1.4.8  定量PCR检测骨形态发生蛋白2以及血管内皮生长因子mRNA的表达  提取骨组织中的总RNA并测定总RNA浓度。采用反转录试剂盒和实时定量PCR试剂盒，将总RNA反转录合成为cDNA并定量扩增。设计反应体系为20 μL，扩增条件为：预变性95 ℃，1 min；变性95 ℃，5 s；退火/延伸58 ℃，15 s。循环数40次。采用2^-??Ct公式计算骨形态发生蛋白2 mRNA和血管内皮生长因子mRNA的相对表达水平。引物序列见表1。

2.2  神经生长因子对胫骨骨折模型大鼠骨折愈合及骨痂量的影响  神经生长因子组骨愈合速度明显快于模型组。如图1所示，干预2周时，神经生长因子组大鼠骨折断端边缘模糊，可见骨痂，轮廓清晰，模型组可见少量骨痂形成；干预4周时，神经生长因子组大鼠骨折线模糊，骨痂仍较多，模型组骨折线清晰可见，外骨痂存在；干预6周时，神经生长因子组完全愈合，外骨痂不明显，髓腔再通，模型组骨折线消失，可见外骨痂较4周时减少，但是未通髓腔。干预2周和4周时，神经生长因子组骨痂量显著多于模型组(P < 0.05)；干预6周时，神经生长因子组骨折塑形完成，髓腔再通，其骨痂量显著少于模型组(P < 0.05)，见表2。

2.2  神经生长因子对胫骨骨折模型大鼠骨折愈合及骨痂量的影响  神经生长因子组骨愈合速度明显快于模型组。如图1所示，干预2周时，神经生长因子组大鼠骨折断端边缘模糊，可见骨痂，轮廓清晰，模型组可见少量骨痂形成；干预4周时，神经生长因子组大鼠骨折线模糊，骨痂仍较多，模型组骨折线清晰可见，外骨痂存在；干预6周时，神经生长因子组完全愈合，外骨痂不明显，髓腔再通，模型组骨折线消失，可见外骨痂较4周时减少，但是未通髓腔。干预2周和4周时，神经生长因子组骨痂量显著多于模型组(P < 0.05)；干预6周时，神经生长因子组骨折塑形完成，髓腔再通，其骨痂量显著少于模型组(P < 0.05)，见表2。

2.3  神经生长因子对胫骨骨折模型大鼠血清碱性磷酸酶水平的影响  如表3所示，干预后2和4周时，神经生长因子组大鼠血清碱性磷酸酶水平显著高于模型组(P < 0. 05)；干预后6周时，神经生长因子组和模型组大鼠血清碱性磷酸酶浓度接近(P > 0.05)。

2.4  神经生长因子对胫骨骨折模型胫骨形态的影响  苏木精-伊红染色结果显示，干预2周时，神经生长因子组中纤维骨痂中可见较多新生骨小梁，呈条索状，模型组可见少量纤维骨痂和软骨痂形成；干预4周时，神经生长因子组可见骨小梁变粗大、致密，排列成栅栏状，可见连接成片的骨小梁，骨小梁间间隙缩小，骨缺损处基本被新生骨填满，模型组可见纤维骨痂和软骨痂形成，但纤维骨痂中骨小梁明显少于神经生长因子组，且间隙宽结构疏松，血管稀少；干预6周时，神经生长因子组骨折愈合明显，见图2。

2.5  神经生长因子对胫骨骨折模型大鼠胫骨组织中骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子表达的影响  免疫组化结果显示，骨形态发生蛋白2阳性表达呈棕褐色，主要见于骨小梁的边缘和成骨细胞及其周围，而在纤维骨痂中表达较少；血管内皮生长因子阳性表达呈棕褐色，主要见于血管内皮细胞、成骨细胞和成软骨细胞周围，少量见于成纤维细胞周围。干预2周和4周时，神经生长因子组胫骨组织中骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子表达水平显著多于模型组(P < 0.05)；干预6周时，神经生长因子组和模型组骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子表达水平接近(P > 0.05)，见图3，表4。

2.5  神经生长因子对胫骨骨折模型大鼠胫骨组织中骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子表达的影响  免疫组化结果显示，骨形态发生蛋白2阳性表达呈棕褐色，主要见于骨小梁的边缘和成骨细胞及其周围，而在纤维骨痂中表达较少；血管内皮生长因子阳性表达呈棕褐色，主要见于血管内皮细胞、成骨细胞和成软骨细胞周围，少量见于成纤维细胞周围。干预2周和4周时，神经生长因子组胫骨组织中骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子表达水平显著多于模型组(P < 0.05)；干预6周时，神经生长因子组和模型组骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子表达水平接近(P > 0.05)，见图3，表4。

2.6  神经生长因子对胫骨骨折模型大鼠胫骨组织中骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子mRNA表达水平的影响    如表5所示，干预2周和4周时，神经生长因子组胫骨组织中骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子mRNA表达水平均显著高于模型组(P < 0.05)；干预6周时，神经生长因子组和模型组胫骨组织中骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子 mRNA表达水平接近(P > 0.05)。

骨折愈合是一种十分复杂的多阶段生理过程，由多种细胞协调参与。骨折断端损伤及坏死的骨细胞和成骨细胞可向骨折周围释放内源性生长因子，刺激间充质细胞向骨折端聚集，同时损伤部位局部血管增生以及新生血管形成，可促进间充质细胞向成骨细胞转化，从而实现骨折愈    合^[1-2]。近年研究发现，在骨折愈合过程中，神经因素发挥着重要的作用^[3-4]。有关神经因素对于骨折愈合过程的影响逐渐被重视和深入研究，出现了“神经-内分泌-骨”的轴线调节理论^[5]。神经生长因子是一种能够促进细胞生长的生物活性复合蛋白。临床研究发现存在脑损伤的骨折患者可表现出成骨加速，而此类损伤骨折愈合过程中神经生长因子表达是增多的^[6-7]。有研究表明，神经生长因子可通过刺激骨细胞增殖分化，从而刺激成骨细胞活性，加速骨折愈合；在正常骨组织和骨痂中均有神经生长因子及其受体的表达^[8-9]。研究表明，全身应用神经生长因子基本不良反应^[10]。然而，神经生长因子在促进骨折愈合过程中所发挥的作用机制尚不明确。目前，全身应用外源性神经生长因子对骨折的促进作用及治疗骨折后骨折愈合相关因子，如骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子的表达变化情况怎样，其影响规律如何尚缺乏相关研究。

此次实验采用大鼠胫骨骨折模型作为研究对象，通过全身应用神经生长因子，观察大鼠胫骨骨折愈合情况，并观察不同时期骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子蛋白以及mRNA的表达变化规律，以探索神经生长因子治疗骨折的分子机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  随机对照动物实验。

1.2  时间及地点 于2018年6月至2019年6月在福建医科大学进行。

1.3  材料  SPF级SD雄性大鼠72只，鼠龄1个月，体质量(220±20)g，购自上海斯莱克实验动物公司，许可证号：SCXK(沪)2014-0003。上述大鼠饲养于福建医科大学实验动物中心，每日给予正常饲料和无菌过滤水喂养，12 h光照和黑暗循环，常规室温和湿度。实验过程中全部按照《关于善待实验动物的指导性意见》的要求对动物进行处置。实验于2018-05-30经福建医科大学实验动物伦理委员会批准，批准号：FJYKDX-2018-035。

实验用主要试剂及仪器：兔抗鼠骨形态发生蛋白2多克隆抗体、兔抗鼠血管内皮生长因子多克隆抗体购自武汉博士德公司；注射用鼠神经生长因子(规格18 μg)购自厦门北大之路公司；水合氯醛购自武汉谷歌公司；碱性磷酸酶试剂盒购自深圳迈瑞公司；免疫组化试剂盒购自福州迈新公司；AceQ qPCR SYBR Green Master Mix试剂盒、HiScript II Q RT SμperMix for qPCR(+gDNA wiper)试剂盒购自南京诺唯赞公司；光学显微镜购自德国Leica公司；荧光定量PCR仪购自美国ABI公司；全自动生化分析仪购自贝克曼库尔特；光学显微镜购自德国莱卡，克氏针购自石家庄市达邦医疗器材厂(医疗器械许可证号：冀石食药监械(准)字2013第1100057号)。

1.4  方法

1.4.1  大鼠右胫骨干中段骨折模型制备  称量大鼠体质量，采用体积分数10%水合氯醛腹腔注射麻醉固定大鼠，于右小腿中上1/3偏内侧切口，长约2 cm，逐层切开皮肤、皮下和筋膜，剥离骨膜，横向拨开胫骨前肌，充分暴露右胫骨中上段，用骨刀横断胫骨，使断端完全分离，建立胫骨骨折模型^[11]；通过胫骨近端穿入一枚1.0 mm克氏针至胫骨髓腔远端穿出，予以骨折复位固定后，折返打向骨折近端，造模成功。以生理盐水冲洗，逐层缝合切口。术后大鼠分笼饲养，定期进行切口换药。

1.4.2  动物分组及干预  采用随机数表法将72只SD大鼠随机分为神经生长因子组和模型组，每组36只；每组大鼠再以随机数表法分为3个亚组，即2，4，6周组，每个亚组12只大鼠。造模后第1天，模型组经小腿三头肌注射1 mL生理盐水，2次/d；神经生长因子组经小腿三头肌注射注射用鼠神经生长因子200 ng/kg，2次/d^[12]。

1.4.3  数字化X射线摄像仪成像  分别于干预后第2，4，6周时，麻醉大鼠，行胫骨X射线成像。干预后第2周先取出克氏针，然后再行X射线成像，以观察大鼠胫骨骨折骨痂的连续性及骨折愈合情况。采用PACS系统(EBM Technologies)分析，图像分析由2位不参与造模分组的放射科医生评价。骨痂体积测量采用Perkins法^[13]，骨痂体积= 2π×胫骨干半径×(骨痂半径-胫骨干半径)×骨痂长度。

1.4.4  取材  大鼠行X射线观察后，采用脊柱脱臼法处死，采集腹主动脉血后，每组6只大鼠直接取出右胫骨骨折周围骨组织，不用脱钙，生理盐水冲洗后放入EP管中，-80 ℃保存备用，用于Western blot检测和定量PCR检测；剩余6只大鼠采用灌注固定取材，即剪开大鼠胸腔，暴露心脏，自左心耳先灌注40 g/L多聚甲醛400 mL，然后取出右胫骨骨折周围骨组织，浸泡于40 g/L多聚甲醛溶液中进行固定并脱钙，用于免疫组化检测。

1.4.5  血清碱性磷酸酶浓度的检测  取大鼠腹主动脉血 2 mL，保存于抗凝管中，静置40 min，离心20 min，分离血清。采用全自动生化分析仪检测血清中碱性磷酸酶浓度。

1.4.6  苏木精-伊红染色  取出胫骨石蜡切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，流水反复冲洗；苏木精染色10 min，流水冲洗，细胞核复色；体积分数0.5%-1.0%盐酸乙醇分化10 s，流水冲洗30 min，返蓝；显微镜下观察细胞核是否着色，蒸馏水洗涤洗3-5 s；体积分数0.5%伊红染色2.0-3.0 min，流水冲洗；脱水、透明、封固，光学显微镜下观察。

1.4.7  免疫组化检测骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子表达  取骨组织切片切片，经过脱蜡、水化后冲洗，胰酶抗原修复30 min；洗涤后以体积分数3% H₂O₂阻断内源性过氧化物酶孵育20 min；洗涤后免疫染色封闭液室温孵育60 min；洗涤后滴加辣根酶标兔抗鼠骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子抗体，4 ℃冰箱中孵育过夜；羊抗兔二抗室温孵育40 min，PBS洗涤，DAB显色；苏木精复染2.0-3.0 min，脱水、透明、封固，光学显微镜观察并由2位医生各自独立进行测定并采集图片，随机选取5个视野进行观察拍照，利用 Image-Pro Plus 6.0图像分析软件(美国Bio公司)对免疫组化结果进行半定量分析。

1.4.8  定量PCR检测骨形态发生蛋白2以及血管内皮生长因子mRNA的表达  提取骨组织中的总RNA并测定总RNA浓度。采用反转录试剂盒和实时定量PCR试剂盒，将总RNA反转录合成为cDNA并定量扩增。设计反应体系为20 μL，扩增条件为：预变性95 ℃，1 min；变性95 ℃，5 s；退火/延伸58 ℃，15 s。循环数40次。采用2^-∆∆Ct公式计算骨形态发生蛋白2 mRNA和血管内皮生长因子mRNA的相对表达水平。引物序列见表1。

1.5  主要观察指标  骨痂体积、血清碱性磷酸酶水平、骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子及其mRNA表达。

1.6  统计学分析  实验数据采用x(_)±s表示，统计学方法SPSS 20.0软件(美国IBM公司)分析，采用方差分析和配对t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

随着中国交通、建筑等行业的发展，高能量、复杂骨折呈逐年增加的态势，怎样有效促进骨折的早期愈合意义尤为重大。骨折愈合的影响因素错综复杂，细胞因子在骨折愈合过程中发挥了至关重要的作用。既往研究已经发现，合并中枢神经系统损伤(脑外伤或脊髓损伤)的患者骨折愈合的速度显著加快；合并中枢神经损伤患者相关的细胞因子(如神经生长因子)含量变化对骨折愈合的影响受到许多学者关注和研究^[14-15]。有研究发现，在对于伴周围神经损伤的骨折患者，在失神经状态下全身应用神经生长因子对肢体骨折的愈合具有促进作用^[16]。亦有研究通过骨折端局部注射神经生长因子后，骨折端骨痂生成明显增多，经生物力学检测证实局部骨痂的刚度和强度亦明显增加^[17-18]。国内动物实验也证实了神经生长因子可以刺激胰岛素样生长因子的分泌，间接影响骨细胞增值分化，从而对骨折的修复起着促进作用^[19]。其中，刺激成骨细胞的活性，从而促进骨细胞的增殖及分化，是神经生长因子促进骨折愈合的重要途径。在这一过程中，与全身及局部骨愈合相关因子的表达变化有着密切关系，如骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子的表达，神经生长因子与二者究竟有怎样的关系及规律目前尚缺乏相关报道。

作者采用骨刀是大鼠胫骨中断骨折的方法，该方法是制备骨折模型较常用的方法，方法简单，可以使断端完全分离且可以使骨折模型具有一定程度标准化和统一性^[20]，可制备统一的胫骨骨折模型。同时，实验选择雄性大鼠是为了避免雌激素对骨量和骨重建的影响。大鼠胫骨骨折后，大鼠仍会活动，若骨折持续对位不良，容易出现骨折不愈合的情况而影响实验结果，因此需要对骨折进行一定的固定。克氏针固定具有简单、安全的特点，并能对骨折提供一定的稳定性，且易于拔出，不会在后期X射线观察时对骨痂量计算和骨折线观察产生太大的影响。同时4周是骨折愈合最强的时候，也是各种有利于骨折愈合的物质表达高峰的时候^[21]，故选择4周。

此次实验结果显示，在全身应用神经生长因子第2，4周，胫骨干骨折处骨痂量有明显变化，经神经生长因子治疗后骨痂量相比模型组显著增多，说明应用神经生长因子可以促进早期骨折处骨痂生长。同时，各时间点检测血清碱性磷酸酶含量结果显示，干预2周和4周，神经生长因子组血清碱性磷酸酶浓度明显高于模型组。碱性磷酸酶的活性表达可以代表成骨细胞分化特征。在机体内，碱性磷酸酶在成骨过程中催化磷酸酯水解出磷酸方面发挥了重要的生理功能，它可水解无机焦磷酸盐，阻止其抑制骨盐形成，从而促进成骨。成骨细胞活跃期可分泌碱性磷酸酶入血，血清碱性磷酸酶浓度增加，因此，血清碱性磷酸酶可作为骨修复和重建的标志，目前已作为科学研究中观察骨折愈合情况的重要研究指标^[22]。此次实验中，经全身应用神经生长因子后血清碱性磷酸酶水平在干预2周和4周明显高于模型组，与既往研究结果一致^[23]。所以，作者推测在全身应用神经生长因子后，可以直接影响成骨相关的碱性磷酸酶活性变化，从而促进骨折愈合。

既往研究证实，骨形态发生蛋白2是惟一可以独立诱导和促进间充质细胞向成骨细胞分化的细胞因子，它能够诱导和调节间充质干细胞的迁移、增殖和分化，是最重要的成骨相关的细胞因子^[24-25]。神经生长因子是否可影响骨折愈合期中骨形态发生蛋白2的表达尚不明确。免疫组化检测和定量PCR检测结果显示，干预2周和4周时，神经生长因子组与模型组的骨形态发生蛋白2蛋白和mRNA表达水平差异有显著性意义；而在干预6周时，则2组的骨形态发生蛋白2蛋白和mRNA表达水平接近。这一结果与既往研究结果一致^[22]，说明全身应用神经生长因子后骨形态发生蛋白2受到直接影响，从而促进骨折愈合。而与前期研究结果不同的是，此次实验干预6周时，神经生长因子组骨形态发生蛋白2蛋白以及 mRNA表达水平略低于模型组，这可能是由于此时神经生长因子组成骨构建已经基本完成。因此，可以提示全身应用神经生长因子可以加速骨重建，从而促进骨折的早期愈合。血管内皮生长因子是一种强有力的血管生成调节因子，对促进血管生成和内皮细胞增殖具有重要作用。在骨折愈合过程中，血管内皮生长因子也发挥了极其重要的作用。既往研究证实，血管内皮生长因子能通过作用于细胞表面受体，促进血管内皮细胞增殖和血管生成，为骨折的愈合提供很好的血管环境^[26-27]。有学者研究证实，全身应用神经生长因子，造模后不同时间点局部血管内皮生长因子表达含量均较未应用神经生长因子高，证实了全身应用神经生长因子可以促进局部血管内皮生长因子的表达，从而促进骨质愈合^[28]。作者应用免疫组化和定量PCR技术检测血管内皮生长因子蛋白以及mRNA表达水平，结果显示，干预2周和4周时，神经生长因子组骨组织中血管内皮生长因子蛋白和mRNA表达水平明显高于模型组，而干预6周时则2组血管内皮生长因子蛋白和mRNA表达水平。这提示全身应用神经生长因子后，大鼠骨折愈合所需的血管内皮生长因子蛋白以及mRNA表达更早，并且下降缓慢。这些研究结果说明，神经生长因子可以通过影响骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子的表达协同促进骨折愈合。

综上所述，全身应用外源性神经生长因子能够促进骨折早期愈合；同时，在骨折愈合过程中对骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子的表达也起着积极的调节作用。神经生长因子通过刺激骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子 mRNA转录以及相关蛋白的翻译，促进骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子分泌，并在骨折愈合的不同时期这种促进作用表现出一定的规律，进而诱导成骨细胞分化增殖，促进骨折骨形成及骨愈合，这可能是神经生长因子促进骨折愈合的重要途径之一。关于神经生长因子如何促进骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子分泌从而促进骨折愈合，相关领域有待进一步分子生物学方面的研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：

神经生长因子：神经生长因子家族包括神经生长因子、脑源性神经营养因子、神经营养素3、神经营养素4/5、神经营养素6和神经营养素7等，主要为前4种。神经生长因子为神经生长因子家族中最主要的一类，在组织中主要以前体的形式存在，在颌下腺中加工形成成熟的神经生长因子，能促进中枢和外周神经元的生长、发育、分化、成熟，维持神经系统的正常功能，加快神经系统损伤后的修复。神经生长因子广泛分布于机体各组织器官中(包括脑)，在靶组织中的浓度与交感神经和感觉神经在靶区分支的密度和mRNA的含量有关。

骨折愈合：是一个复杂而连续的过程，从组织学和细胞学的变化，通常将其分为3个阶段，但三者之间又不可截然分开，而是互相交织逐渐演进，包括血肿炎症机化期、原始骨痂形成期、骨板形成塑形期。

神经生长因子的生物学作用：①营养神经：神经生长因子及其受体广泛分布于中枢神经系统，由海马和脑皮质产生的神经生长因子可通过胆碱能神经逆行运输至前脑基底核，维持胆碱能神经元的存活和功能；②保护神经：当神经生长因子的效应神经元受到损伤时，神经元将发生一系列的病理改变。神经生长因子可抑制上述神经损伤的作用；③促进神经再生长：在切断轴突后给予神经生长因子将减少某些神经元的变性与死亡，无疑这将有助于提高轴突再生的可能性。同时它还影响轴突再生开始的时间和参与再生的神经元数目以及再生神经的质量和速度；④其他作用：调节免疫系统功能，抑制某些肿瘤的有丝分裂，促进促进创口愈合等。

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