低氧预处理人羊膜间充质干细胞的生物学特征

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.3527

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (19): 3004-3008.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.3527

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

低氧预处理人羊膜间充质干细胞的生物学特征

代敏1，王帅1，张霓霓1，黄桂林1，余丽梅2，胡小华1，易杰1，姚礼1，张立刚1

1遵义医科大学附属口腔医院口腔颌面外科，贵州省遵义市 563003；2遵义医科大学附属医院贵州省细胞工程重点实验室，贵州省遵义市 563003

收稿日期:2020-07-29 修回日期:2020-07-30 接受日期:2020-08-25 出版日期:2021-07-09 发布日期:2021-01-13
通讯作者: 黄桂林，博士，教授，遵义医科大学附属口腔医院口腔颌面外科，贵州省遵义市 563003
作者简介:代敏，男，1988年生，贵州省桐梓县人，汉族，2018年遵义医科大学毕业，硕士，主治医师，主要从事头颈部组织缺损修复研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81760201)，项目负责人：黄桂林；国家自然科学基金(81860198)，项目负责人：张霓霓；遵义医科大学硕士启动基金(KY2019-1)，项目负责人：代敏

Biological characteristics of hypoxic preconditioned human amniotic mesenchymal stem cells

Dai Min1, Wang Shuai1, Zhang Nini1, Huang Guilin1, Yu Limei2, Hu Xiaohua1, Yi Jie1, Yao Li1, Zhang Ligang1

1Department of Oral and Maxillofacial Surgery, the Affiliated Stomatological Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi 563003, Guizhou Province, China; 2Key Laboratory of Cell Engineering in Guizhou Province, the Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi 563003, Guizhou Province, China

Received:2020-07-29 Revised:2020-07-30 Accepted:2020-08-25 Online:2021-07-09 Published:2021-01-13
Contact: Huang Guilin, MD, Professor, Department of Oral and Maxillofacial Surgery, the Affiliated Stomatological Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi 563003, Guizhou Province, China
About author:Dai Min, Master, Attending physician, Department of Oral and Maxillofacial Surgery, the Affiliated Stomatological Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi 563003, Guizhou Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81760201 (to HGL); the National Natural Science Foundation of China, No. 81860198 (to ZNN); the Master's Startup Fund of Zunyi Medical University, No. KY2019-1 (to DM)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
低氧预处理：预先通过短暂的非致死性低氧刺激以激活内源性保护信号途径，来抵抗随后发生的致死性缺血缺氧损伤的一种现象。
非细胞治疗：干细胞通过旁分泌机制分泌多种物质，如各种细胞因子、脂类、微囊泡、外泌体等，是细胞进行信息交换的主要物质，近年研究发现，通过注射干细胞分泌的这些蛋白质组在组织缺损修复治疗中具有重要的应用价值。

背景：干细胞移植治疗为许多疑难疾病带来了希望，但移植细胞存活数量少及分泌功能差，很难发挥治疗效用，致使该技术在临床应用受阻。低氧预处理可有效改善植入细胞的增殖活性、抗凋亡能力、分泌功能等生物学特性，因而，低氧预处理的人羊膜间充质干细胞有望在组织损伤修复中发挥更好的治疗作用。
目的：探讨低氧预处理对人羊膜间充质干细胞生物学特征的影响。
方法：利用机械法和酶消化法分离人羊膜间充质干细胞并传至第3代，将其低氧预处理(体积分数为3% O2)48 h，设置常氧(体积分数为21% O2)对照组，通过CCK-8及Edu增殖实验检测两组人羊膜间充质干细胞增殖活性及DNA合成率。将两组细胞用无血清培养基培养24 h后，Annexin V-FITC/PI实验检测细胞凋亡情况，收集上清液，采用血管生成蛋白芯片(Proteome Profiler)检测上清液中分泌的血管生成相关因子水平。
结果与结论：低氧预处理不影响人羊膜间充质干细胞的干细胞特性，能提高人羊膜间充质干细胞的增殖活性；在无血清培养条件下，低氧预处理使人羊膜间充质干细胞的抗凋亡作用得到增强，同时分泌了更多量的血管相关生成因子。

https://orcid.org/0000-0001-5017-5587(代敏)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 人羊膜间充质干细胞, 低氧, 预处理, 生物学特征, 增殖, 凋亡, 血管生成

Abstract: BACKGROUND: Stem cell transplantation has brought hope for many difficult diseases, but the survival number of transplanted cells is small and the secretion function is poor, so it is difficult to play a therapeutic effect, which hinders the clinical application of stem cell transplantation. Hypoxic preconditioning can effectively improve the biological characteristics of implanted cells, such as proliferation activity, anti-apoptotic ability and secretion function. Therefore, human amniotic mesenchymal stem cells pretreated with hypoxia may play a better therapeutic role in tissue damage repair.
OBJECTIVE: To study the effects of hypoxic preconditioning on the biological characteristics of human amniotic mesenchymal stem cells.
METHODS: The mechanical method and enzymatic digestion were used to separate human amniotic mesenchymal stem cells, and then cultured it up to the third generation. After having hypoxic pretreatment (3% O2) for 48 hours, the nomoxic (21% O2) control group was set. The proliferation activity and DNA synthesis rate of human amniotic mesenchymal stem cells in the two groups were detected by CCK-8 and Edu proliferation experiments. The two groups of cells were cultured by serum-free medium for 24 hours. Apoptosis was detected using Annexin V-FITC/PI assay. The supernatant was collected. The levels of angiogenic factors secreted in the supernatant were detected by using the Proteome Profiler.
RESULTS AND CONCLUSION: Hypoxic preconditioning does not affect the characteristics of human amniotic mesenchymal stem cells, but can improve the proliferation activity of human amniotic mesenchymal stem cells; in serum-free culture conditions, hypoxic preconditioning can enhance the anti-apoptotic effect of human amniotic mesenchymal stem cells, and secrete more angiogenic factors.

Key words: stem cells, human amniotic mesenchymal stem cells, hypoxic, preconditioning, biological characteristics, proliferation, apoptosis, angiogenesis

中图分类号:

代敏, 王帅, 张霓霓, 黄桂林, 余丽梅, 胡小华, 易杰, 姚礼, 张立刚. 低氧预处理人羊膜间充质干细胞的生物学特征[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(19): 3004-3008.

Dai Min, Wang Shuai, Zhang Nini, Huang Guilin, Yu Limei, Hu Xiaohua, Yi Jie, Yao Li, Zhang Ligang. Biological characteristics of hypoxic preconditioned human amniotic mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(19): 3004-3008.

图/表（结果） 6

2.1 人羊膜间充质干细胞的鉴定结果原代细胞呈短梭形、多角形及不规则形，5-7 d细胞聚合度达80%-90%；传代后细胞形态基本一致，第3代细胞呈放射状、旋涡状生长，见图1。免疫细胞化学染色结果显示，两组细胞波形蛋白表达阳性，成骨诱导后镜下观察均有橘红矿化结节形成，成脂诱导后油红O染色可见类脂滴样物质。流式细胞仪检测结果显示均高表达CD44、CD73、CD90、CD105，低表达CD19、CD34、CD45、CD11b、HLA-DR，见图2。

2.2 低氧预处理对人羊膜间充质干细胞增殖活性的影响 CCK-8检测结果显示：低氧预处理组和常氧组在1-7 d的吸光度值均先增加后降低，低氧预处理组在1-7 d的吸光度值高于常氧组，见图3，两组间的差异通过重复测量方差分析，差异有显著性意义(F=200.942，P < 0.01)；进一步通过Edu标记培养细胞验证，结果显示低氧预处理组DNA合成率(29.50±3.53)%较常氧组(16.55±0.78)%增高，见图4，差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.3 低氧预处理影响人羊膜间充质干细胞的凋亡 Annexin V-FITC/PI检测结果显示：在无血清培养条件下低氧预处理组的细胞凋亡率(4.87±0.86)%较常氧组(12.31±1.14)%减少，见图5，两组差异有显著性意义(t=5.230，P < 0.01)。

2.4 低氧预处理影响人羊膜间充质干细胞的分泌功能 Promteome Profiler(ARY 007)结果显示：低氧预处理组上清液含有9种血管相关生成因子，常氧组含有8种，其中低氧预处理组IGFBP-3、Pentraxin 3、Serpin E1、Thrombospondin-2水平明显高于常氧组，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图6。

参考文献

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引言

材料方法

1.1 设计细胞学体外实验。
1.2 时间及地点实验于2016年10月至2018年7月在遵义医科大学贵州省细胞工程重点实验室和贵州省高等学校口腔疾病研究特色重点实验室暨遵义市口腔疾病研究重点实验室完成。
1.3 材料实验所使用的胎盘来自于遵义医科大学附属医院产科足月健康产妇，无其他疾病，术前均签署知情同意书，符合遵义医科大学附属医院伦理委员会要求。
实验试剂和仪器：DMEM/F12培养基、胎牛血清(Gibco，美国)；Annexin V-FITC/PI、波形蛋白抗体(Solarbio，中国)；Proteome Profiler(ARY 007，R&D Systems，美国)；成骨、成脂诱导培养基(Cyagen，美国)；CCK-8试剂盒(同仁公司，日本)；三气培养箱(UnAire，美国)；二氧化碳培养箱
(Forma，美国)；倒置相差显微镜(CX40RF400)；倒置荧光显微镜(Olympus，日本)；流式细胞仪(Becton Dickinson，美国)。
1.4 实验方法
1.4.1 人羊膜间充质干细胞分离及培养在无菌条件下剥离胎盘羊膜后转移到实验室，用玻片反复清刮羊膜表面，含双抗PBS冲洗干净，剪碎约0.1 cm3，0.05%胰蛋白酶-0.02% EDTA消化液在200 r/min、37 ℃恒温水浴摇床消化35 min；倒出消化液，按以上过程再消化1次，300目钢网过滤，PBS冲洗，将余留组织用0.5 g/L Ⅱ型胶原酶-0.05 g/L DnaseⅠ在37 ℃、200 r/min消化2 h，300目钢网过滤，收集滤液，终止消化，1 250 r/min离心9 min，弃上清液，完全培养基重悬细胞，置于CO2培养箱内培养、传代。将第3代细胞随机分为2组：低氧预处理组：体积分数3% O2、体积分数5%CO2、37 ℃；常氧组：体积分数21% O2、体积分数5%CO2、37 ℃；其余氮气平衡，预处理48 h后进行相关检测。

1.4.2 免疫细胞化学染色将两组细胞接种于10 mm培养皿，待贴壁达70%左右，40 g/L多聚甲醛固定20 min，0.5%
Triton-X100作用16 min，山羊血清封闭1 h，滴加鼠抗人波形蛋白单克隆抗体4 ℃孵育8 h，体积分数为3% H2O2封闭10 min，滴加通用型二抗，37 ℃湿盒中孵育30 min，滴加DAB显色，苏木精复染，倒置显微镜下观察。
1.4.3 表型鉴定将两组细胞消化后用PBS调整密度为2×
109 L-1，每个流式管加入200 μL，室温下避光加入鼠抗人单克隆抗体CD44-PE，CD90-FITC，CD105-PerCP-Cy，CD73-APC和阴性对照混合液CD34-PE，CD19-PE，CD45-PE，CD11b-PE，
HLA-DR，混匀，避光作用30 min，加入600 μL PBS，混匀，离心、弃上清，加入10 g/L多聚甲醛400 μL固定，4 h内流式细胞仪分析样品，结果用Cell Quest软件分析。
1.4.4 成骨、成脂诱导培养将两组细胞消化、稀释后以1×105/孔接种于6孔板，待细胞聚合达60%左右时，改为成骨/成脂诱导培养基培养，每3 d换液1次，诱导21 d，PBS漂洗3次，40 g/L多聚甲醛固定15 min，分别于室温下茜素红染色3 min/油红O染色7 min，倒置显微镜下拍照记录。
1.4.5 增殖活性检测
(1)CCK-8法：将两组细胞消化、计数，完全培养基稀释细胞密度为2×107 L-1，接种于96孔板，每孔滴加100 μL，设置7组，每组5个复孔，分别在1，2，3，4，5，6，7 d每孔滴加10 μL CCK-8溶液，放入CO2培养箱孵育2.5 h，酶标仪测定450 nm处吸光度值。
(2)Edu细胞增殖实验：将两组细胞消化稀释后分别以1×105的细胞数接种于10 mm培养皿，CO2培养箱孵育48 h；加入50 μmol/L的Edu培养基后放入CO2培养箱孵育2 h；40 g/L多聚甲醛固定30 min，0.2%甘氨酸溶液作用6 min，0.5% TritonX-10室温下作用10 min；避光加入1×Apollo液作用25 min，0.5% TritonX-100荡洗3次；恒温避光条件下加入1×Hoechst 33342染液作用30 min；荧光显微镜下观察拍照。
1.4.6 Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡情况将两组细胞消化、稀释后以2×106个接种T75培养瓶，放入CO2培养箱孵育8 h；加入无血清培养基孵育24 h，收集细胞；PBS调整细胞浓度为1×109 L-1；加入1×缓冲液悬浮细胞，收集细胞；再用1×缓冲液调整细胞浓度为1×109 L-1，每组取3支EP管加入100 μL悬液，滴加AnnexinV-FITC，避光、混匀，10 min后加入PI染液，作用10 min后上流式细胞仪检测分析。
1.4.7 血管生成相关因子检测收集以上步骤(1.4.6)无血清培养基孵育24 h后上清液样本，1 250 r/min离心7 min，分别取3 mL分装于EP管，标记；应用Proteome Profiler (ARY 007)
血管生成蛋白抗体芯片检测，凝胶成像系统成像并观察结果，Image J软件分析。
1.5 主要观察指标 ①低氧预处理组和常氧组人羊膜间充质干细胞的形态学观察、表型鉴定和成骨成脂诱导能力鉴定；②在无血清培养条件下，低氧预处理组和常氧组人羊膜间充质干细胞的抗凋亡作用和血管相关生成因子分泌情况。
1.6 统计学分析应用SPSS 18.0软件进行统计分析。统计量采用x±s表示，组间比较采用单因素方差分析及两独立样本t检验，检验水准α=0.05。

讨论

人羊膜间充质干细胞具有高度的自我更新和多向分化潜能[8]，不仅可向3个胚层分化[9]，还能分泌众多生物活性因子，在促进血管形成、细胞存活、免疫调节和改善病变微环境中起重要作用，异基因移植后无致瘤和免疫排斥风险，且取材方便、无创伤、来源充足、无伦理学争议[10-11]。因此，人羊膜间充质干细胞是再生医学领域重要的干细胞来源[12]，可望用于进行诸多疾病的细胞治疗，如放射性涎腺损伤及组织缺损的修复与重建等[13-14]。目前干细胞移植技术用于临床疾病治疗遇到关键的制约因素——移植干细胞存活率低及到达损伤部位细胞数量少，如干细胞移植后4 d内发生凋亡或死亡的细胞达1/3以上，很难在病变部位起到治疗效用[15]。
目前研究证明通过预处理方案可改善移植干细胞的生物学特性。对植入细胞预处理的方法主要有低氧、细胞因子/
生长因子培养诱导和基因调控等，其中细胞/生长因子预处理是在培养基中加入肿瘤坏死因子α、转化生长因子β1、成纤维细胞生长因子、白细胞介素6等，有效时间较短，作用比较单一。基因调控是通过过表达一些干细胞保护基因来增加细胞的抵抗力，如热休克蛋白20 [16]、腺病毒Ad-sTβR转染以及低氧诱导因子1α等[17]，但是基因编辑从遗传学角度分析存在有一定的风险，例如移植细胞的基因整合到宿主基因中可能诱发突变，提高移植风险，引发致瘤风险可能。从临床应用安全的角度来看，改变培养环境的方法比条件培养基和基因调控的方法更为简单、安全有效。低氧预处理是一种安全可靠并可应用于临床的方法，以促进细胞的植入存活率、分化、归巢，而不改变宿主基因的稳定性。例如LEE等[18]
研究证实体积分数为2% O2低氧预处理间充质干细胞促进其存活、增殖和血管生成因子的分泌。该研究将人羊膜间充质干细胞培养在体积分数为3% O2的低氧培养箱中，观察对细胞贴壁生长及形态的影响，并与在常氧培养箱培养的细胞进行对比，结果显示：低氧预处理的细胞能够正常贴壁生长，呈长梭形，与常氧培养的细胞比较没有明显差异，说明低氧预处理不会影响人羊膜间充质干细胞形态和贴壁生长的特性。两组细胞均高表达CD44、CD73、CD90、CD105及波形蛋白，低表达CD19、CD34、CD45、CD11b、HLA-DR，并可向成骨、成脂肪诱导分化，说明低氧预处理不影响人羊膜间充质干细胞表面标记分子的阳性表达及诱导分化。
该研究通过平行记录常氧/低氧条件下人羊膜间充质干细胞生长不同时间的细胞数目和增殖活性，发现低氧预处理促进人羊膜间充质干细胞生长和增殖活性。姚舜等[19]研究显示，体积分数5% O2预处理人脐带间充质干细胞可提高增殖能力，短期内获得足够数量的细胞，并提高神经营养因子分泌。但也有文献报道低氧条件能抑制间充质干细胞的增殖，KUMAR等[20]发现经低氧预处理Fischer-344大鼠来源骨髓间充质干细胞后增殖能力与对照组相比受到抑制，这些研究显示低氧预处理对不同来源间充质干细胞增殖活性影响存在差异。
间充质干细胞旁分泌功能是细胞治疗基础的重要特性之一，干细胞通过旁分泌机制分泌多种物质，如各种细胞因子、脂类、微囊泡、外泌体等是细胞进行信息交换的主要物质[21]。近年研究发现，干细胞分泌的这些蛋白质组在进行组织缺损修复的非细胞治疗中具有重大的应用价值，如AN等[22]研究了低氧预处理的脂肪间充质干细胞修复放射性损伤涎腺功能的机制，发现涎腺组织内的上皮细胞、内皮细胞、肌上皮细胞和涎腺干/祖细胞均受到脂肪间充质干细胞分泌的蛋白质组保护，同时发现这些蛋白质组中含有粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、血管内皮生长因子、白细胞介素6、胰岛素样生长因子1等因子，因此认为放射损伤涎腺组织修复的真正原因是间充质干细胞分泌营养因子的作用；TRAN等[23]将一定数量的骨髓基质干细胞经冻融后高速离心，将获得的细胞分泌物经静脉或局部注射到放射性损伤涎腺组织中，结果发现这些分泌物不仅能保护涎腺腺泡细胞、导管、肌上皮细胞和干/祖细胞，促进细胞增殖和血管增生，还能上调涎腺组织重塑、修复、再生基因的表达。到目前为止，这些细胞分泌物中确切的生物活性成分及作用机制并不十分清楚。
LOMBAERT等[24]总结间充质干细胞中含有表皮细胞生长因子、成纤维细胞生长因子2、成纤维细胞生长因子7、粒细胞集落刺激因子、重组人音猬因子、血管内皮生长因子、Wnt信号传导通路蛋白等各种细胞因子，它们通过各种信号途径阻止放射性损伤细胞的凋亡、促进腺体内处于休眠状态的内源性干细胞增殖、减小氧化应激反应和脂质过氧化反应，用这些分泌物修复损伤组织的效果明显优于全细胞、单个或多个因子的联合应用[25]。低氧预处理是一种安全可靠并可应用于临床的方法，该实验研究结果显示：低氧预处理的人羊膜间充质干细胞较常氧组能分泌更多量的IGFBP-3、Pentraxin 3、
Serpin E1、Thrombospondin-2细胞因子，这些因子对血管形成和细胞增殖等产生调节作用[26-27]，而且低氧预处理后人羊膜间充质干细胞更能耐受无血清培养条件。
综上所述，体积分数为3% O2低氧预处理能提高人羊膜间充质干细胞的增殖活性、抗凋亡作用和分泌功能，并保持干细胞特性，这为组织损伤的修复研究，特别是研究团队正在进行的放射性涎腺功能损伤的修复研究提供了良好的干细胞来源，为下一步的研究打下了基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

低氧预处理人羊膜间充质干细胞的生物学特征

Biological characteristics of hypoxic preconditioned human amniotic mesenchymal stem cells

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