京建成)；兔抗鼠血管生成素受体2(Angiopoietin receptor 2，Tie-2)、血管内皮细胞生长因子受体2一抗(英国Abcam)；兔抗鼠GAPDH一抗、山羊抗兔二抗(武汉博士德)；苏木精、伊红(上海碧云天)；DAB试剂盒、苏木素(北京中杉金桥)；肌电反馈、超声及电疗治疗仪(荷兰enraf)；组织切片机、酶标仪(美国Thermo)；倒置显微镜(德国ZEISS)；低温高速冷冻离心机(德国Eppendorf)；凝胶成像分析仪(美国Bio-Rad)。

1.4  实验方法

1.4.1  动物模型制备  大鼠适应性喂养3 d后，随机分为2大组，包括空白对照组(n=12)和糖尿病组(n=30)，糖尿病组采用一次性尾静脉注射链脲佐菌素(50 mg/kg)的方法建立糖尿病大鼠模型，链脲佐菌素注射72 h后检测大鼠空腹血糖值，以空腹血糖值≥16.70 mmol/L视为糖尿病模型制备成功(n=26)。在糖尿病造模完成后，所有大鼠(含对照组)均予以建立创面模型，腹腔注射水合氯醛将大鼠麻醉后，于背部正中处标记大小为1 cm×1 cm区域，局部备皮、消毒，用手术刀及眼科剪造成标记区域全层皮肤缺损，伤口止血、无菌敷料包扎。

1.4.2  动物分组、治疗及取材  选取24只上述糖尿病创面模型大鼠，从中随机选取12只作为治疗组，参照文献方法^[9]，对大鼠进行电刺激治疗，治疗参数：频率100 Hz，波升∶波降为3 s∶3 s，持续∶间歇为3 s∶3 s，电流强度13-18 mA，每天治疗1次，每次30 min，持续治疗21 d。对照组与模型组大鼠则正常饲养，不予治疗。分别于治疗第3，7，14，21 d观察创面愈合状态，计算创面愈合率。愈合率=(原始创面面积-未愈合创面面积)/原始创面面积。21 d后，麻醉大鼠，腹主动脉取血，而后分离创面处的皮肤组织，一部分放入40 g/L多聚甲醛中固定以观察创面病理形态，另一部分于液氮中冻存以检测相关指标的水平。

1.4.3  创面病理形态检测  治疗21 d后，采用苏木精-伊红染色法检测创面组织的病理形态变化，取固定于多聚甲醛中的大鼠创面组织，常规脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋后，以5 μm厚连续切片，苏木精-伊红染色后脱水并用中性树胶封固，于光学显微镜下观察组织病变情况，并拍照分析。

1.4.4  血清血管生成相关因子水平变化  治疗21 d后，取收集于促凝管中的大鼠血液，3 000 r/min离心10 min后收集上清制备血清，采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测大鼠血清中内皮型一氧化氮合酶、血管生成素1和血管内皮生长因子的含量，整个过程严格按照试剂盒说明书进行。

1.4.5  免疫组织化学法检测血管生成素受体2、血管内皮细胞生长因子受体2定位表达  取固定于多聚甲醛溶液中的创面组织，常规石蜡包埋后切片，常规脱蜡，水化，滴加山羊血清封闭液，37 ℃孵育30 min，去除血清，加一抗4 ℃孵育过夜；PBS洗3次，滴加HRP标记的山羊抗兔50 μL，37℃孵育30min，PBS洗3次，DAB显色，苏木精复染，脱水，透明，树胶封固，显微镜下观察。选取3个不同的视野，借助Image Pro软件分析积分吸光度值。

1.4.6   Western-blotting法检测血管生成素受体2、血管内皮细胞生长因子受体2蛋白表达  取冷冻保存的大鼠创面组织，称质量，加入5倍量的RIPA强力裂解液，冰上匀浆，在4 ℃、12 000 r/min条件下离心15 min，取上清液制备组织蛋白提取液，BCA试剂盒法测定总蛋白含量。制备分离胶和浓缩胶，蛋白上样，SDS-PAGE凝胶电泳至溴酚蓝跑出分离胶后，将蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温下封闭1 h，根据目的蛋白分子量裁剪条带，分别加入稀释后的一抗(Tie-2，1∶1 000；血管内皮细胞生长因子受体2，1∶1 000；GAPDH，1∶2 000)，4 ℃孵育过夜。次日用TBST液洗涤条带4次，每次10 min，加入二抗室温下孵育4 h，TBST液洗4次，每次10 min，之后进行ECL显影。应用Image-Pro Plus软件分析条带灰度值，并计算蛋白的相对表达水平。

1.5  主要观察指标  ①各组大鼠创面愈合率；②创面病理形态观察；③大鼠血清内皮型一氧化氮合酶、血管生成素1和血管内皮生长因子水平；④大鼠创面血管生成素受体2、血管内皮细胞生长因子受体2的表达。

1.6  统计学分析  采用SPSS 19. 0软件进行数据分析，组间差异采用t 检验，多组间比较采用单因素方差分析，计量数据用x(_)±s表示，以α=0.05作为检验水准。

糖尿病性创面愈合障碍是糖尿病的常见并发症之一，是由于体内高糖环境和多种生物学因素共同作用导致难愈性创面的形成，其发病机制尚未彻底阐明^[10]。临床上糖尿病性创面愈合障碍的治疗手段包括干细胞技术、生长因子治疗、高压氧疗、电刺激治疗及中药敷贴等，其中电刺激疗法因其效果较明显、费用较低且具有特色，是难愈性创面治疗的首选之一^[11-12]。此次研究采用链脲佐菌素联合背部皮肤创伤的方法建立糖尿病性难愈创面大鼠模型，通过观察不同时间点电刺激疗效发现，14 d时模型大鼠创面愈合率即接近90%，而模型组不到60%，进一步对创面组织病理染色发现，治疗组大鼠创面炎症细胞浸润减少，新生血管明显增多，且管腔变大，该结果证实了电刺激对糖尿病性难愈创面的治疗效果，在此基础上此次研究对其促进创面血管新生的机制进行了深入探讨。

      创面愈合是一个十分复杂的过程，而新血管的生成在其中起着至关重要的作用^[13]。丰富的新生血管能有效改善创面微循环，为组织修复提供所必须的氧及丰富的营养物质，从而有利于创面愈合^[14]。血管生成是一个动态过程，受内皮型一氧化氮合酶、一氧化氮等多种关键因子的调控^[15-16]，研究表明，内皮型一氧化氮合酶能有效调控血管生成因子血管生成素1和血管内皮生长因子等的表达，促进内皮细胞增殖、分化和迁移，增加细胞间黏附并形成新的微血管腔^[17-19]。血管内皮生长因子是目前已知的促进血管生长作用最强的细胞因子，其表达水平与微血管形成数量呈正相关，通过与其受体血管内皮细胞生长因子受体2结合，诱导血管内皮细胞增生，促进新生血管形成，是与血管新生及成熟过程有关的研究最为透彻的信号通路^[20-22]。血管生成素1是一种促血管生成素，主要由血管平滑肌细胞、成纤维细胞、周细胞等血管内皮细胞周围的支持细胞所分泌，通过与内皮细胞膜上活化的血管生成素受体2特异性结合发挥作用^[23-25]。血管生成素1/Tie-2系统参与血管新生与重塑，维持血管成熟与稳定，同时在血管损伤后修复、改善缺血后的微循环等血管病变中发挥着重要的作用^[26-27]。在此次研究中，糖尿病创面模型大鼠血清内皮型一氧化氮合酶、血管生成素1和血管内皮生长因子水平均显著降低，创面组织血管生成素受体2、血管内皮细胞生长因子受体2蛋白表达也显著下降，而经电刺激治疗后，上述趋势均得到逆转，内皮型一氧化氮合酶含量上升，直接参与血管生成的血管内皮生长因子/血管内皮细胞生长因子受体2和血管生成素1/Tie-2水平均明显上调，这与组织形态观察中血管数量增加，管腔增大的结论是一致的，从分子角度证实电刺激能促进创面组织血管生成。

      综上，电刺激疗法能明显促进糖尿病大鼠创面愈合，增加创面新血管的生成，其作用机制可能与升高内皮型一氧化氮合酶、血管生成素1和血管内皮生长因子水平，上调血管生成素受体2和血管内皮细胞生长因子受体2水平有关。此次研究结果为电刺激治疗糖尿病性难愈创面的临床应用提供了实验依据，但电刺激疗法促进创面愈合的更深层次机制还需要进一步实验研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：

糖尿病性难愈创面：是最常见的糖尿病并发症之一，主要由于体内高糖环境和多种生物学因素共同作用导致创面形成，大多难以治愈，以糖尿病足为代表，多数患者面临着截肢风险，其主要机制有晚期糖基化终末产物相关学说、炎性浸润、外周神经功能障碍等。

血管生成：指从已有的毛细血管或毛细血管后静脉发展而形成新的血管，主要包括：激活期血管基底膜降解；血管内皮细胞的激活、增殖、迁移；重建形成新的血管和血管网，是一个涉及多种细胞的多种分子的复杂过程。

临床上糖尿病性创面愈合障碍的治疗手段包括干细胞技术、生长因子治疗、高压氧疗、电刺激治疗及中药敷贴等，其中电刺激疗法因其效果较明显、费用较低且具有特色，是难愈性创面治疗的首选之一。此次研究采用链脲佐菌素联合背部皮肤创伤的方法建立糖尿病性难愈创面大鼠模型，观察电刺激对糖尿病性难愈创面的治疗效果，并在此基础上此次研究对其促进创面血管新生的机制进行了深入探讨。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程