羟基磷灰石-磷酸三钙支架复合骨髓间充质干细胞和人脐静脉内皮细胞对大鼠颅骨缺损修复早期成血管的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.3207

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (22): 3458-3465.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.3207

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羟基磷灰石-磷酸三钙支架复合骨髓间充质干细胞和人脐静脉内皮细胞对大鼠颅骨缺损修复早期成血管的影响

陈思奇1，先德彬2，徐荣胜3，覃中杰3，张磊3，夏德林1，3

1西南医科大学附属医院整形外科，四川省泸州市 646000；2西南医科大学附属中医医院，四川省泸州市 646000；3西南医科大学附属口腔医院口腔颌面外科，四川省泸州市 646000

收稿日期:2020-06-19 修回日期:2020-06-29 接受日期:2020-07-31 出版日期:2021-08-08 发布日期:2021-01-19
通讯作者: 夏德林，博士，主任医师，教授，西南医科大学附属口腔医院口腔颌面外科，四川省泸州市 646000
作者简介:陈思奇，女，1994年生，四川省成都市人，汉族，西南医科大学在读硕士，主要从事整形外科临床与基础研究。
基金资助:
泸州市科技局项目[2013-S-48(8/30)]，项目参与者：夏德林；四川省科技厅应用基础研究资助项目(2008JY0014)，项目负责人：夏德林

Effects of bone marrow mesenchymal stem cells and human umbilical vein endothelial cells combined with hydroxyapatite-tricalcium phosphate scaffolds on early angiogenesis in skull defect repair in rats

Chen Siqi1, Xian Debin2, Xu Rongsheng3, Qin Zhongjie3, Zhang Lei3, Xia Delin1, 3

1Plastic Surgery, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; 2Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; 3Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Affiliated Stomatological Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China

Received:2020-06-19 Revised:2020-06-29 Accepted:2020-07-31 Online:2021-08-08 Published:2021-01-19
Contact: Xia Delin, MD, Chief physician, Professor, Plastic Surgery, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Affiliated Stomatological Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
About author:Chen Siqi, Master candidate, Plastic Surgery, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
Supported by:
Luzhou Science and Technology Bureau Project, No. 2013-S-48(8/30) (to XDL); the Applied Basic Research Grant Project of Sichuan Science and Technology Department, No. 2008JY0014 (to XDL)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
骨髓间充质干细胞/人脐静脉内皮细胞与支架共培养：利用体外细胞培养技术提取能诱导成骨细胞增殖分化的骨髓间充质干细胞或者成血管分化的人脐静脉内皮细胞，并制备成细胞混悬液，按一定比例将细胞混悬液单独或共同滴加于具有一定空间结构的支架材料上，培养一段时间后形成个性化支架-细胞复合物，再将该复合物移植修复骨缺损。
3D打印羟基磷灰石-磷酸三钙支架：是指利用3D打印技术制备羟基磷灰石-磷酸三钙支架，当羟基磷灰与石磷酸三钙复合时能够优势互补，复合支架材料具有良好的生物可降解性能及生物相容性能、一定的机械强度和骨诱导性及骨传导性，不会产生免疫排斥反应，能诱导骨细胞及内皮细胞长入三维立体多孔支架材料中，并且具备一定的可吸收降解性能。

背景：组织工程骨为大型骨缺损修复提供了新方向，但只有早期形成完善的毛细血管网才能保证移植物在体内的长期存活，因此早期组织工程骨的血管化是其临床应用的关键所在。
目的：探索骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)与人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)复合羟基磷灰石-磷酸三钙(hydroxyapatite tertiary calcium phosphate，HA-TCP)支架对大鼠颅骨缺损修复早期血管生成的影响。
方法：①将HA-TCP支架分4组处理：A组加入体积比1∶1的DMEM培养液与细胞外基质培养液；B组加入体积比1∶1的BMSCs悬液与HUVECs悬液；C组加入体积比1∶1的DMEM培养液与HUVECs悬液，D组加入体积比1∶1的BMSCs悬液与细胞外基质培养液，培养21 d后用于体内植入实验。②在成年SD大鼠颅骨制作直径1 cm骨缺损，分别植入A、B、C、D组材料，术后4，8，12周，分别进行颅骨Micro-CT及颅骨支架复合物大体、组织形态学、CD31/CD34免疫组化染色、CD31/CD34分子含量、血管内皮生长因子A蛋白检测。动物实验已获得西南医科大学动物伦理委员会批准。
结果与结论：①Micro-CT检测：术后8周时，B组新生骨质量高于其他3组，C、D组高于A组；术后12周时，新生骨质量由高到低依次为：B组>C组>D组>A组；②大体观察：B组支架上骨质爬行面积高于其他3组，C、D组高于A组；相同时间点下血性渗液量由多到少依次为：B组>C组>D组>A组；③组织学观察：术后4周时，骨质新生量由高到低依次为：B组>C组>D组>A组，其余时间点骨质新生量由高到低依次为：B组>D组>C组>A组；④免疫组化染色：相同时间点下CD31/CD34微血管密度由高到低依次为：B组>C组>D组>A组，除C、D组无差异无外(P > 0.05)，其余组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)；⑤Western Blot检测：相同时间点下血管内皮生长因子A蛋白表达由高到低依次为：B组>C组>D组>A组，除C、D组无差异外(P > 0.05)，其余组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)；⑥结果表明，BMSCs与HUVECs复合HA-TCP支架材料移植修复大鼠颅骨缺损具有较强的早期血管化能力。

https://orcid.org/0000-0002-5183-1096 (陈思奇)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 骨, 材料, 支架, 组织工程骨, 骨缺损修复, 干细胞, 人脐静脉内皮细胞, 早期血管生成

Abstract: BACKGROUND: Tissue-engineered bone provides a new direction for the repair of large bone defects, but the survival of tissue-engineered bone grafts in vivo can be guaranteed only if the capillary network is formed in the early stage. Therefore, vascularization of early tissue-engineered bone is the key to its clinical application.
OBJECTIVE: To explore the effect of bone marrow mesenchymal stem cells and human umbilical vein endothelial cells combined with hydroxyapatite-tricalcium phosphate scaffolds on early angiogenesis in skull defect repair in rats.
METHODS: (1) The hydroxyapatite-tricalcium phosphate scaffold was divided into four groups: Group A was added with DMEM culture medium and extracellular matrix culture medium with volume ratio of 1:1. Group B was added with bone marrow mesenchymal stem cells suspension and human umbilical vein endothelial cells suspension with a volume ratio of 1:1. Group C was cultured with DMEM culture medium and human umbilical vein endothelial cells suspension with a volume ratio of 1:1. Group D was cultured with bone marrow mesenchymal stem cells suspension and extracellular matrix medium with a volume ratio of 1:1 for 21 days for in vivo implantation experiment. (2) Bone defects with a diameter of 1 cm were made in the skull of adult SD rats, and materials of groups A, B, C and D were implanted respectively. Skull micro-CT and skull scaffold complex gross, histomorphology, CD31/CD34 immunohistochemical staining, CD31/CD34 molecular content, and vascular endothelial growth factor A protein were detected respectively 4, 8 and 12 weeks after the operation. Animal experiment was approved by the Animal Ethics Committee of Southwest Medical University.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Micro-CT showed that 8 weeks after operation, the mass of new bone in group B was higher than that in the other three groups, and the mass of new bone in groups C and D was higher than that in group A. At 12 weeks after surgery, the new bone mass was from high to low: group B>group C>group D>group A. (2) Gross observation showed that the bone crawling area on the scaffold of group B was higher than that of the other three groups, and that of groups C and D was higher than that of group A. At the same time point, the amount of bloody exudate was from most to least: group B>group C>group D>group A. (3) Histological observation showed that at 4 weeks after the operation, the bone regeneration amount from high to low was: group B>group C>group D>group A. At other time points, the bone regeneration amount from high to low was: group B>group D>group C>group A. (4) Immunohistochemical staining showed that at the same time point, the microvascular density of CD31/CD34 was from high to low successively: group B>group C>group D>group A. Except for groups C and D, there was no significant difference (P > 0.05), and the difference between the other groups was significant (P < 0.05). (5) Western blot assay showed that at the same time point, the protein expression of vascular endothelial growth factor A was in descending order from high to low: group B>group C>group D >group A, except for no significant difference between groups C and D (P > 0.05), and the difference between the other groups was significant (P < 0.05). (6) The results showed that bone marrow mesenchymal stem cells and human umbilical vein endothelial cells combined with hydroxyapatite-tricalcium phosphate scaffold materials had strong early vascularization ability in repairing skull defects in rats.

Key words: bone, materials, scaffold, tissue engineering bone, bone defect repair, stem cells, human umbilical vein endothelial cells, early angiogenesis

中图分类号:

陈思奇, 先德彬, 徐荣胜, 覃中杰, 张磊, 夏德林. 羟基磷灰石-磷酸三钙支架复合骨髓间充质干细胞和人脐静脉内皮细胞对大鼠颅骨缺损修复早期成血管的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3458-3465.

Chen Siqi, Xian Debin, Xu Rongsheng, Qin Zhongjie, Zhang Lei, Xia Delin. Effects of bone marrow mesenchymal stem cells and human umbilical vein endothelial cells combined with hydroxyapatite-tricalcium phosphate scaffolds on early angiogenesis in skull defect repair in rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(22): 3458-3465.

图/表（结果） 11

2.1 BMSCs的形态 BMSCs接种于培养皿传至第3代时，镜下可见细胞呈极性漩涡状生长，形态呈单一均匀的长梭形、扁平形贴壁细胞特征，见图1。

2.2 HA-TCP支架的微观结构及生物相容性扫描电镜照片显示，支架表面粗糙，有大小不一的羟基磷灰石和磷酸三钙颗粒不规则排列，颗粒间存在孔隙，为细胞的植入创造良好的微环境(图2A)，可见两种细胞能够分别爬行于HA-TCP支架表面，且细胞形态良好(图2B-D)。其中图2B可见两种细胞能够共同生长于HA-TCP支架表面。

2.3 体内骨缺损实验大体观察结果从图3可见，随着时间推移支架材料逐渐吸收降解并与周围组织粘连融合，4组支架上骨质爬行面积由高到低为：B组>C组=D组>A组；当剥离支架表面纤维结缔组织后可见支架材料表面有血性渗液，4组血性渗液量由多到少为：B组>C组>D组>A组；随时间推移4组渗血量均增加，尤其术后12周时B、C、D组支架中央可见出血点，且B组后缘支架与颅骨空隙可见血管网。

2.4 体内骨缺损实验Micro-CT检测结果术后不同时间点各组大鼠颅骨Micro-CT图像，见图4。术后4周时，A、B、C、D组支架材料边缘清晰完整，其中B组颅骨前端隐约可见少许模糊高密度阴影形成，A、C、D组间未见明显区别；术后8周时，B组支架四周均出现模糊高密度影，C、D组颅骨左右两侧出现模糊高密度影，A组颅骨周围骨质新生不明显；术后12周时，4组支架与颅骨间均有高密度影形成，高密度影量由高到低为：B组>C组>D组>A组。

2.5 体内骨缺损实验苏木精-伊红染色结果术后不同时间点各组大鼠颅骨支架材料复合物的苏木精-伊红染色，见图5。术后4周时，B、C组支架材料周围和内部可见排列大量成骨细胞，D、A组次之；术后8周时，B、D组支架周围可见较多骨基质，C、A组次之；术后12周时，4组均可见支架有所降解，支架逐渐被新生骨替代，B组支架周围可见较多排列不规则、较厚骨小梁，D、C、A组次之。

2.6 体内骨缺损实验CD31/34免疫组化染色结果各组大鼠血管内皮细胞CD31/CD34因子免疫组织化学染色，见图6，7，微血管密度计算结果见表2，其中B、C、D组CD31微血管密度高于A组(P < 0.05)，B组高于C、D组(P < 0.05)，C、D组比较差异无显著性意义(P > 0.05)。记录CD34免疫组化染色切片的累积吸光度值，从时间轴图分析可得知，随时间增长各组内皮细胞标志物CD34阳性表达增长率由高到低为：B组>C组>D组>A组，见图8。

2.7 体内骨缺损实验CD31/CD34分子含量检测结果随术后时间的增长，各组CD31和CD34分子含量都持续增加，其中B组CD31/CD34分子含量高于C、D、A组(P < 0.05)，C、D组高于A组(P < 0.05)，C、D组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图9。

2.8 体内骨缺损实验血管内皮生长因子A蛋白表达水平各组支架可激活血管内皮生长因子A的表达，对灰度条带分析后显示，不同时期B组的血管内皮生长因子A持续高表达且随时间增加逐渐升高，明显高于A、C、D组(P < 0.05)，C、D组之间血管内皮生长因子A表达量无明显区别；随时间增加，A组4周后血管内皮生长因子A蛋白表达降低，C组8周后降低，D组12周后降低，见图10。

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引言

组织工程骨符合生理状态修复且避免了传统骨移植供骨区并发症，成为目前生物医学研究领域的前沿之一[1]。将组织工程骨移植入体内后，其早期营养只能依靠周围组织渗出液及少量血浆，因此这种方式的营养范围有限[2-3]，移植物中央的供血和供氧受到限制，从而导致中央细胞增殖、分化、分泌等生理功能受到影响甚至死亡，致使组织工程骨移植物修复骨缺损失败[4-5]。因此，组织工程骨的早期血管化是决定组织工程骨移植成功与否的关键之一。目前促进组织工程骨早期血管化的方法主要有预置血管技术、细胞技术、生长因子。相较于预置血管技术的操作技术要求高、血管过度生长及生长因子的存活与缓释问题，细胞技术有其明显优势[6]。WANG等[7-9]研究表明，人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)植入动物体内后能形成微管道结构并与植入物血管相通，且当HUVECs与骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)共培养时HUVECs可表达骨形态发生蛋白2因子，该因子能诱导BMSCs向成骨方向分化[10]。
羟基磷灰石是人体骨骼中主要的无机成分，其力学强度与正常骨组织相近，但其有机械性能差、脆性较大、易折断、难降解等缺点。磷酸钙类生物陶瓷与天然无机骨质成分相似，具有良好的骨传导和骨诱导性及生物相容性，无毒，可被降解吸收[11]，但其有降解速度过快、可塑性较差、机械性能不稳定等缺点。常选用羟基磷灰石与磷酸三钙(hydroxyapatite tertiary calcium phosphate，HA-TCP)复合应用，取长补短，以提高支架性能[12]。
因此，实验选用BMSCs/HUVECs与HA-TCP支架共培养，再将共培养支架植入大鼠颅骨缺损模型，观察BMSCs/HUVECs与HA-TCP支架共培养复合物在体内的早期促血管生成能力，为组织工程骨早期血管化提供实验支持。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计体内、外观察性实验。
1.2 时间及地点实验于2019年3至9月在西南医科大学口腔医学院口颌面修复重建与再生实验室完成。
1.3 材料 3D打印HA-TCP支架由四川大学生物材料工程研究中心提供，规格见表1。

1.3.1 实验动物 60只6-8周龄雌性SD大鼠，体质量250-300 g；10只4周龄雄性SD大鼠，体质量120-160 g，由西南医科大学实验动物中心提供，动物许可证号：
SYXK(川)2018-065。实验已经西南医科大学动物伦理委员会批准，动物伦理审查号：20181189。
1.3.2 实验试剂和仪器细胞外基质培养基、HUVECs(美国，Sciencell 公司)；DMEM培养基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶(HyClone公司)；乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)、非冻型组织RNA保存液、多聚甲醛、电镜固定液、RIPA裂解液、BCA、大鼠(CD31/CD34)Elisa检测试剂盒(中国，Solarbio 公司)；大鼠CD31/CD34抗体(一抗)、羊抗兔IgG(二抗)(北京博奥森生物技术有限公司)；血管内皮生长因子抗原ELISA检测试剂盒(晶美生物工程有限公司)；戊巴比妥钠(上海化学试剂公司)；DAB 染色试剂 (武汉博士德生物工程有限公司)；二甲基亚砜 (美国，Amresco 公司)；蛋白上样缓冲液(中国，beyotime)；PVDF膜(美国，millipore)；TBST、Western封闭液(中国，bioder)；倒置相差显微镜、光学显微照相系统(日本，Olympus公司)；电动打磨机(韩国，STRONG公司)；扫描电子显微镜(日本，HITACHI公司)；Micro PET/CT(德国，SIEMENS公司)；MILLI-QB型超纯水系统(美国，Millipore公司)；酶标仪(上海精宏试验设备有限公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 BMSCs的分离、培养和鉴定处死4周龄SD大鼠后取四肢股骨，用DMEM培养基反复冲洗骨髓腔，过滤组织块得到细胞悬液，1 000 r/min离心5 min，弃上清液，加入3 mL含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液吹打混匀，以细胞浓度为(6-8)×109 L-1接种于培养皿，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养，当细胞达到约80%融合量时消化传代，显微镜下观察细胞形态，并行成骨诱导和茜素红染色鉴定细胞为BMSCs，当传至第3代时，消化制备细胞浓度为3×108 L-1的细胞悬液备用。BMSCs的鉴定已由前期体外实验完成[13]。
1.4.2 复苏HUVECs 将冻存HUVECs置于37 ℃恒温水浴箱中复温，取细胞悬液1 000 r/min离心5 min后弃上清液，加入细胞外基质培养液重悬，以细胞浓度为1×107 L-1接种于新的培养皿中，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养，待细胞传至第3代时，消化制备细胞浓度为3×108 L-1的细胞悬液备用。
1.4.3 细胞与支架复合培养将HA-TCP支架分为4组：A组加入体积比为1∶1的DMEM培养液与细胞外基质培养液；B组加入体积比为1∶1的BMSCs悬液与HUVECs悬液，两种细胞数量均为3×104；C组加入体积比为1∶1的DMEM培养液与HUVECs悬液，细胞数量为3×104；D组加入体积比为1∶1的BMSCs悬液与细胞外基质培养液，细胞数量为3×104。将培养板平稳放入培养箱静置，间隔30 min取出，按上述细胞悬液及培养液比例循环滴加6次，培养至21 d备用[14-15]。
1.4.4 扫描电镜观察细胞在支架表面形态取共培养21 d的支架，PBS轻柔冲洗，4 ℃下在电镜固定液固定过夜，PBS浸洗10 min×2次；1%锇酸4 ℃固定1 h，PBS浸洗10 min×2次；无水乙醇梯度脱水、干燥、真空喷镀，使用扫描电镜观察细胞在支架表面的状态。
1.4.5 体内颅骨缺损修复实验将60只雌性SD大鼠随机分为4组，标记为A、B、C、D组，每组15只。向大鼠体内以10 mL/kg剂量腹腔注射3%戊巴比妥钠，严格无菌条件下于大鼠颅骨正中骨缝钻取直径为1 cm的颅骨片，将A、B、C、D组支架分别植入大鼠颅骨缺损处，术后4，8，12周后每组各处死大鼠5只，取颅骨支架复合物进行影像学观察及组织学检测。
1.4.6 Micro-CT扫描和大体观察使用3%戊巴比妥钠麻醉大鼠，麻醉后进行Micro-CT扫描。扫描完成后取大鼠颅骨标本，完全剥离支架周围的筋膜组织，在距支架材料3 mm处剥离骨膜至颅骨骨面，使用涡轮钻磨断颅骨骨质，完整取出颅骨支架复合物，对标本进行大体观察。
1.4.7 苏木精-伊红染色每组取出完整颅骨支架复合物，进行多聚甲醛固定、EDTA脱钙、石蜡包埋、切片、苏木精-伊红染色，倒置显微镜下观察及拍照。
1.4.8 CD31/34免疫组织化学染色每组取出SD大鼠颅骨支架复合物，进行多聚甲醛固定、EDTA脱钙、石蜡包埋、切片、脱蜡。体积分数3%H2O2室温孵育11 min，PBS冲洗4次。正常山羊血清封闭，37 ℃孵育10 min，滴加一抗4 ℃过夜，PBS洗片5 min×3次。滴加二抗37 ℃孵育30 min，PBS洗片5 min×3次。DAB显色，自来水流动冲洗、复染、封固。倒置显微镜下观察拍照并行微血管密度评价[先在低倍视野内(×40、×100 )找到切片内微血管密度较高区域，后在高倍视野内(×200)内总计微小血管的数目，选择5个微小血管较多视野，计算微血管密度]。切片上CD34阳性表达区域呈黄色，其颜色深浅可半定量反映CD34含量，采用Image-pro-plus 6.0软件分析其阳性反应区域累积吸光度。
1.4.9 Elisa法检测CD31、CD34含量取SD大鼠颅骨支架复合物进行组织匀浆、生理盐水混合样本研磨，3 000 r/min离心10 min，取上清液，根据说明书使用大鼠(CD31/CD34)Elisa 检测试剂盒进行测定，酶标仪(波长450 nm，15 min)测定A值。
1.4.10 Western Blot检测血管内皮生长因子A蛋白表达取出SD大鼠颅骨支架复合物进行组织匀浆，超声裂解(强度60%，超声5 s，间歇10 s，5 min)，4 ℃下12 000 r/min离心10 min，取上清液行BCA法蛋白定量。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶将每组样品分离出的蛋白质转至PVDF膜上，并在Western封闭液中震荡封闭1 h。用血管内皮生长因子A蛋白一抗(TBST 1∶1 000稀释)和β-actin抗体(1∶2 000稀释)室温下孵育2 h，TBST室温摇床上漂洗10 min×3次。然后与HRP标记的二抗(1∶3 000稀释)室温下孵育1 h，TBST室温摇床上漂洗10 min×3次。用辣根过氧化物酶HRP-ECL发光法进行显影，置入Bio-rad系统成像拍照并分析蛋白灰度比值，经计算统计后用GraphpadPrism 5.0绘制柱形图。
1.5 主要观察指标各组支架植入大鼠骨缺损后的骨形成与血管生成。
1.6 统计学分析实验数据均以 x±s表达，使用SPSS 19.0 进行统计学分析，微血管密度采用单因素方差分析，CD34累积吸光度值及血管内皮生长因子A蛋白含量组间对比采用 LSD-t 检验，当P < 0.05时认为差异有显著性意义。

讨论

目前临床医学治疗大型骨缺损时选用的仍是自体骨移植，但其会导致第二或第三术区开放，以创伤修复创伤，增加了手术难度及创伤部位。20世纪80年代组织工程技术出现，利用组织工程骨修复大型骨组织缺损成为一种很好的解决修复骨缺损的可选择方案，然而组织工程骨对于大段骨缺损的修复仍面临着诸多挑战，如成骨不足导致的骨愈合不良、延迟愈合和骨不连等问题。这与移植区血液供应有关，尤其是生长在材料中央的种子细胞，因微血管只能营养100-200 μm以内的种子细胞，所以若无早期微血管长入支架中心区域，没有微血管为种子细胞输送足够氧气、营养物质等，种子细胞的增殖、分化等生理功能将受到影响甚至死亡，从而致使组织工程骨移植物修复骨缺损失败[2-3]。如果不能在早期快速建立微血管并为移植物提供营养以及运走代谢废物，就难以实现利用组织工程化骨修复大型骨缺损来满足临床切实需求，因此组织工程骨早期血管化是组织工程由基础向临床应用所面临的关键所在。目前促进组织工程骨早期血管化方法主要有预置血管技术、细胞技术、生长因子，其中细胞技术相对比其他两种方法有明显优势。
骨组织工程早期微血管形成后能够为种子细胞的生长提供必要的氧气、营养，能够排除细胞所产生的废物，同时亦是骨修复过程中信号分子和细胞的运输通道，这表明了血管化程度越高其新生骨质能力就强。骨质的生成需要微血管的营养，当移植处骨基质和骨小梁增多时可反向表明在骨质大量生成处存在丰富微血管[15]。因此，实验采用Micro-CT、大体观察、苏木精-伊红染色分析细胞支架复合物在大鼠颅骨缺损处的新骨形成量来间接反映移植物血管化程度，结果显示B组骨基质和骨小梁增长量明显较其余3组多，且C、D组多于A组，由此可得出B组的微血管量最多，而A组形成脉管系统能力较弱。
CD31和CD34是HUVECs高表达的两种成熟标志物，并且这两种标志物的特异性高于其他类型的血管内皮细胞表面标志物[16-17]。ASAHARA等[18]实验发现在损伤后部位存在激发新血管形成细胞，并且其CD34表达阳性，所以CD34可作为观察新生血管的早期指标。血管内皮生长因子家族包括几大成员，其中血管内皮生长因子A被证明在新血管形成过程中发挥重大作用，它能激发成血管细胞迁移，从而构建血管管腔，所以新生血管生成的数量与血管内皮生长因子A的相对含量有密切联系[19]。因此，实验进行CD31/CD34分子含量检测、CD31/34免疫组化及血管内皮生长因子A蛋白含量检测，结果显示，相同时间点下B组CD31、CD34分子含量最高，A组最低，C、D组间无差异，并且在微血管密度比较中得到了相同的结果，B组的双细胞复合支架较其余3组有明显的成血管优势，C、D组较A组有优势，表明单一细胞复合支架在体内亦有一定的成血管能力。C、D组间CD31与CD34分子含量无差异，原因可能在于：随时间推移支架逐渐溶解，单一HUVECs共培养的支架骨形成量较少不能发挥支撑作用，使血管破坏；单一BMSCs共培养的支架相对骨质形成较多，对于血管有一定支撑作用血管破坏较少，因此C、D两组之间无明显差异。实验结果还显示，单一细胞与支架共培养与纯支架相比在体内有明显的早期成血管能力。Western Blot检测结果显示，B组血管内皮生长因子A蛋白随时间延长持续升高，并且始终高于C、D、A组，A组血管内皮生长因子A蛋白表达逐渐降低，C组在8周后降低，D组在12周后降低。血管内皮生长因子A蛋白含量结果与CD31、CD34分子含量结果相一致，B组生成血管能力最强，可能是因为BMSCs与HUVECs共同培养能够分泌多种细胞因子并存在相互促进作用。有研究表明，将BMSCs与HUVECs共同培养后，BMSCs能够合成和分泌血管内皮生长因子促进HUVECs的增殖，促进内皮细胞分化形成血管芽状结构，同时血管内皮生长因子通过促进局部血管形成来调节血供，促进骨形态发生蛋白2诱导的新骨再生过程，可检测到BMSCs碱性磷酸酶活性明显升高；内皮细胞可分泌表达骨形态发生蛋白2，这种蛋白反过来作用于成骨细胞等增强形成骨质的作用，也可以使成骨细胞加强表达血管内皮生长因子的mRNA，两者起到级联放大的相互促进作用[20-28]。此次实验结果显示，从术后4周开始，A、C组血管内皮生长因子A蛋白表达量依次降低，可能是因为在前4周时支架不易降解其具有支撑作用，而4周后支架逐渐降解对形成的微血管有破坏作用；其中D组为BMSCs与支架复合培养，BMSCs可促进骨的形成，这使支架降解对血管内皮生长因子A表达影响较A、C组低，所以D组12周后血管内皮生长因子A蛋白含量下降；B组BMSCs/HUVECs与支架共培养复合物在避免支架随时间延长逐渐降解对于血管内皮生长因子A蛋白表达影响的同时，HUVECs形成微血管构成稳定的血管系统。因此，BMSCs/HUVECs与支架共培养复合物较单一细胞与支架共培养复合物植入体内后有显著的早期促血管生成能力，并能促进新生骨形成。
因实验时间节点选取较少，间隔时间较长，无法找到移植复合支架内微血管的最佳长入及生长时间，无法确定支架降解对微血管形成的负面影响及BMSCs与HUVECs相互作用促进微血管生长之间的平衡节点，12周后复合支架内微血管是否继续生长等问题需进一步研究来确认。实验将BMSCs/HUVECs与HA-TCP支架共培养，发现支架有良好的细胞相容性，两种细胞均能在支架表面爬行生长；将共培养HA-TCP支架植入大鼠体内后，发现BMSCs/HUVECs共复合HA-TCP支架材料移植在大鼠颅骨缺损处较单一细胞培养支架具有较强的早期血管化能力，且BMSCs与HUVECs间有相互促进作用，HUVECs能够激发BMSCs成骨潜能，而共培养的BMSCs分泌血管内皮生长因子又作用于HUVECs。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

羟基磷灰石-磷酸三钙支架复合骨髓间充质干细胞和人脐静脉内皮细胞对大鼠颅骨缺损修复早期成血管的影响

Effects of bone marrow mesenchymal stem cells and human umbilical vein endothelial cells combined with hydroxyapatite-tricalcium phosphate scaffolds on early angiogenesis in skull defect repair in rats

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