3D打印成型纳米羟基磷灰石/壳聚糖/聚己内酯三元复合支架材料的构建及表征

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2238

中国组织工程研究 ›› 2020, Vol. 24 ›› Issue (10): 1496-1501.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2238

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3D打印成型纳米羟基磷灰石/壳聚糖/聚己内酯三元复合支架材料的构建及表征

余和东¹，张丽¹，夏凌云¹，毛敏¹，倪小兵¹，冷卫东¹，罗杰²

十堰市太和医院(湖北医药学院附属医院)，¹口腔医学中心，²神经外科，湖北省十堰市 442000

收稿日期:2019-07-20 修回日期:2019-07-26 接受日期:2019-09-07 出版日期:2020-04-08 发布日期:2020-02-15
通讯作者: 罗杰，主任医师，教授，十堰市太和医院(湖北医药学院附属医院)神经外科，湖北省十堰市 442000
作者简介:余和东，男，1985年生，湖北省丹江口市人，汉族，2013年中国医科大学毕业，硕士，主治医师，主要从事于骨缺损修复材料的基础研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81671831)

Construction and characterization of nano-hydroxyapatite/chitosan/polycaprolactone composite scaffolds by 3D printing

Yu Hedong¹, Zhang Li¹, Xia Lingyun¹, Mao Min¹, Ni Xiaobing¹, Leng Weidong¹, Luo Jie²

¹Stomatological Center, ²Department of Neurosurgery, Taihe Hospital (Affiliated Hospital of Hubei University of Medicine), Shiyan 442000, Hubei Province, China

Received:2019-07-20 Revised:2019-07-26 Accepted:2019-09-07 Online:2020-04-08 Published:2020-02-15
Contact: Luo Jie, Chief physician, Professor, Department of Neurosurgery, Taihe Hospital (Affiliated Hospital of Hubei University of Medicine), Shiyan 442000, Hubei Province, China
About author:Yu Hedong, Master, Attending physician, Stomatological Center, Taihe Hospital (Affiliated Hospital of Hubei University of Medicine), Shiyan 442000, Hubei Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81671831

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
组织工程骨：将体外培养的功能相关的种子细胞种植于天然的或人工合成的支架材料内，加入生长因子体外培养一段时间，将他们移植到体内，促进组织修复和骨再生的人工骨。组织工程骨形成的3要素为：支架材料、成骨细胞、生长因子。
生物陶瓷：生物表面活性陶瓷通常含有羟基，还可做成多孔性，生物组织可长入并同其表面发生牢固的键合；生物吸收性陶瓷的特点是能部分吸收或者全部吸收，在生物体内能诱发新生骨的生长。生物活性陶瓷具有骨传导性，它作为一个支架，成骨在其表面进行；还可作为多种物质的外壳或填充骨缺损。生物陶瓷有羟基磷灰石陶瓷、磷酸三钙陶瓷等。

背景：目前常用的骨缺损修复支架材料种类较多，但单一类型材料难以满足骨组织工程支架材料的要求，通过合适的方法将几种单一材料组合形成复合型材料，综合考虑各种材料优缺点，是近年来学者们的研究重点。

目的：构建纳米羟基磷灰石/壳聚糖/聚己内酯三元复合支架材料，并作表征分析研究。

方法：采用3D打印成型技术制备纳米羟基磷灰石/壳聚糖/聚己内酯多孔三元复合支架材料，从X射线衍射分析、吸水率、抗压强度、体外降解性能、孔径分析、扫描电镜分析等多个维度对支架材料进行表征研究。

结果与结论：①X射线衍射分析显示，纳米羟基磷灰石/壳聚糖/聚己内酯多孔三元复合支架的晶型峰图与羟基磷灰石粉末衍射标准卡片类似，表明该三元复合支架是通过物理作用相互结合的，不影响羟基磷灰石的生物学功能；②三元复合支架的吸水率为18.28%，亲水性好，支架可承受的最大压力为1 415 N，其体外降解速率与成骨速率相当；③显微镜下可见三元复合支架的内孔为方形，孔径250 µm，孔径大小均匀、分布有致；④扫描电镜下三元复合支架可见，壳聚糖和聚己内酯组成的纤维排列整齐有序，成网格状，羟基磷灰石呈颗粒状在纤维表面均匀分布，三元复合材料呈现均匀、疏松的微孔结构；⑤结果表明，通过3D打印成型技术可成功制备纳米羟基磷灰石/壳聚糖/聚己内酯三元复合支架材料，其具有适度的抗压强度、一定的孔隙率、适宜的降解速度和吸水率，能为修复骨缺损的奠定基础。

ORCID: 0000-0002-6321-9160(余和东)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 羟基磷灰石, 壳聚糖, 聚己内酯, 3D打印, 支架材料, 表征分析, 骨缺损, 复合材料

Abstract:

BACKGROUND: At present, there are many types of bone defect repair scaffolds, but a single type of material is difficult to meet the requirements of bone tissue engineering scaffold materials. Several suitable materials can be combined into a composite material by appropriate methods, taking into account the advantages and disadvantages of various materials. It is the focus of scholars in recent years.

OBJECTIVE: To construct nano-hydroxyapatite/chitosan/polycaprolactone composite scaffolds and analyze characterization of composite scaffolds.

METHODS: Nano-hydroxyapatite/chitosan/polycaprolactone porous ternary composite scaffold material was prepared by 3D printing and molding technology. The characterization of scaffold material was studied from X-ray diffraction analysis, stent water absorption rate, stent compressive strength, stent degradation performance in vitro, stent aperture analysis, scanning electron microscope analysis and other dimensions.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) X-ray diffraction analysis showed that the crystal-shaped peak map of nano-hydroxyapatite/chitosan/ polycaprolactone scaffold materials was similar to the hydroxyapatite powder diffraction standard card, suggesting that the scaffold materials were integrated with each other through physical interaction, and did not affect the biological function of hydroxyapatite. (2) The average water absorption rate of the scaffold was 18.28%, and the hydrophilicity was good. The maximum pressure that the scaffold could withstand was 1 415 N, and the degradation rate was similar to the osteogenic rate. (3) Under a microscope, a ternary scaffold material with an aperture of 250 μm was successfully produced. The pore size was uniform and distributed regularly. (4) Scanning electron microscope demonstrated that the fibers composed of chitosan and polycaprolactone were arranged orderly and grid like, hydroxyapatite was distributed uniformly on the fiber surface in granular form, and the ternary composite material presented uniform and loose microporous structure. (5) Nano-hydroxyapatite/chitosan/polycaprolactone ternary composite scaffold material can be successfully prepared through 3D printing and molding technology, which has moderate compressive strength, certain porosity, appropriate degradation rate and water absorption rate, and can lay a foundation for repairing bone defects.

Key words:

hydroxyapatite, chitosan, polycaprolactone, 3D printing, scaffold material, characterization analysis, bone defect, composite material

中图分类号:

余和东, 张丽, 夏凌云, 毛敏, 倪小兵, 冷卫东, 罗杰. 3D打印成型纳米羟基磷灰石/壳聚糖/聚己内酯三元复合支架材料的构建及表征[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(10): 1496-1501.

Yu Hedong, Zhang Li, Xia Lingyun, Mao Min, Ni Xiaobing, Leng Weidong, Luo Jie. Construction and characterization of nano-hydroxyapatite/chitosan/polycaprolactone composite scaffolds by 3D printing[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2020, 24(10): 1496-1501.

图/表（结果） 5

2.1 三元复合支架材料的构建作者所在团队采用3D打印成型技术制作了纳米羟基磷灰石/壳聚糖/聚己内酯三元复合生物陶瓷材料，其孔径为250 μm，具体标本见图1。

2.2 三元复合支架材料的表征分析

2.2.1 X射线衍射分析结果 X射线衍射分析显示，支架的晶型峰图与羟基磷灰石粉末衍射标准卡片(JCPDS No.09-0432)类似，表明纳米羟基磷灰石/壳聚糖/聚己内酯三元复合支架是通过物理作用相互结合的，不影响羟基磷灰石的生物学功能，具体见图2。

2.2.2 支架吸水率测定结果纳米羟基磷灰石/壳聚糖/聚己内酯三元复合支架的吸水率为(18.28±1.63)%，并且在60 s内其吸水率呈直线上升，当达到110 s时其吸水能力达到了其饱和量的90%，在7 min时达到95%。表明支架润湿性好，表面更易于结合人体组织液和成骨细胞，有利于进行进行细胞共培养和动物体内的植入。

2.2.3 支架抗压强度分析结果对样本施加压力在1 243 N以内时，随着压力的增大，样本位移呈直线上升；施加压力在1 243-1 486 N之间时，样本的位移量随着压力的增高，位移量是最大的；当达到3 729 N时，随着压力的增高，位移量逐渐变小，当达到9 944 N 时位移量也仅为8 mm，具体见图3；一共测试5个样本，取平均值，测出支架可承受的最大压力约为1 415 N。

2.2.4 支架体外降解性能分析结果连续10周的降解，纳米羟基磷灰石/壳聚糖/聚己内酯三元复合支架的降解率为7.39%，表明其具有一定的生物稳定性，同时随时间推移会缓慢的降解，降解速率与成骨速率相当，这样在支架材料降解的同时有新骨长入，才能有效修复骨缺损。

2.2.5 支架孔径分析结果显微镜下观察的支架形态，内孔为方形，大小为250 μm左右，孔径大小均匀，且分布有致，具体见图4。

2.2.6 扫描电镜分析结果对纳米羟基磷灰石/壳聚糖/聚己内酯三元复合支架进行扫描电镜分析，纵切图显示支架的沟壑结构错落有致，横切图显示复合支架结构致密紧凑。整体观察到壳聚糖和聚己内酯组成的纤维排列整齐有序，成网格状，羟基磷灰石呈颗粒状在纤维表面均匀分布，三元复合材料呈现均匀、疏松的微孔结构，具体见图5。

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引言

肿瘤、创伤及感染等因素均会导致不同程度和不同类型的骨缺损。据研究报道，中国每年骨缺损患者至少500万，骨修复材料年市场规模已达4 000亿人民币，2012年骨修复方面的花费可能占到发展中国家总体医疗开支的25%^[1]，这一数据随着社会发展可能会进一步升高。因此寻找更好的骨组织再生修复材料，为患者再造功能和美学，是再生医学研究的前沿和热点问题。自体骨、异体骨、异种骨移植由于存在供体来源有限、疾病相互传播、免疫排斥等问题，难以完全满足患者和临床医生的需要，研发具有自主知识产权的生物材料是解决骨缺损修复材料短缺的根本途径。尽管目前临床上已有多种骨缺损修复材料，但其均无法良好模拟天然骨组织优良的组分构成及多级分层结构。此外大量研究结果表明，体外构建的组织工程骨在临床应用受到限制，如大尺寸组织工程骨的血管化问题、体内外环境的巨大差异导致体外培养的细胞在植入体内后存活率较低、临床应用时限要求及活体器件的保存运输等^[2-4]，这些问题截止目前尚无完善的解决方案。

组织工程技术的发展为骨缺损修复提供了新的思维方式和方法，是将体外培养的功能相关种子细胞种植于天然的或人工合成的支架材料内，体外培养一段时间后将他们移植到体内，再造或者修复器官与组织的技术^[5-6]。那么组织工程技术最为关键的技术就是支架材料的构建，支架材料的构建是采用人工合成的支架材料为新生细胞(比如成骨细胞)、调控因子提供生长空间并引导其生长，它不仅要有一定的机械强度，还要有生物降解性、合适的降解速度等优越的生物力学性能。据国内外研究报道，目前常用的修复骨缺损所用支架材料有3大类：无机的生物陶瓷材料、人工合成的可降解聚合物、天然的或者合成的高分子可降解物等。这3类材料都有其缺陷，生物陶瓷虽然骨结合生物活性高但强度低；可降解聚合物强度高，但没有细胞识别标识，亲水性差；高分子可降解物降解速度太快，抗力性差。所以单一类型材料一般难以满足骨组织工程支架材料的要求，通过合适的方法将几种单一材料组合，综合考虑各种材料优缺点，互相取长补短，形成复合型材料，是近年来学者们的研究重点。

羟基磷灰石在组织和结构上与颌骨和颅骨的无机成分相似，具有良好的生物相容性，并能诱导成骨，缺点是羟基磷灰石过载发生时会出现断裂，限制了其在承载部位的应用。壳聚糖是一种线性的天然高分子聚糖基化合物，生物相容性、可降解性、亲水性和细胞亲和力、黏附力均比较优越。聚己内酯是一种线性聚合物，是利用己内酯单体聚合而得来的脂肪族聚酯，机械强度较高，易于加工，同时降解产物可以通过体内三羧酸循环或者肾小管的代谢清除，已用于骨修复多年。研究拟利用纳米羟基磷灰石、壳聚糖和聚己内酯这3种材料各自的优点来克服他们的缺点，通过3D打印成型技术制备出纳米羟基磷灰石/壳聚糖/聚己内酯多孔复合支架材料，以改善其生物学性能和力学性能，而支架材料的表征如支架吸水率、抗压强度、降解性能、支架孔径等性能决定了其是否能为种子细胞提供物理和生物学稳定性，故拟阐述纳米羟基磷灰石/壳聚糖/聚己内酯三元复合支架材料的构建技术，并对其做表征分析，为复合支架材料修复骨缺损提供理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计三元复合材料的构建和表征分析。

1.2 时间及地点实验于2017年1月至2018年9月在西安交通大学理学院和十堰市太和医院完成。

1.3 材料纳米羟基磷灰石 (H-106378，阿拉丁)、壳聚糖(C8302，索莱宝)、聚己内酯(24980-41-4，艾科试剂)，见表1；二氯甲烷和无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司)。

实验用仪器与设备：电子分析天平(BSA 224S-CW，Sartorius(USA))；3D打印机(3D Bio-Architect Pro，杭州捷诺飞生物科技有限公司)；电子分析天平[BSA 224S-CW，Sartorius(USA)]；微机控制电子万能试验机(ETM204C，北京博医实验仪器有限公司)；X射线衍射仪(D8 ADVANCE，德国BRUKER)；显微镜(CX41，OLYMPUS)；电热鼓风干燥箱(DHG-9070A)。

1.4 实验方法

1.4.1 三元复合支架材料的构建采用的是3D打印成型技术制备纳米羟基磷灰石/壳聚糖/聚己内酯多孔支架材料。其制备关键是保持材料原料半流动性以及在低温下快速固化成型。主要根据CAD分层数据控制流动相浆料在一定压强下从喷头中挤出并凝固，之后一层一层叠加后形成三维模型。

浆料配置：①将纳米羟基磷灰石粉末均匀分散于水中，浓度为25%，超声分散，加入分散剂，提高分散性；②将2%壳聚糖溶于浓度1%的醋酸水溶液中，充分溶解至透明；③称取2 g聚己内酯，按质量体积比为1∶10 溶于20 mL二氯甲烷中充分溶解，3者的比例经过反复摸索之后为5∶3∶2，并加入增稠剂提高浆料的黏性与稳定性。

CAD制图设计10 mm×10 mm×5 mm三维图形，图形模型导入3D-Bioprinter软件，并对图形进行分层数据。打开氮气，将配制好的浆料置于物料桶内，设置好分压。选择打印针头并进行物料出料校准。设置与调节打印参数，包括出料温度、平台温度等。三维支架成型，室温下放置4 h以上，45 ℃与60 ℃分别恒温干燥箱中特续干燥12 h。支架材料间的孔隙直径主要由针头孔径与打印设置孔径决定。

1.4.2 三元复合支架材料的表征分析

X射线衍射分析：将支架样品充分干燥后用X射线衍射仪进行扫描，对支架结果进行分析。

支架吸水率测定：干燥支架称质量后(G)，将支架至于生理盐水中，37 ℃条件下恒温箱维持24 h，之后取出支架，用滤纸吸去支架多余的水分，用精密天平乘量吸水后的质量(B)，吸水率计算公式W=(B-G)/G×100%，由结果测得3个平行支架的平均吸水率。

支架抗压强度分析：取圆柱形支架，上下朝向，利用微机控制电子万能试验机以0.5 mm/min加压，绘出力与位移的曲线，并得出抗压强度，环境温度22.3 ℃，相对湿度52%。

支架体外降解性能分析：通过体外浸泡实验来观察和评价材料在模拟体液中所表现出的生物活性和生物降解性能。选择生理盐水溶液作为材料的降解介质，研究材料的体外降解行为。取样品10份，每份干燥称质量，将样品浸没于质量为样品100倍的生理盐水中，空气环境中在37 ℃电热恒温培养箱下进行培养，分别于每周随机取出1份，称取其质量，观察分析降解性能。降解率的计算是通过样品在模拟体液中溶解质量占原始质量的百分含量来表示，即：降解率=(m₀-m₁)/m₀×100%，m₀为支架材料的原始质量，m₁为支架材料降解后的质量。

支架孔径分析：将置于显微镜下观察，拍照，分析支架孔径大小。

扫描电镜分析：样品喷金，采用Hitachi S-4300冷场发射高分辨扫描电镜分析样品孔径形态及孔结构。

1.5 主要观察指标纳米羟基磷灰石/壳聚糖/聚己内酯三元复合支架的X射线衍射分析、吸水率、抗压强度、体外降解性能、孔径分析与微观结构。

讨论

组织工程技术的发展为骨缺损修复提供了新的思维方式和方法，它是将体外培养的功能相关的种子细胞种植于天然的或人工合成的支架材料内，体外培养一段时间后将他们移植到体内，来修复骨缺损的技术^[5-6]。那么组织工程技术最为关键的技术就是支架材料的构建，支架材料的构建是采用人工合成的支架材料为新生细胞(比如成骨细胞)和生长因子提供支架，在支架材料逐渐降解的同时有新骨长入，最后支架材料逐渐被新骨所替代，最终达到修复骨缺损的目的^[7]。所以修复骨缺损的支架材料非常重要，它不仅要有一定机械强度，还要有生物降解性、合适的降解速度优越的生物力学性能。根据国内外研究报道，目前常用的修复骨缺损所用支架材料有3大类：无机的生物陶瓷材料、人工合成的可降解聚合物、天然的或者合成的高分子可降解物等^[8]。但是这3类材料都有其缺陷，生物陶瓷虽然骨结合生物活性高但强度低；可降解聚合物强度高，但是没有细胞识别标识，亲水性差；高分子可降解物降解速度太快，抗力性差。所以单一类型材料一般难以满足骨组织工程支架材料的要求，通过合适的方法将几种单一材料组合，综合考虑各种材料优缺点，互相取长补短，形成复合型材料，是近年来学者们的研究重点。IGNJATOVIC等^[9]通过将羟基磷灰石与聚L-丙交酯复合后，提高了支架的力学性能(如压缩强度和压缩模量)，并且支架孔隙率和孔径与正常骨组织接近，利于成骨细胞的长入、增殖。CHEN等^[10]将聚乳酸与聚乳酸-羟基乙酸共聚物复合物在胶原溶液浸泡后，在共聚物孔内形成了一薄层胶原海绵，显著提高了细胞的亲水性和细胞黏附、增殖能力。此次实验利用纳米羟基磷灰石、壳聚糖和聚己内酯这3种材料各自的优点来克服他们的缺点，通过3D打印成型技术制备出了纳米羟基磷灰石/壳聚糖/聚己内酯三元复合支架材料。复合支架材料的构建目的是通过物理的和化学方法将不同类型的单一材料构建为一个总体，以改善其生物学性能和力学性能^[11]。

支架材料的结构和性能满足细胞附着、增殖、分化、成长的要求，既能为成骨细胞生长提供模板又能为细胞生长提供支撑，引导骨缺损部位骨组织再生，最终达到修复骨缺损的目的^[12]。此次实验从X射线衍射分析、吸水率、抗压强度、体外降解性能、孔径分析、扫描电镜分析等多个维度表征支架，为后续的细胞研究和动物实验研究奠定基础。X射线衍射结果分析显示，三元复合支架的晶型峰图与羟基磷灰石粉末衍射标准卡片(JCPDS No.09-0432)类似，表明纳米羟基磷灰石/壳聚糖/聚己内酯三元复合支架是通过物理作用相互结合的，不影响羟基磷灰石的生物学功能，继续保留了羟基磷灰石优良的骨传导性和促进成骨细胞黏附的能力^[13]。支架的吸水率在60 s内呈直线上升，当达到110 s时其吸水能力达到了其饱和量的90%，在7 min时达到95%，表明支架润湿性好，亲水性比较好，更易于有利于成骨细胞的附着，这也从宏观上证明了支架材料有一定孔隙率，并且相互融通互联。有研究证实，材料的吸水性能影响细胞的黏附和生理、生化等方面功能的行使^[14]，当然也有研究证实材料的吸水性能与壳聚糖含量有关，在一定范围内其含量越高吸水性能越好^[15]。所以实验加入适量壳聚糖是正确的选择，结果也验证了其有良好的吸水性能。支架的抗压强度是支架力学性能中的一个重要的指标。实验中支架可承受的最大压力约为1 415 N，这完全满足了人体骨骼系统承重骨缺损修复方面的标准^[16]，即使是青壮年患者也完全适合。国内外研究显示，壳聚糖、纳米羟基磷灰石、聚己内酯这3种材料的降解速率递减，聚己内酯降解速率最慢，随着壳聚糖比例的增加，支架材料的降解速度变快，可能是因为壳聚糖亲水能力优越的原因^[17-20]。故实验调控好壳聚糖、纳米羟基磷灰石、聚己内酯这3者的比例含量，将降解速度控制在与成骨速率相当的程度，这样在支架材料降解的同时有新骨长入，才能有效修复骨缺损。研究证实，合适的孔隙率且所有孔之间相互连通融合是保证细胞及各种深圳因子附着、黏附并正常生长的基础，同样可以保证细胞的营养供应、氧气运输、代谢废物的有效排除^[21-22]。显微镜下观察三元复合支架的形态，内孔为方形，大小为250 µm左右，孔径大小均匀，且分布有致，相互连通，符合细胞生长的以上要求，能模拟人体内环境体液的流动。对三元复合支架进行扫描电镜分析，进一步验证了其具有良好的孔隙率，纵切图显示支架的沟壑结构，错落有致；横切图显示复合支架结构致密紧凑。整体观察到壳聚糖和聚己内酯组成的纤维排列整齐有序，成网格状，羟基磷灰石呈颗粒状在纤维表面均匀分布，三元复合材料呈现均匀、疏松的微孔结构，更进一步验证了实验制备的纳米羟基磷灰石/壳聚糖/聚己内酯三元复合支架材料具备细胞生长的环境要求，能为细胞生长提供条件，引导骨缺损部位骨组织再生。

实验制备的纳米羟基磷灰石/壳聚糖/聚己内酯三元复合支架材料具有适度的抗压强度、一定的孔隙率、适宜的降解速度和吸水率，具备细胞生长的环境要求，为骨缺损的修复研究奠定了较为坚实的基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

3D打印成型纳米羟基磷灰石/壳聚糖/聚己内酯三元复合支架材料的构建及表征

Construction and characterization of nano-hydroxyapatite/chitosan/polycaprolactone composite scaffolds by 3D printing

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