人胎盘间充质干细胞及诱导的胰岛样细胞移植治疗妊娠期糖尿病大鼠效果比较#br#

doi:10.12307/2021.008

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (25): 3981-3987.doi: 10.12307/2021.008

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人胎盘间充质干细胞及诱导的胰岛样细胞移植治疗妊娠期糖尿病大鼠效果比较#br#

高珊1，黄东静1，洪海漫1，贾京桥2，孟斐1

1沈阳医学院附属中心医院产科，辽宁省沈阳市 110024；2唯尔克干细胞生物科技(辽宁)有限公司，辽宁省本溪市 110024

收稿日期:2020-06-17 修回日期:2020-06-24 接受日期:2020-08-04 出版日期:2021-09-08 发布日期:2021-03-24
通讯作者: 孟斐，硕士生导师，教授，沈阳医学院附属中心医院产科，辽宁省沈阳市 110024
作者简介:高珊，女，1983年生，2010年中国医科大学毕业，硕士，副主任医师，主要从事妊娠期糖尿病方面的研究。
基金资助:
沈阳医学院科技基金(20182040)，项目负责人：高珊；沈阳市卫生和计划生育委员会科研项目，项目负责人：高珊

Comparison on the curative effect of human placenta-derived mesenchymal stem cells and induced islet-like cells in gestational diabetes mellitus rats

Gao Shan1, Huang Dongjing1, Hong Haiman1, Jia Jingqiao2, Meng Fei1

1Department of Obstetrics, Affiliated Central Hospital of Shenyang Medical College, Shenyang 110024, Liaoning Province, China; 2WellCare Stem Cell Biotech (Liaoning) Co., Ltd., Benxi 110024, Liaoning Province, China

Received:2020-06-17 Revised:2020-06-24 Accepted:2020-08-04 Online:2021-09-08 Published:2021-03-24
Contact: Meng Fei, Master’s supervisor, Professor, Department of Obstetrics, Affiliated Central Hospital of Shenyang Medical College, Shenyang 110024, Liaoning Province, China
About author:Gao Shan, Master, Associate chief physician, Department of Obstetrics, Affiliated Central Hospital of Shenyang Medical College, Shenyang 110024, Liaoning Province, China
Supported by:
the Science and Technology Fund of Shenyang Medical College, No. 20182040 (to GS); the Scientific Research Project of Shenyang Health and Family Planning Commission (to GS)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
人胎盘间充质干细胞：来源于发育早期中、外胚层，具有较强的增殖能力，可分化为多种类型细胞，且该细胞进行体外培养和定向分化难度较低，移植后免疫抑制性较低，为许多慢性非传染病治疗提供了新思路。
妊娠期糖尿病：指发生于妊娠期的糖耐量减退、糖代谢异常的疾病，常发生于孕中晚期。对胎儿、母体近期和晚期身体健康、生活质量均可能有严重影响。

背景：妊娠期糖尿病易对孕产妇和胎儿的健康造成严重损害，探索安全有效的妊娠期糖尿病预防和治疗手段成为妇产科学的重要研究方向之一。
目的：对比人胎盘间充质干细胞和胰岛样细胞对妊娠期糖尿病大鼠的治疗效果，为其用于临床研究治疗妊娠期糖尿病提供理论依据。
方法：在无菌条件下提取人胎盘组织中的人胎盘间充质干细胞，将其诱导分化为胰岛样细胞，采用流式细胞术检测分化过程中巢蛋白和胰岛素的表达，采用双硫腙染色法检测胰岛样细胞团中锌离子表达。将雌性SD大鼠随机分为5组：正常孕鼠组、妊娠期糖尿病鼠未干预组、妊娠期糖尿病鼠生理盐水干预组、妊娠期糖尿病鼠人胎盘间充质干细胞干预组、妊娠期糖尿病鼠胰岛样细胞干预组，每组10只。采用妊娠前喂食高糖高脂饮食和妊娠后腹腔注射链脲佐菌素的方法建立妊娠期糖尿病模型，建模成功后，尾静脉注射1 mL含6×106个人胎盘间充质干细胞或胰岛样细胞的生理盐水悬液，分别于妊娠第6，12，18天检测各组孕鼠体质量和空腹血糖，妊娠第18天检测孕鼠血清脂联素水平。
结果与结论：①在人胎盘间充质干细胞诱导分化为胰岛样细胞过程中，胰岛素水平逐渐增高；巢蛋白表达水平先上升后逐渐下降；在诱导分化的第28天形成胰岛样细胞团；②人胎盘间充质干细胞和胰岛样细胞均能使妊娠期糖尿病鼠血糖降低，体质量升高，脂联素水平升高；妊娠第18天，与人胎盘间充质干细胞干预组相比，胰岛样细胞干预组大鼠体质量上升、血糖降低、脂联素水平升高效果更明显；③结果表明，人胎盘间充质干细胞和胰岛样细胞均能有效治疗妊娠期糖尿病鼠，由人胎盘间充质干细胞诱导分化的胰岛样细胞治疗效果更优。
https://orcid.org/0000-0002-8354-7583(高珊)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 胎盘间充质干细胞, 胰岛样细胞, 诱导分化, 妊娠期糖尿病, 血糖, 脂联素

Abstract: BACKGROUND: Gestational diabetes can cause serious damage to maternal and fetal health. Exploring safe and effective methods on gestational diabetes prevention and treatment has become one of the important research directions of obstetrics and gynecology.
OBJECTIVE: To compare the therapeutic effects of human placenta-derived mesenchymal stem cells and islet-like cells on gestational diabetes mellitus rats, so as to provide theoretical basis for clinical research on the treatment of gestational diabetes mellitus.
METHODS: Human placenta-derived mesenchymal stem cells were extracted from human placental tissue under aseptic conditions, then the identified stem cells were induced into islet-like cells. Flow cytometry was used to detecte the expressions of insulin and nestin protein in differentiated cells and dithizone staining was used to identify the expression of zinc ions in islet-like cell clusters. Female Sprague-Dawley rats were divided into five groups (n=10 per group): Normal pregnant rats group, gestational diabetes mellitus rats without intervention group, gestational diabetes mellitus rats saline intervention group, gestational diabetes mellitus rats human placenta-derived mesenchymal stem cells intervention group and gestational diabetes mellitus rats islet-like cells intervention group. Gestational diabetes mellitus model was established by feeding high-glucose and high-fat diet before pregnancy and intraperitoneal injection of streptozotocin after pregnancy. After successful modeling, 1 mL normal saline suspension containing 6×106 human placenta-derived mesenchymal stem cells or islet-like cells was injected via tail vein. The fasting blood glucose and body weight of rats in each group were measured at 6, 12, and 18 days of pregnancy, and the serum adiponectin level of pregnant rats was detected at 18 days of pregnancy.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) During the differentiation of human placenta-derived mesenchymal stem cells into islet-like cells, the insulin level increased and the nestin level increased then decreased gradually. The islet-like cell clusters formed at 28 days. (2) Both human placenta-derived mesenchymal stem cells and islet-like cells treatment were effective on reducing blood glucose and promoting adiponectin levels as well as body weight. At 18 days, compared with human placenta-derived mesenchymal stem cells, islet-like cells reduced blood glucose and increased adiponectin levels and body weight more significantly. (3) The results indicate that both human placenta-derived mesenchymal stem cells and islet-like cells treatments were effective on gestational diabetes mellitus rats. Islet-like cells induced by human placenta-derived mesenchymal stem cells treatment were more effective than that of the uninduced human placenta-derived mesenchymal stem cells.

Key words: stem cells, human placenta-derived mesenchymal stem cells, islet-like cells, induced differentiation, gestational diabetes mellitus, blood glucose, adiponectin

中图分类号:

高珊, 黄东静, 洪海漫, 贾京桥, 孟斐. 人胎盘间充质干细胞及诱导的胰岛样细胞移植治疗妊娠期糖尿病大鼠效果比较#br#[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3981-3987.

Gao Shan, Huang Dongjing, Hong Haiman, Jia Jingqiao, Meng Fei. Comparison on the curative effect of human placenta-derived mesenchymal stem cells and induced islet-like cells in gestational diabetes mellitus rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(25): 3981-3987.

图/表（结果） 9

2.1 诱导前人胎盘间充质干细胞形态学特征胎盘组织在培养瓶中培养至14 d时，可见细长短小梭形细胞，待80%细胞融合后进行传代培养至第3代，大多数细胞表现为长梭形，排列整齐，贴壁均匀，细胞增殖活力良好，可进行下一步鉴定。
2.2 人胎盘间充质干细胞鉴定结果流式细胞仪检测第3代人胎盘间充质干细胞阴性表达CD14-FITC(0.18%)、CD34-PE (0.30%)、HLA-DR-APC (0.03%)，阳性表达CD44-FITC (99.35%)、CD90-PE(99.02%)、CD105-APC(99.76%)，见图1，上述结果与胎盘干细胞表面标志相符[23]。第3代人胎盘间充质干细胞成骨诱导21 d经茜素红染色呈阳性，有大小不等橘红色钙结节；成脂肪诱导21 d经油红O染色呈阳性，细胞为红色，核为蓝色，脂肪颗粒呈红色；成软骨诱导21 d经甲苯胺蓝染色呈阳性，细胞呈蓝色，局部呈球状，见图2。

2.3 人胎盘间充质干细胞诱导分化为胰岛样细胞过程中的形态变化细胞形态变化如图3所示，诱导分化1 d细胞短小，正常贴壁生长，较诱导前无显著差异；诱导分化7 d细胞变细长，开始呈纤维状，漩涡形排列；诱导分化14 d时，可明显观察到神经纤维样细胞，排列整齐，均匀贴壁生长；诱导分化21 d时，部分细胞出现聚集抱团生长现象；至诱导分化28 d，细胞变化明显，由纤维状或长梭形聚集为胰岛样细胞团。

2.4 人胎盘间充质干细胞诱导分化为胰岛样细胞过程中巢蛋白表达使用流式细胞仪检测诱导前及诱导后第1，7，14，21，28天巢蛋白表达，分别为28.65%，30.85%，67.13%，87.93%，71.59%，42.78%。上述结果表明，诱导过程中出现了巢蛋白阳性的中间过程，符合人胎盘间充质干细胞分化为胰岛样细胞的诱导变化规律，见图4。

2.5 人胎盘间充质干细胞诱导分化为胰岛样细胞过程中胰岛素的表达使用流式细胞仪检测诱导前及诱导后第1，7，14，21，28天胰岛素表达，分别为0.39%，0.75%，1.65%，3.37%，24.16%，56.86%。上述结果表明，人胎盘间充质干细胞诱导分化所得的胰岛样细胞可分泌胰岛素，具备胰岛样细胞的基本功能，且随着诱导时间延长，胰岛素表达量逐渐增高，见图5。

2.6 双硫腙染色鉴定锌离子表达用双硫腙染色鉴定诱导第28天细胞，如图6所示，诱导组细胞染色后出现棕色络合物。胰岛β细胞分泌胰岛素并平稳血糖的必须基本条件之一是其中高浓度的锌离子表达，结果证实诱导所得胰岛样细胞可分泌胰岛素，发挥正常功能。

2.7 各组大鼠体质量变化各组大鼠妊娠后体质量均随时间增加，但不同处理组增加程度不同，见表1。
妊娠第6天：各妊娠期糖尿病组大鼠体质量均低于正常孕鼠组，组间总体差异有显著性意义(F=41.19，P=0.000 1)。LSD法两两比较显示，未干预组和生理盐水干预组大鼠体质量显著低于正常孕鼠组(P < 0.05)，人胎盘间充质干细胞干预组和胰岛样细胞干预组体质量显著高于未干预组和生理盐水干预组(P < 0.05)，人胎盘间充质干细胞干预组、胰岛样细胞干预组和正常孕鼠组间差异无显著性意义，未干预组、生理盐水干预组间差异无显著性意义。
妊娠第12天：各妊娠期糖尿病组大鼠体质量均低于正常孕鼠组，组间总体差异有显著性意义(F=41.19，P=0.001)。LSD法两两比较显示，未干预组和生理盐水干预组大鼠体质量显著低于正常孕鼠组(P < 0.05)，人胎盘间充质干细胞干预组和胰岛样细胞干预组体质量显著高于未干预组和生理盐水干预组(P < 0.05)，人胎盘间充质干细胞干预组体质量显著低于正常孕鼠组(P < 0.05)，胰岛样细胞干预组体质量显著高于人胎盘间充质干细胞干预组(P < 0.05)，但正常孕鼠组、胰岛样细胞干预组间差异无显著性意义，未干预组、生理盐水干预组间差异无显著性意义。
妊娠第18天：各组间总体差异有显著性意义(F=125.67，P=0.000 1)。LSD法两两比较显示，未干预组和生理盐水干预组大鼠体质量显著低于正常孕鼠组(P < 0.05)，人胎盘间充质干细胞干预组和胰岛样细胞干预组体质量显著高于未干预组和生理盐水干预组(P < 0.05)，人胎盘间充质干细胞干预组体质量显著低于正常孕鼠组(P < 0.05)，胰岛样细胞干预组体质量显著高于人胎盘间充质干细胞干预组(P < 0.05)，但正常孕鼠组、胰岛样细胞干预组间差异无显著性意义，未干预组、生理盐水干预组间差异无显著性意义。

2.8 各组大鼠空腹血糖水平注射人胎盘间充质干细胞和胰岛样细胞后，妊娠期糖尿病大鼠空腹血糖均随时间延长而逐渐降低，见表2。妊娠第6天：各妊娠期糖尿病组大鼠空腹血糖均高于正常孕鼠组，总体差异有显著性意义(F=29.47，P=0.000 1)，组间两两比较结果表明，人胎盘间充质干细胞干预组和胰岛样细胞干预组大鼠空腹血糖分别显著低于未干预组和生理盐水干预组(P < 0.05)，但人胎盘间充质干细胞干预组、胰岛样细胞干预组间差异无显著性意义，未干预组、生理盐水干预组间差异也无显著性意义。妊娠第12天：各妊娠期糖尿病组大鼠空腹血糖显著高于正常孕鼠组，总体差异有显著性意义(F=47.13，P=0.000 1)，组间两两比较结果表明，人胎盘间充质干细胞干预组和胰岛样细胞干预组血糖分别显著低于未干预组和生理盐水干预组(P < 0.05)，人胎盘间充质干细胞干预组、胰岛样细胞干预组血糖均较妊娠第6天有所降低，且胰岛样细胞干预组血糖显著低于人胎盘间充质干细胞干预组(P < 0.05)。妊娠第18天：各妊娠期糖尿病组大鼠空腹血糖仍显著高于正常孕鼠组，总体差异有显著性意义(F=66.36，P=0.000 1)，组间两两比较结果表明，人胎盘间充质干细胞干预组和胰岛样细胞干预组血糖显著低于未干预组和生理盐水干预组(P < 0.05)，人胎盘间充质干细胞干预组、胰岛样细胞干预组血糖均较妊娠第12天有所降低，且胰岛样细胞干预组血糖依旧显著低于人胎盘间充质干细胞干预组 (P < 0.05)。

2.9 各组大鼠尾静脉血中脂联素水平各组间总体差异有显著性意义(F=49.14，P=0.000 1)，组间两两比较结果表明，与正常孕鼠组相比，未干预组和生理盐水干预组脂联素水平降低，差异有显著性意义(P < 0.05)；未干预组和生理盐水干预组之间脂联素水平差异无显著性意义(P > 0.05)；与未干预组、生理盐水干预组比较，人胎盘间充质干细胞干预组和胰岛样细胞干预组脂联素水平上升，差异有显著性意义(P < 0.05)；与人胎盘间充质干细胞干预组比较，胰岛样细胞干预组脂联素水平较高，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表3。

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引言

糖尿病以血糖升高为主要表现，由于糖尿病患者长期胰岛素绝对或相对缺乏，可能发生全身血管、神经组织和器官病变等严重并发症，是威胁人类生命健康和生活质量最常见的代谢性疾病之一。妊娠期糖尿病指在孕前未发生或仅有潜在糖耐量减退，但在妊娠期首次出现并确诊的糖尿病，易造成羊水过多、妊高症、胎膜早破、胎儿生长受限、围产儿死亡等不良围产结局[1]。当前，妊娠期糖尿病的发病率逐年上升，流行病学调查显示中国妊娠期糖尿病发病率为 2%-5%[2]，但其病因尚未明确，可能的发病因素包括：遗传因素、年龄、高体质量指数和体脂率等[3]。目前临床上主要采用胰岛素替代方法控制血糖，该方法只能补充患者缺失的胰岛素，难以精准控制血糖水平，其主要不良反应——低血糖症可能会导致昏厥甚至威胁生命，且长期固定位置胰岛素注射可能导致肌肉组织萎缩，口服降糖药物也存在加重肝肾负担的风险，因此急需寻找一种安全高效且应用范围广的新型糖尿病疗
法[4]。干细胞疗法是一种能取代外源性胰岛素补充、恢复胰岛功能的新方法，该方法针对1型糖尿病在实验室和临床水平均取得了较大进展[5]。已有大量研究证实不同来源间充质干细胞治疗2型糖尿病的有效性及安全性[6-8]。
间充质干细胞和基于间充质干细胞的疗法在1980年代由ARNOLD CAPLAN首次命名，目前已成为极有前景的治疗方法[9]。间充质干细胞可来源于脐血、胎盘、骨髓、脐带、羊水和脂肪等组织[10]。研究表明，使用人脂肪间充质干细胞与造血干细胞组合移植在糖尿病患者体内产生胰岛素，在随访时间内有效降低1型糖尿病患者胰岛素需求量的30%-50%[11]。人胎盘间充质干细胞(human placenta-derived
mesenchymal stem cells，hPDMSCs)具有较强的增殖和分化能力，且易于采集，对机体无损伤作用，免疫原性低，移植时基本不存在组织配型及免疫排斥问题[12]。研究发现胎盘间充质干细胞能加速糖尿病大鼠伤口愈合，释放抗炎因子，调节与伤口愈合有关的炎症[13]。该实验从下列3个方面进行了相关研究：①观察人胎盘间充质干细胞体外诱导分化为胰岛样细胞动态过程中胰岛素及巢蛋白表达的变化；②探究胰岛素分泌的最佳时间点；③对比胰岛素分泌最佳时间点的胰岛样细胞和人胎盘间充质干细胞对妊娠期糖尿病大鼠的治疗效果。综合探究人胎盘间充质干细胞诱导的胰岛样细胞的治疗效果及细胞的最佳使用状态，为其用于临床研究治疗妊娠期糖尿病提供理论依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。
1.2 时间及地点实验于2018年9月至2019年5月在沈阳医学院完成。
1.3 材料
1.3.1 实验试剂及仪器 L15培养基(Sigma-Aldrich公司，中国)；鼠抗人巢蛋白单克隆抗体(RD公司，美国)；兔抗人胰岛素单克隆抗体(CST公司，美国)；β-神经生长因子、活化素A、碱性成纤维细胞生长因子(Peprotech公司，美国)；胰蛋白酶、Ⅰ型胶原酶、β-巯基乙醇(GIBCO公司，美国)；DMEM/F12培养基、胎牛血清(上海翊圣生物科技有限公司)；CD44、CD73、CD105、CD117、CD14、CD34、CD45抗体(BD公司，美国)；尼克酰胺、双硫腙、链脲佐菌素(Sigma 公司，美国)；NAD、B27(Invitrogen公司，美国)；成脂/成骨诱导试剂盒、表皮生长因子、柠檬酸、柠檬酸钠(赛默飞世尔科技有限公司，中国)；成脂/成骨/成软骨诱导试剂盒(Life technology公司，中国)；甲醛溶液、苏木精-伊红染色及其他常用试剂(沈阳医学院附属中心医院病理科提供)；流式细胞仪FACS Calibur(BD公司，美国)；血糖仪及血糖试纸(美国雅培(中国)公司)；超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司；CO2培养箱(三洋公司，日本)；台式高速离心机(Thermo公司，美国)；普通光学显微镜(尼康仪器(上海)有限公司)；电热恒温水浴箱(上海森信实验仪器厂)；
-80 ℃深冻冰箱(三洋公司，日本)。
1.3.2 胎盘组织由沈阳医学院附属中心医院产科提供，产妇均签署知情同意书，胎盘组织采集后置于含有抗生素的L15培养基中无菌存储，该研究获得沈阳医学院附属中心医院伦理委员会批准，伦理号：2020[0015]。
1.3.3 实验动物选取健康成年SPF级雌性SD大鼠50只、雄性25只，体质量(250±30) g，由辽宁长生生物技术有限公司提供。
1.4 实验方法
1.4.1 人胎盘间充质干细胞的分离和培养收集健康足月剖宫产分娩的人胎盘组织，用生理盐水简单冲洗之后，置于含有抗生素(200 U/mL青霉素和200 g/L链霉素)的L15培养基中无菌存储，并在低温环境下2 h内运送至实验室。保持无菌实验环境，将胎盘用PBS多次冲洗，将胎盘组织剪碎后，用联合酶液消化法分离、培养，待80%细胞融合后进行传代培养至第3代。
1.4.2 人胎盘间充质干细胞表型鉴定将第3代人胎盘间充质干细胞用胰酶消化后，离心、洗涤，用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养液制成细胞悬液，用冷PBS离心洗涤，弃去上清，按照相关抗体试剂说明书，分别加入稀释后的CD44、CD90、CD105、CD14、CD34、HLA-DR单克隆抗体各10 μL，使用流式细胞仪对细胞表面标记进行检测[14-15]。将第3代人胎盘间充质干细胞用间质干细胞成骨、成脂肪以及成软骨诱导分化培养基体外诱导分化21 d，分别进行茜素红、油红O和阿利辛蓝染色，镜下观察成脂、成骨、成软骨三系诱导分化情况并摄片[16-17]。

1.4.3 人胎盘间充质干细胞诱导分化为胰岛样细胞将人胎盘间充质干细胞置于培养瓶中，每瓶1×106个，当细胞融合度达到70%-80%时，加入20 mL含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基培养一两天，弃去悬浮的细胞并更换新培养基，在20 mL DMEM培养基中加入24 mg尼克酰胺和1.4 μL
β-巯基乙醇，轻晃混合，使之布满整个培养瓶壁并覆盖所有细胞，诱导24 h后再次更换诱导液，新诱导液成分为：DMEM/F12高糖培养基，0.4 mL体积分数为2%胎牛血清，
0.4 mL B27，2.4 mg 10 mmol/L烟酰胺，此后两三天更换1次诱导液，约7 d后镜下可观察到胰岛样细胞团，且体积和数量逐渐增加，整个胰岛样细胞诱导分化过程约28 d[18]。
1.4.4 人胎盘间充质干细胞诱导分化过程中胰岛素和巢蛋白表达取诱导前及诱导后1，7，14，21，28 d的细胞，PBS浸洗，向流式检测管中先后加入细胞(5×105个/管)、鼠抗人巢蛋白单克隆抗体和兔抗人胰岛素单克隆抗体，使用流式细胞仪分别检测胰岛素和巢蛋白表达。
1.4.5 胰岛样细胞中锌离子表达使用双硫腙染色法，将
50 mg双硫腙溶置于5 mL二甲基亚砜中，过滤2次，制成双硫腙染液。诱导28 d的细胞用PBS洗2次，加双硫腙染液(稀释度为1∶100)，于温箱中37 ℃孵育20 min，PBS洗3次，镜下观察细胞着色情况。
1.4.6 动物模型建立将50只雌鼠和25只雄鼠放置在SPF屏障系统动物室内正常喂养1周适应环境。适应后，随机选择 40只雌鼠喂食高糖高脂饮食，其余10只雌鼠和25只雄鼠接受正常饮食。喂养期每周测1次体质量，持续4周。4周后将大鼠按雌∶雄= 2∶1交配，次日晨阴道镜检有精子或看到阴栓表明雌鼠已受孕，记录为妊娠第0天。确认妊娠后，40只高糖高脂饮食的雌鼠禁食12 h，腹腔注射40 mg/kg
链脲佐菌素，妊娠第2天测量空腹血糖，若血糖高于
16.7 mmol/L，认为妊娠期糖尿病大鼠模型建立成功；若血糖低于16.7 mmol/L，再次腹腔注射链脲佐菌素，48 h后即妊娠第4天再次测量，若空腹血糖高于16.7 mmol/L认为妊娠期糖尿病大鼠模型建立成功[19-20]。10只正常饮食的雌鼠成功受孕后不给予任何处理。
1.4.7 动物分组及处理将50只雌性大鼠随机分为5组，每组10只，在鼠笼上标明动物编号、受孕日期、造模成功日期和实验分组。各组分组及处理方式如下：①正常孕鼠组：成功受孕后不给予任何处理；②妊娠期糖尿病鼠未干预组：建模成功后，不给予任何处理；③妊娠期糖尿病鼠生理盐水干预组：建模成功后，尾静脉注射1 mL生理盐水；④妊娠期糖尿病鼠人胎盘间充质干细胞干预组：建模成功后，尾静脉注射1 mL含6×106个人胎盘间充质干细胞的生理盐水悬液；⑤妊娠期糖尿病鼠胰岛样细胞干预组：建模成功后，通过尾静脉注射1 mL含 6×106 个胰岛样细胞的生理盐水悬液。
1.4.8 体质量、空腹血糖和脂联素检测妊娠第6，12，18天称量各组大鼠体质量，并检测空腹血糖，妊娠第18天检测尾静脉血中脂联素水平[21-22]。
1.5 主要观察指标 ①人胎盘间充质干细胞诱导分化为胰岛样细胞过程中的形态变化及胰岛素、巢蛋白表达水平；②胰岛样细胞中锌离子表达；③各组大鼠空腹血糖水平；④各组大鼠脂联素水平；⑤各组大鼠体质量变化。
1.6 统计学分析采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，实验数据均以x±s表示。采用单因素方差分析比较各组间总体差异，采用LSD法或Dunnett‘s T检验进行组间两两比较，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

当前妊娠期糖尿病发病率在世界范围内逐年上升，中国妊娠期糖尿病发病率为1%-5%，部分发展中国家妊娠期糖尿病发病率甚至高达15%-20%[24]。目前大多数糖尿病患者选择口服降糖药或胰岛素替代疗法，但上述2种方法控制血糖效果因人而异，易造成母体血糖较大波动，对胎儿和围产期健康产生不利影响。近年来随着干细胞研究的深入，已有大量关于骨髓、胚胎、胰腺、脐带等来源干细胞治疗糖尿病的研究，普遍认为干细胞疗法具有较好的安全性和应用前景[25]，因此干细胞疗法也为妊娠期糖尿病治疗提供了新思路。由于人胎盘间充质干细胞来源更广泛、易获得、不易发生免疫排斥，具有较高的定向诱导分化能力，且符合医学伦理学要求，该研究将人胎盘间充质干细胞定向诱导分化为胰岛样细胞，探索细胞移植对妊娠期糖尿病大鼠血糖的影响。
大量实验证实，巢蛋白表达是神经干细胞的标志之
一[26]，神经干细胞和胰岛干细胞在胚胎发育早期有许多表达相同的表型，且都分泌巢蛋白，此外造血干细胞也可分泌巢蛋白[27]。该实验表明，在诱导的前7 d，巢蛋白表达水平逐步上升，至第14天达到峰值，随着干细胞进一步定向诱导分化，巢蛋白表达又逐渐降低，这表明人胎盘间充质干细胞首先诱导为巢蛋白阳性细胞，后进一步定向分化为胰岛样细胞，后者表面巢蛋白表达量较低，胰岛素表达量逐步升高。
在该实验中，将人胎盘间充质干细胞和诱导28 d获得的胰岛样细胞，分别通过尾静脉注射入妊娠期糖尿病大鼠体内后，血糖值均发生了不同程度的降低，但仍高于正常妊娠大鼠。该研究结果表明人胎盘间充质干细胞与诱导的胰岛样细胞均能够降低妊娠期糖尿病大鼠的血糖，而且胰岛样细胞的降糖效果更好，这为以后胰岛样细胞移植治疗妊娠期糖尿病提供了一定理论支持。在该实验中，人胎盘间充质干细胞和诱导的胰岛样细胞均可以在体内维持降糖作用，但在妊娠12-18 d血糖水平不再下降，保持稳定，这可能与移植的细胞数量或出现异种排斥反应有关。在以后的实验中可改变移植细胞数量或者改变移植的次数，同时考虑种属因素在研究中的影响，将人来源胎盘干细胞和大鼠来源胎盘干细胞的诱导分化过程及移植后作用效果进行对比，探索治疗妊娠期糖尿病的最佳细胞数量以及最佳移植次数，为人胎盘间充质干细胞诱导分化移植治疗妊娠期糖尿病提供更进一步的可能和依据。正常大鼠怀孕后体质量上升，怀孕25 d左右达峰值，但妊娠期糖尿病大鼠体质量显著低于正常孕鼠。该研究中，人胎盘间充质干细胞组和胰岛样细胞组大鼠体质量回升，显著高于生理盐水组和未干预组，但仍低于正常孕鼠组。
分娩后，妊娠期糖尿病女性体内的血糖水平大多恢复正常，但未来2型糖尿病发病的可能性会增加[28]。妊娠期糖尿病病因尚不完全清楚，近些年相关研究表明妊娠期的病因可能与一些炎症因子、脂肪因子、遗传因素等有关[29-30]。最新研究表明，从流行病学角度分析，空气污染也可能是妊娠期糖尿病的重要危险因素[31]。大量临床研究显示，妊娠期糖尿病患者体内脂联素水平较糖耐量受损者和正常妊娠者低[32]，这些研究提示脂联素参与了妊娠期糖尿病的发生和进展。该实验中，人胎盘间充质干细胞组和胰岛样细胞组脂联素水平均较生理盐水组和未干预组上升，胰岛样细胞组脂联素水平高于人胎盘间充质干细胞组，表明人胎盘间充质干细胞和胰岛样细胞移植到体内后均能够改善体内炎症环境，缓解胰岛素抵抗，且直接移植胰岛样细胞效果更好。
该研究将人胎盘间充质干细胞定向诱导分化为胰岛样细胞，并比较二者对妊娠期糖尿病大鼠血糖、脂联素和体质量的影响，结果表明2种细胞移植均可从上述3个方向改善妊娠期糖尿病大鼠的症状，截止到该研究设置的观察期，即妊娠第18天，2种细胞移植组大鼠各个指标虽显著优于生理盐水和未干预组，但仍未达到正常孕鼠组水平，说明妊娠期糖尿病大鼠得到了有效治疗。但在目前的移植剂量和数量基础上，2种细胞移植仍未治愈妊娠期糖尿病大鼠，因此下一步的研究重点应放在探究细胞移植的最佳时期和剂量等方面。此外，由于妊娠期糖尿病的特殊性，该研究过程中未观察到母鼠和子鼠出现毒性表现，随着研究的深入还要考虑到不同剂量下母体和胎儿的安全性以及跨种属细胞移植带来的问题。综上所述，人胎盘间充质干细胞和诱导的胰岛样细胞均可使妊娠期糖尿病大鼠血糖降低，脂联素升高，体质量回升，且胰岛样细胞治疗效果优于人胎盘间充质干细胞，这为未来临床妊娠期糖尿病治疗提供了新的理论依据和思路。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

人胎盘间充质干细胞及诱导的胰岛样细胞移植治疗妊娠期糖尿病大鼠效果比较#br#

Comparison on the curative effect of human placenta-derived mesenchymal stem cells and induced islet-like cells in gestational diabetes mellitus rats

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