高压氧、振动训练与虾青素联合干预糖尿病骨质疏松模型大鼠骨密度、糖代谢及氧化应激的变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.3199

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
糖尿病性骨质疏松症：1 型或 2 型糖尿病患者经常性地发生骨矿物含量减少、骨密度降低及出现各种骨质疏松症的临床症状，糖尿病性骨质疏松症是一种发生在骨骼系统严重而常见的糖尿病并发症。
高压氧：为一种物理治疗手段，通过提高氧分压增加血氧含量和促进氧弥散而改善组织的血液供应，对多种创伤有显著疗效。
虾青素：是一种红色类胡萝卜素，名变胞藻黄素、虾红素、虾黄素等，广泛分布在海洋细菌、藻类、甲壳类和鱼类中，天然虾青素是迄今为止发现的自然界最强大的天然抗氧化剂之一。

背景：糖尿病性骨质疏松是一种发生在骨骼系统严重而常见的糖尿病并发症，具有较高致残、致死率。目前尚无针对糖尿病性骨质疏松的特异治疗方案，主要是采用降血糖和抗骨质疏松药物联合治疗。与单用药物治疗相比，加入非药物辅助手段的联合治疗对患者的骨密度提升效果可能会更显著。
目的：探讨高压氧+振动训练+虾青素组合辅助治疗方案对糖尿病性骨质疏松造模大鼠的骨密度、骨代谢、糖代谢、骨生物力学性能及氧化应激的影响。
方法：纳入90只大鼠，10只大鼠正常饲养列为正常对照组；80只大鼠构建糖尿病性骨质疏松模型后随机分为8组(n=10)，即模型对照组、高氧组、振动训练组、虾青素组、高压氧+振动训练组、高压氧+虾青素组、振动训练+虾青素组、高压氧+振动训练+虾青素组。执行16周干预，干预结束进行骨密度、糖代谢、氧化应激等检测。
结果与结论：①经过16周干预，血糖、血清胰岛素、胰岛素抵抗方面，高压氧+振动训练组、高压氧+振动训练+虾青素组显著低于模型对照组、高氧组、振动训练组、虾青素组、高压氧+虾青素组、振动训练+虾青素组(P < 0.05)；②丙二醛方面，高压氧+振动训练+虾青素组显著低于高氧组、振动训练组、高压氧+振动训练组(P < 0.05)；③超氧歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶方面，高压氧+振动训练+虾青素组显著高于模型对照组、高氧组、振动训练组、高压氧+振动训练组(P < 0.05)；④骨密度方面，高压氧+振动训练+虾青素组显著高于模型对照组、高压氧组、虾青素组(P < 0.05)；⑤甲状旁腺激素、碱性磷酸酶方面，高压氧+振动训练组、高压氧+振动训练+虾青素组显著低于高氧组、振动训练组、虾青素组、高压氧+虾青素组、振动训练+虾青素组(P < 0.05)；⑥胰岛素样生长因子1水平方面，高压氧+振动训练+虾青素组显著高于高氧组、振动训练组、虾青素组、高压氧+虾青素组、振动训练+虾青素组(P < 0.05)；⑦股骨最大载荷、断裂载荷和弹性模量方面，高压氧+振动训练组、高压氧+振动训练+虾青素组、振动训练组、振动训练+虾青素组显著高于模型对照组、高氧组、虾青素组、高压氧+虾青素组(P < 0.05)；⑧提示高压氧+振动训练+虾青素组合方案用于糖尿病性骨质疏松辅助治疗可以有效控制血糖、缓解胰岛素抵抗、降低骨吸收、增加骨密度、改善骨生物力学性能，且效果明显优于单独使用高压氧或振动训练。

https://orcid.org/0000-0001-6402-7374 (刘玉琳)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 糖尿病性骨质疏松, 高压氧, 振动训练, 虾青素, 血糖, 胰岛素抵抗, 骨密度, 生物力学

Abstract: BACKGROUND: Diabetic osteoporosis is a serious and common diabetic complication associated with a high disability and mortality rate that occurs in the skeletal system. There is no specific treatment plan for the treatment of diabetic osteoporosis, and a combination of hypoglycemic and anti-osteoporosis drugs is mainly used. Compared with single-drug therapy, combined therapy with non-drug adjuvants may have a more significant effect on patients’ bone mineral density.
OBJECTIVE: To explore the combined effects of hyperbaric oxygen + vibration training + astaxanthins on bone mineral density, bone metabolism, glucose metabolism, bone biomechanical performance, and oxidative stress in diabetic osteoporosis model rats.
METHODS: In this study, 80 rats were modeled with a DOP model, and another 10 rats were reared normally. Normally reared rats were listed as a control group. Diabetic osteoporosis rats were randomly divided into model control group, hyperoxic group (H group), vibration training group (V group), astaxanthin intake group (A group), hyperbaric oxygen + vibration training group (HV group), hyperbaric oxygen + astaxanthin group (HA group), vibration training + astaxanthin group (VA group), hyperbaric oxygen + vibration training + astaxanthin group (HVA group). Interventions in each group lasted for 16 weeks. Bone mineral density, glucose metabolism, and oxidative stress were tested at 16 weeks after intervention as well as at the end of the intervention.
RESULTS AND CONCLUSION: After 16 weeks of intervention, the fasting plasma glucose, fasting serum insulin, and homeostasis model assessment insulin resistance indicators in the HV and HVA groups were significantly lower than those in the model control, H, V, A, HA, and VA groups (P < 0.05). Malondialdehyde content in the HVA group was significantly lower than that in the H, V, and HV groups (P < 0.05). The superoxide dismutase and glutathione peroxidase levels in the HVA group were significantly higher than those in the model control, H, V, and HV groups (P < 0.05). The bone mineral density in the HVA group was significantly higher than that in the model control, H, and A groups (P < 0.05). The parathyroid hormone and alkaline phosphatase levels in the HVA and HV groups were significantly lower than those in the H, V, A, HA, and VA groups (P < 0.05). The insulin-like growth factor 1 level was significantly higher in the HVA group than in the H, V, A, HA, and VA groups (P < 0.05). The maximum load, fracture load, and elastic model of the rat femur were significantly higher in the HV, HVA, V, and VA groups than in the model control, H, A, and HA groups
(P < 0.05). To conclude, the combination of hyperbaric oxygen + vibration training + astaxanthin for diabetic osteoporosis as an adjuvant therapy can effectively control blood glucose, relieve insulin resistance, reduce bone resorption, increase bone mineral density, and improve bone biomechanical performance. Moreover, the combined effect is significantly better than that of hyperbaric oxygen or vibration training alone.

Key words: diabetic osteoporosis, hyperbaric oxygen, vibration training, astaxanthin, blood glucose, insulin resistance, bone mineral density, biomechanics

中图分类号:

刘玉琳, 李国泰. 高压氧、振动训练与虾青素联合干预糖尿病骨质疏松模型大鼠骨密度、糖代谢及氧化应激的变化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(20): 3117-3124.

Liu Yulin, Li Guotai. Combined effects of hyperbaric oxygen, vibration training and astaxanthin on bone mineral density, glucose metabolism and oxidative stress in diabetic osteoporosis rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(20): 3117-3124.

图/表（结果） 5

2.1 造模与样本脱落状况将正常饲养的10只大鼠设为对照组；在80只大鼠造模过程中，3只死亡，另有3只未达到糖尿病性骨质疏松症模型标准，不纳入实验。
2.2 糖代谢变化结果图2显示，空腹血糖、空腹胰岛素、HOME-IR方面，经过16周干预，高压氧组、振动训练组、高压氧+虾青素组、振动训练+虾青素组、高压氧+振动训练组、高压氧+振动训练+虾青素组后测值显著低于前测值(P < 0.05)。高压氧组、振动训练组、虾青素组、高压氧+虾青素组、振动训练+虾青素组后测值显著低于模型对照组后测值(P < 0.05)，高压氧+振动训练组和高压氧+振动训练+虾青素后侧值显著低于模型对照组、高压氧组、振动训练组、虾青素组、高压氧+虾青素组、振动训练+虾青素组后测值(P < 0.05)。

2.3 氧化应激变化结果表2显示，经过16周干预，丙二醛方面，高压氧组、振动训练组、虾青素组、高压氧+振动训练组、高压氧+虾青素组、振动训练+虾青素组、高压氧+振动训练+虾青素组均显著低于模型对照组(P < 0.05)，高压氧+振动训练+虾青素组显著低于(P < 0.05)，高压氧+振动训练+虾青素组显著低于高压氧组、振动训练组、高压氧+振动训练组(P < 0.05)。超氧化物歧化酶方面，高压氧组、振动训练组、虾青素组、高压氧+振动训练组、高压氧+虾青素组、振动训练+虾青素组、高压氧+振动训练+虾青素组均显著高于模型对照组(P < 0.05)，高压氧+振动训练+虾青素组显著高于高压氧组、振动训练组、虾青素组、高压氧+振动训练组、高压氧+虾青素组、振动训练+虾青素组(P < 0.05)。谷胱甘肽过氧化物酶方面，高压氧组、振动训练组、虾青素组、高压氧+振动训练组、高压氧+虾青素组、振动训练+虾青素组、高压氧+振动训练+虾青素组均显著高于模型对照组(P < 0.05)，高压氧+振动训练+虾青素组显著高于高压氧组、振动训练组、高压氧+振动训练组(P < 0.05)。

2.4 骨密度和骨代谢变化结果图3及表3显示，大鼠股骨密度方面，模型对照组干预后骨密度与干预前相比显著下降(P < 0.05)，这符合糖尿病性骨质疏松症动物模型的规律。高压氧组、振动训练组、虾青素组干预后与干预前相比差异无显著性意义(P > 0.05)，同时显著高于模型对照组干预后(P < 0.05)，高压氧+振动训练组、高压氧+虾青素组、振动训练+虾青素组、高压氧+振动训练+虾青素组干预后显著高于干预前(P < 0.05)，且显著高于模型对照组(P < 0.05)。干预后高压氧＋振动训练组、高压氧+振动训练+虾青素组显著高于高压氧组、虾青素组(P < 0.05)。

在骨代谢方面，甲状旁腺素、碱性磷酸酶，模型对照组显著高于其余各组(P < 0.05)，高压氧+振动训练+虾青素组、高压氧+振动训练组显著低于高压氧组、振动训练组、虾青素组、高压氧+虾青素组、振动训练+虾青素组(P < 0.05)，振动训练组、高压氧+虾青素组、振动训练+虾青素组显著低于虾青素组(P < 0.05)。尿钙/肌酐，模型对照组显著高于其余各组(P < 0.05)，高压氧+振动训练+虾青素组、高压氧+振动训练组显著低于虾青素组(P < 0.05)。胰岛素样生长因子1水平，模型对照组显著低于其余各组(P < 0.05)，高压氧+振动训练+虾青素组、高压氧+振动训练组显著高于高压氧组、振动训练组、虾青素组、高压氧+虾青素组、振动训练+虾青素组(P < 0.05)，振动训练组、高压氧+虾青素组、振动训练+虾青素组显著低于虾青素组(P < 0.05)。血清钙水平各组间相比，差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.5 骨生物力学性能变化结果表4显示，大鼠股骨最大载荷、断裂载荷和弹性模量，高压氧+振动训练组、高压氧+振动训练+虾青素组、振动训练组、振动训练+虾青素组显著高于模型对照组、虾青素组、高压氧组、高压氧+虾青素(P < 0.05)，高压氧组、高压氧+虾青素组显著高于模型对照组和虾青素组(P < 0.05)。最大应力，高压氧组、振动训练组、高压氧+振动训练组、高压氧+虾青素组、振动训练+虾青素组、高压氧+振动训练+虾青素组显著高于模型对照组和虾青素组(P < 0.05)。

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引言

骨质疏松症已经成为国内50岁以上人群的重要健康问题，截至2018年,50岁以上人群骨质疏松症患病率为19.2%，65岁以上人群骨质疏松症患病率达到32.0%[1]。约1/3的糖尿病患者因血糖控制不佳引发骨代谢紊乱，最终发展成糖尿病性骨质疏松症 [2]。骨质疏松症引发的骨折等并发症严重影响患者生活质量，也给家庭、社会带来沉重的负担。目前糖尿病性骨质疏松症的治疗方案是采用控制血糖和抑制骨吸收的对症治疗，即降血糖和抗骨质疏松药物联合治疗，尚无用于针对糖尿病性骨质疏松症治疗的特异治疗方案[3]。有研究发现，与单用药物治疗相比，加入非药辅助手段的联合治疗对骨质疏松症患者骨密度提升的效果更显著 [4]。但目前骨质疏松症治疗的辅助手段使用方法单一，即用药方案加1种辅助手段。有学者提出将多种作用机制不同的辅助手段组合使用可产生叠加效应，可进一步提升骨质疏松症患者骨密度[5]。高压氧疗法是通过将患者置于高压氧环境中吸氧以治疗疾病的方法[4]，有助于提升骨质疏松症患者骨密度并可缓解骨质疏松症引发的疼痛[6-8]。振动训练是一种通过机械振动负荷诱发神经肌肉反射、同时给予骨骼重复性应力刺激进而改善肌肉-骨骼系统结构和功能的康复训练方法 [9-10]，其对骨质疏松症患者的骨密度和骨微结构具有改善作用，并能增加肌力，降低跌倒风险[11-13]。但高压氧、振动训练均有可能诱发机体炎症和氧化应激 [14-15]，故此次研究选择抗氧化剂虾青素作为高压氧+振动训练辅助方案的必要补充，抑制氧化应激及由此导致的骨量流失[16]。基于以上研究假设，此次研究采用高压氧+振动训练+虾青素的组合辅助手段方案对糖尿病性骨质疏松症造模大鼠进行干预，观测其对糖尿病性骨质疏松症大鼠骨密度、骨代谢、糖代谢、骨生物力学性能、氧化应激的影响。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机分组，动物模型制备平行对照实验。
1.2 时间及地点于2018年12月至2019年8月在重庆市北碚区康复中心康复科完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 SPF级8 周龄健康雄性Sprague Dawley(SD)大鼠90只购自北京维通利华公司，许可证号：SCXK(京) 2016-0011。在室温保持(22±3)℃、湿度(50±5)%、明暗周期为 12 h/12 环境中分笼饲养，自由取食饮水。此次实验中对动物的处理符合科学技术部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》。
1.3.2 实验仪器江苏鸿恩医疗器械有限公司产H12038通道血液分析仪，赛默飞世尔科技(中国)有限公司产Multiskan Sky紫外分光度计，瑞士Tecan生物仪器公司产Freedom EVOlyzer全自动酶免疫工作站，深圳迈瑞Mindray医疗器械有限公司产BS-220全自动生化分析仪，青岛泽有氧容器设备有限公司产YC2200高压氧治疗仓，上海测维光电技术有限公司产KG-20高速低温离心机，美国Faxitron 医疗器械公司产ULTRAFOCUS 100型双能X射线骨密度仪，美国Power plate公司产PRO5 振动训练仪。
1.3.3 药物与试剂德国Sigma公司产虾青素胶囊(12 mg/粒)，深圳振兴生物科技公司产链脲佐菌素，美国Johnson & Johnson医疗设备有限公司产血糖检测仪及血糖测试纸，上海一基实业有限公司产胰岛素、骨钙素、胰岛素样生长因子1 ELISA检测试剂盒，南京建成生物科技有限公司产丙二醛、超氧化物歧化酶ELISA试剂盒，谷胱甘肽过氧化物酶、钙、碱性磷酸酶、肌酐检测试剂。
1.4 实验方法
1.4.1 实验设计与流程 90只SD大鼠适应性喂养7 d后，利用随机数字表法将大鼠分为正常对照组(n=10)及糖尿病性骨质疏松症造模组(n=80)，将糖尿病性骨质疏松症大鼠随机分为模型对照组、高压氧组、振动训练组、虾青素摄入组、高压氧+振动训练组、高压氧+虾青素组、振动训练+虾青素组、高压氧+振动训练+虾青素组。正常对照组大鼠进行正常饲养，在干预前72 h内全部大鼠检测糖代谢和骨密度。进行16周干预，干预结束后72 h内采集血样、尿样并检测骨密度、骨代谢、糖代谢、氧化应激。随后48 h内麻醉处死大鼠，取股骨样本，检测骨生物力学性能，见图1。

1.4.2 糖尿病性骨质疏松症动物模型构建 80只大鼠进行20 d高脂高糖饲料喂养，第21天半日禁食，给予链脲佐菌素柠檬酸缓冲液50 mg/kg注射，1次/d，连续3 d；正常饲养大鼠注射同体积生理盐水。结束链脲佐菌素注射后72 h对大鼠进行血糖浓度检测，大鼠血糖≥16.7 mmol/L，即认为2型糖尿病大鼠模型建模成功，在12周后对2型糖尿病模型大鼠和正常饲养大鼠进行双能X射线骨密度检测，若 2型糖尿病模型大鼠骨密度低于正常大鼠骨密度均值的2倍标准差，该大鼠糖尿病性骨质疏松症模型即构建成功[17]。

1.4.3 实验分组与干预方案
(1)分组：将正常饲养的10只大鼠设为正常对照组(n=10)。进行造模的80只大鼠中死亡3只，造模失败3只，造模成功74只。分组与实验干预方案详见表1。

(2)高压氧方案：将高压氧治疗仓作为动物实验氧仓，利用门缝洗仓法进行约12 min的洗仓直至氧舱内氧浓度到达(95±2)%，此时紧闭舱门，进行15 min的加压到舱内达到 222.9 kPa、稳压40 min、氧浓度为97%-99%，后18 min将气压逐渐减至与周围环境一致。全过程持续低流量等量换气[18]。
(3)振动训练方案：将大鼠装在硬塑料箱内(45 cm×
40 cm)，放置在power plate pro5振动训练平台上，进行振动(3 mm、30 Hz)，振动3 min休息90 s，反复10次[19]。
(4)虾青素方案：每日进行2次灌胃(虾青素剂量 100 mg/kg，混合于10 mL生理盐水中)，在早上8：00-10：00、晚上8：00-10：00完成。其余无需摄入虾青素大鼠，灌入相同剂量的生理盐水[20]。
1.4.4 样本采集采用大鼠腹腔取血，离心取上清液。每只大鼠单独置于代谢收集笼内，收集尿样。在完成所有除骨生物力学性能测试外的检测后，处死大鼠，手工剥离出大鼠的双侧股骨，清理附着其上的肌肉组织和结缔组织。
1.5 主要观察指标
骨密度检测：在开始干预前72 h内和干预完成后72 h内，在将活体大鼠固定于ULTRAFOCUS 100型双能X射线的检测台，利用仪器的small animal 模式对大鼠右股骨进行反复3次扫描，股骨干骺端进行分析，取均数为大鼠股骨骨密度。

糖代谢检测：在开始干预前72 h内和干预完成后72 h内，采用血糖仪和血糖试纸测试空腹血糖浓度，ELISA法检测空腹胰岛素水平、胰岛素抵抗指标以稳态模型的胰岛素抵抗指数(homeostasis model assessment insulin resistance，HOMA-IR)表示，计算公式为：HOMA-IR=空腹血糖水平(mmol/L)×空腹胰岛素水平(mIU/L)/22.5。
骨代谢检测：干预完成后72 h内，取大鼠血样、尿样，利用ELISA法检测血清中骨钙素、胰岛素样生长因子1水平；利用采用全自动生化仪检测血清中碱性磷酸酶、钙、甲状旁腺素和尿液中钙、肌酐水平。
氧化应激指标：干预完成后72 h内，取大鼠血样，利用全自动生化分析仪检测血清氧化应激指标丙二醛、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶水平。
骨生物力学性能检测：16周干预完成后，进行骨密度检测、取血液样本后，处死大鼠，取大鼠的双侧股骨样本。通过使用力学材料测试机，对左股骨样本进行三点测试，将两侧支架间距调整为2.5 cm，股骨置于其上水平放置，使用材料测试机下压机头对骨干远端的1/3处以4 mm/min的速度下压进行三点弯曲试验，利用材料测试机自带分析记录软件计算出最大载荷、弹性模量、最大应力。
1.6 统计学分析利用SPSS 17.0 of window统计软件分析，实验数据以x±s形式表示，利用独立样本t检验、多因素方差分析，比较各项参数组内、组间差异，此次研究显著水平设为P=0.05。

讨论

3.1 干预方案对糖代谢影响此次研究中单独使用高压氧或振动训练均可显著降低空腹血糖和缓解胰岛素抵抗，高压氧和振动训练联用则改善效果更佳。临床研究发现经高压氧10-15次干预，糖尿病患者血糖水平出现明显下降，是较成熟的糖尿病治疗辅助手段[21]，高压氧使机体血液、肌肉中氧含量增加，有氧代谢旺盛，肌肉和血液的葡萄糖被快速分解，进而血糖降低，同时产生大量ATP，使胰岛素分泌增强[22]。高压氧环境中，迷走神经张力增强，机体内抗胰岛素物质减少，能使得血糖、胰岛素抵抗得到缓解[23]。振动训练辅助糖尿病治疗的运动处方是常采用的方式，振动训练产生的机械谐波振动使机体快速产生反复离心-向心收缩，同时快速募集比更多的肌纤维，由于运动强度较高，振动训练一般以无氧糖酵解供能为主，有氧氧化供能协同，无氧供能快速分解血液和肌肉中的葡萄糖，产生大量ATP和乳酸，血糖出现下降，振动训练的振动刺激会促使身体产生与内皮细胞有关的代谢物质，进而降低糖化血红蛋白水平。通过振动训练的机械刺激，脑垂体会增加生长激素分泌[24]，当血液生长激素浓度上升时会刺激肝脏分泌促进骨组织生长的胰岛素样生长因子1；胰岛素样生长因子1水平与胰岛素抵抗呈负相关，当体内胰岛素样生长因子1水平较低时，可导致胰岛素利用率、活性及敏感性降低；当胰岛素样生长因子1水平升高，通过负反馈可以增加胰岛素敏感性缓解胰岛素抵抗[25]。此次研究中加入振动训练的大鼠胰岛素样生长因子1水平有显著提升，再次验证了该机制。高压氧和振动训练均可以增加血糖消耗来直接降低血糖，但利用的供能系统有差异，在缓解胰岛素抵抗方面二者作用机制明显不同，所以联合使用对胰岛素抵抗具有更好的缓解效果。此次研究在干预方案中加入虾青素的糖尿病性骨质疏松症大鼠，与未加虾青素方案大鼠相比，其血糖降幅会有小幅增加，在先前研究中也有类似结果[20，26]，这可能是虾青素中虾青素酯和硬脂酸虾青素双酯能促进受胰岛素受体底物1诱导影响胰岛素敏感性的葡萄糖转运蛋白4的转位和葡萄糖吸收，并抑制JNK-1和活性氧的产生从而减轻对胰岛素信号通路的损伤[26]。此次研究中单独使用虾青素的糖尿病性骨质疏松症大鼠能够抑制胰岛素抵抗加剧，但未能有效降低血糖，这可能与虾青素摄入剂量、持续时间有关。总之高压氧+振动训练+虾青素干预方案可通过增加能耗、提升胰岛素样生长因子1分泌、减少胰岛细胞损伤等多种机制实现对糖尿病性骨质疏松症大鼠血糖控制、缓解胰岛素抵抗的效用。
3.2 干预方案对氧化应激的影响糖尿病患者持续高血糖使血液循环及组织中糖基化终末产物水平显著升高，糖基化终末产物与其受体结合使胰岛B细胞生成活性氧增加引起氧化应激[27]。糖尿病慢性并发症发病的统一机制学说认为，在持续高糖状态下，线粒体活性氧基生成增加可能是糖尿病各种并发症发生的中心环节[28]，糖尿病性骨质疏松症也与氧化应激密切相关。此次研究发现，振动训练和高压氧单独或联合干预均不会引发糖尿病性骨质疏松症大鼠体内脂质过氧化物升高，并能提升抗氧化酶的活性，不会诱发氧化应激，这与先前研究中发现的氧化应激是高压氧和振动训练干预的副反应并不一致。可能是副反应说的相关研究主要针对单次高压氧或振动训练干预后的表现进行讨论得出结论，随着高压氧导致氧暴露剂量的加大，氧自由基的含量显著增加，而抗氧化酶的增长有延迟，所以单次训练后有氧化应激现象产生，抗氧化系统反应滞后，超氧化物歧化酶等抗氧化酶活性也逐渐增加[29]，可清除过多产生的自由基，因而机体对高压氧出现适应反应。而振动训练因其高频机械振动特点在干预中肌肉离心收缩增加，这一方式有别于通常的向心收缩，初期干预中肌肉会出现轻微损伤，所以导致氧化应激和炎症反应，随着肌肉适应离心训练，氧化应激逐渐消失，而由于离心训练耗能多，易疲劳和乳酸堆积，机体抗氧化酶的活性被激发，以适应训练效应[9]。此次研究干预方案中加入虾青素的糖尿病性骨质疏松症大鼠脂质过氧化物均出现显著下降，而抗氧化酶活性显著上升，机体抗氧化能力显著增强。虾青素作为目前最强的天然抗氧化物，通过一条给出电子共轭双键的多烯烃链形成共振稳定的碳中心自由基使过氧化基失活，猝灭单线氧，清除氧自由基，保持线粒体的完整性和功能，同时还能增强抗氧化酶活性[30-31]。高压氧+振动训练+虾青素干预方案通过激活抗氧化酶活性、运动适应、减少脂质过氧化生成等机制联合作用降低糖尿病性骨质疏松症大鼠体内氧化应激，增强其抗氧化能力。
3.3 干预方案对骨密度、骨代谢和骨生物力学性能的影响此次研究发现，单独使用高压氧、振动训练、虾青素等辅助治疗手段均不能显著改善糖尿病性骨质疏松症大鼠的骨密度，而2种或3种辅助手段联用则可以显著改善骨密度。糖尿病患者持续高血糖，导致葡萄糖随尿液排出，高渗性利尿引起尿钙、镁丢失增多，从而引起血钙、镁等矿物质水平下降，低血钙、低血镁继发性引起甲状旁腺功能亢进，使甲状旁腺素分泌增加，激活破骨细胞，从而使骨钙动员，骨质脱钙，骨量流失。糖尿病患者血清胰岛素样生长因子1浓度较低，胰岛素样生长因子1与胰岛素敏感性相关，能促进胰岛素分泌[32]，胰岛素样生长因子1可促进成骨细胞的增殖和分化，提高成骨细胞对氨基酸的摄取，抑制胶原的降解，增加骨基质沉积，低水平的血清胰岛素样生长因子1是骨质疏松症和骨折发生的危险因素[33]。此次研究发现，经过高压氧或振动训练干预后，糖尿病性骨质疏松症大鼠在甲状旁腺素下降基础上血清钙水平保持稳定，这说明糖尿病性骨质疏松症大鼠骨形成作用加强，而尿钙/肌酐和血清碱性磷酸酶水平下降，说明糖尿病性骨质疏松症大鼠破骨作用减弱，骨量流失得到抑制。高压氧使糖尿病性骨质疏松症大鼠在高压环境中大量吸入纯氧进而增加血氧张力和体内氧分子弥散距离，从而促进血氧运送能力提高骨组织的氧供水平[8，18]。高压氧和高氧浓度环境可促进骨骺毛细血管增生，形成有效的侧支循环，加强骨钙、磷等电解质沉积，加速骨胶原蛋白生成，从而增加成骨作用，降低骨吸收，提高骨密度[5]。振动训练产生机械刺激令糖尿病性骨质疏松症大鼠血清胰岛素样生长因子1和降钙素浓度提升，促进成骨细胞的增殖分化，降低破骨细胞活性和数量，使骨形成作用增加，骨吸收和骨钙释放被抑制[9，24]。高压氧和振动训练均能显著降低血糖，随尿液排出的矿物质减少，血钙、磷、镁浓度水平升高，通过负反馈调价使甲状旁腺素浓度下降，使骨钙动员、骨质脱钙、骨量流失得到抑制[34]。高压氧和振动训练均能提升骨密度，且作用机制有明显差别，联合会产生更佳疗效。此次研究加入虾青素的干预方案与未加入的方案相比骨密度增幅略有提升，这可能与虾青素的抗氧化效果有关。糖尿病患者高血糖使糖基化终末产物水平显著升高进而引起发氧化应激，脂质过氧化物会激活成骨细胞外信号调节激酶1/2信号转导，从而抑制成骨细胞增殖分化，诱导其凋亡[35-36]；成骨数量减少，活性降低，最终导致成骨作用减弱，骨吸收大于骨形成，使糖尿病患者骨量不断流失；而虾青素作为抗氧化剂通过减少氧化应激导致的成骨细胞凋亡，抑制其吸收，减少骨量降低。此次研究中单独使用虾青素的糖尿病性骨质疏松症大鼠，代表骨吸收的钙/肌酐指标出现下降，而体现骨形成的骨钙素、血钙却没有显著变化，也印证了该观点。生物力学性能能够综合反映出骨密度、骨微观结构、骨皮质厚度和材料特性，骨生物力学性能可直接体现骨组织抵抗外力的能力，也是治疗手段的重要评价指标。在干预方案中加入振动训练的糖尿病性骨质疏松症大鼠的股骨生物力学性能优于未接受振动训练的大鼠，振动训练在振动平台上骨骼受到自身重力负荷压力和平台的振动负荷冲击，运动中肌肉持续快速收缩，这种收缩会对骨骼产生再次压力负荷，产生压电效应刺激成骨细胞的活性从而增加肌力并促进成骨生长，改善骨结构及其生物力学性能[19]。接受高压氧干预的大鼠骨生物力学性能虽逊于接受振动训练的大鼠，但优于未接受干预的大鼠。高压氧可能是通过能改善糖尿病性骨质疏松症大鼠股骨钙和骨胶原蛋白含量，进而改善股骨骨小梁、骨胶原的形态，最终达到改善其骨生物力学性能的效果[18]。总之，高压氧+振动训练+虾青素干预方案可通过降低血糖、抑制氧化应激对成骨细胞的损伤、提升胰岛素样生长因子1水平促进骨形成以及机械冲击等多种机制，达到提升糖尿病性骨质疏松症大鼠骨密度和骨生物力学性能的效用。
3.4 结论此次研究认为单独高压氧或振动训练均能对糖尿病性骨质疏松症大鼠起到降血糖、提升骨密度、改善骨生物力学性能的作用；虾青素通过其抗氧化性，起到降低血糖和降低骨吸收的作用；高压氧+振动训练+虾青素组合方案用于糖尿病性骨质疏松症辅助治疗可以有效控制血糖、缓解胰岛素抵抗、降低骨吸收、增加骨密度、改善骨生物力学性能，且效果明显优于单独使用高压氧或振动训练；高压氧+振动训练+虾青素组合方案在临床治疗中可作为药物方案外的辅助方案加入到糖尿病性骨质疏松症患者的整体治疗方案。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程